利用液相色谱串联质谱测定血红蛋白浓度的方法
【专利摘要】本发明涉及仪器分析【技术领域】，具体涉及利用液相色谱串联质谱测定血红蛋白浓度的方法。该方法包括以下步骤：A、取血红蛋白样品进行分解，得珠蛋白多肽链的裂解片段；B、对所述裂解片段进行分离，以分离获得的一条或多条裂解片段为标志肽段，利用质谱进行定量测试；C、设立标准血红蛋白浓度梯度，根据现有血红蛋白浓度测定法，建立质谱响应强度与血红蛋白浓度的线性回归方程，将样品质谱响应强度值带入方程计算，即得样品的血红蛋白浓度。该方法由于不直接测定完整的血红蛋白分子，故本法在血液标本不做任何前期处理且保存时间较长的情况下，依然能够准确测定标本采集时的血红蛋白浓度。
【专利说明】利用液相色谱串联质谱测定血红蛋白浓度的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及仪器分析【技术领域】，具体涉及利用液相色谱和质谱测定血液中血红蛋白浓度的方法，尤其能测定微量且经较长时间保存的血液标本血红蛋白的浓度。
【背景技术】
[0002]血红蛋白作为红细胞内的一种机能蛋白，氧气结合在铁原子上，被血液运输。血红蛋白在生物体内，起传输氧气、分解H2O2、传递电子等与氧和能量代谢有关的重要活动。由于临床上白血病、贫血及心脏病等常伴有血红蛋白异常，因此，人血清中血红蛋白含量的测定是评价人体健康水平的一个重要指标。
[0003]已知,血红蛋白(Hemoglobin,Hb)由一个珠蛋白和四个血红素(又称亚铁原卩卜啉)组成，每个血红素又由四个吡咯类亚基组成一个环，环中心为一个亚铁离子。每个珠蛋白则有四条多肽链组成，珠蛋白的四条肽链各不相同。成年人可由2条α链和2条β链构成，称HbA，胎儿由2条α链2条Y链构成，称HbF，出生后不久由HbA取代。珠蛋白的每条多肽链与一个血红素连接，构成血红蛋白的一个单体，或者说亚单位(即亚基)。
[0004]基于此，人们建立了大量分析血红蛋白浓度的方法，包括光度法、荧光法、电化学法等。具体如:氰化高铁法(HiCN法)，其原理为:血红蛋白在高铁氰化钾和氰化钾的作用下，生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白(红色)，其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比；氰化高铁血红蛋白在540nm波长下，毫克分子消光系数为44，据此，用分光光度法测其吸光度，从而得出血红蛋白的定量测定。除此以外，还有如氧合血红蛋白法、各型血红蛋白仪测定等。
[0005]在遗传代谢病筛查、贫血以及营养改善状况等的普查中，往往涉及多个样本的采集。出于成本和可行性的考虑，对这些样本的测试难以及时进行，通常需累积一定样本后，到特定的地点集中进行测试。其间，由于样本的长期保存、长距离运输以及环境温湿度的影响，到测试时血红蛋白已经遭到破坏。由于上述已有方法均是基于血红蛋白结构完整情况下的生物活性或理化性质而进行的检测，当血液标本保持时间过长，可能发生溶血或血红蛋白裂解时，测定的结果就难以反映标本采集时血红蛋白的真实浓度，且实验操作繁琐，测试效率低。
[0006]液质联用(LC-MS)又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便，因此广泛应用于药物分析、食品分析和环境分析等许多领域。
[0007]串联三重四级杆质谱仪对于液相色谱一质谱/质谱应用来说是权威的分析工具，分析者可以采用最少的样品制备步骤，对少量化合物进行高通量的定量分析。该质谱仪通过连续放置多个分析器来实现空间串联的多级质谱分析。每个分析器有以下单独的作用:第一个四极杆(Ql)根据设定的质荷比范围扫描和选择所需的离子；第二个四极杆(Q2)，也称碰撞池，用于聚集和传送离子，在所选择离子的飞行途中，引入碰撞气体，例如氮气等；第三个四极杆(Q3)用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。在母离子扫描中，Ql测定母离子，Q2碰撞池产生碎片离子，Q3测定某个特定的碎片离子，因此可在非常复杂的混合物中监测某种特定的分子。
[0008]基于上述原因和现有技术，本发明探索了血红蛋白浓度测定的新方法。
【发明内容】
[0009]有鉴于此，本发明提供一种基于血红蛋白的裂解片段作为标志肽段在血红蛋白浓度测定中的应用。由于采用血红蛋白的裂解片段作为标志肽段进行测试，故不要求血红蛋白的构象完整，能测定微量且经较长时间保存的血液标本的血红蛋白浓度。
[0010]进一步，所述应用为采用质谱测定血红蛋白浓度中的应用。
[0011]进一步，所述应用为采用液相色谱串联质谱测定血红蛋白浓度中的应用。
[0012]进一步，所述标志肽段为SEQ ID NO:1?11中的一条或多条。
[0013]具体地，本发明提供一种测定血红蛋白浓度的方法，能测定微量且经较长时间保存的血液标本的血红蛋白浓度。
[0014]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0015]一种测定血红蛋白浓度的方法，包括以下步骤:
[0016]A、取血红蛋白样品进行分解，得珠蛋白多肽链的裂解片段；
[0017]B、对所述裂解片段进行分离，以分离获得的一条或多条裂解片段为标志肽段，利用质谱进行定量测试；
[0018]C、设立已知浓度的血红蛋白浓度梯度，按照本方法进行测定，建立质谱响应强度与血红蛋白浓度的线性回归方程，将待测样品质谱响应强度值带入方程计算，即得样品的血红蛋白浓度。
[0019]步骤A对血红蛋白的分解可采用酶选择性的进行切割，如胰蛋白酶能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，特异性的获得赖氨酸或精氨酸结尾的肽链片段。
[0020]步骤B所述对裂解片段的分离，可采用色谱分离技术进行，如液相色谱、薄层色谱等，或者采用电泳技术进行分离。分离后，选取珠蛋白多肽链裂解后产生的特征性多肽片段作为标志肽段，利用串联质谱仪测定标志肽段的浓度，再通过血红蛋白分子和标志肽段的摩尔比关系计算血红蛋白的浓度。进一步，所述标志肽段为SEQ ID NO:1?11中的一条或多条。所述SEQ ID NO:1?11所示的氨基酸序列为珠蛋白α链的裂解片段，由于所有血红蛋白分子均含有两条α链，故优选其裂解片段作为标志肽段。
[0021]进一步，由于目前液相色谱-质谱联用技术的进步，优选液相色谱串联质谱技术，简单快速的即完成裂解片段的分离和定量测试。优选地，所述液相色谱串联质谱进行测试时，设置的主要参数如下:
[0022]液相色谱自动进样器参数:Rinsing Volume (冲洗体积):200ul, NeedleStroke (推针行程):50mm, Rinsing Speed (冲洗流度):35ul/sec, Sampling Speed (进样流速):Purge Time5ul/sec,(排气时间):25min, Rinse Dip Time (浸润时间):3sec,Rinse Mode(冲洗模式):Before and after, Cooler Temperature (冷却温度):15°C,Control Vial Needle Stroke (控制瓶推针行程):52mm;
[0023]液相色谱采样时间程序:0.1Os时流速为0.25ml/min,0.1ls时流速为0.020ml/min, 0.40s时流速为0.085ml/min, 0.45s时流速为0.60ml/min, 0.55s时停止；液相色谱流速为0.15ml/min ;压力允许范围为O~15Mpa ；
[0024]质谱仪参数:气帘气:25MPa，碰撞气:5MPa，喷雾电压:5500V，离子化温度:350°C，雾化气:30MPa，加热辅助气:40MPa，界面加热器:on，扫描模式-Positive。
[0025]这些参数的设置可使血红蛋白的裂解片段很好的分离，并使进入质谱后获得良好的响应值，可选择性的对标志肽段进行定量分析。相关参数的设置并不限于此，根据获得的不同裂解片段，以及选取的标志肽段的不同，可相应进行液相色谱和质谱仪参数的调整。
[0026]步骤C中关于回归方程的建立，如:不同浓度标志肽段的质谱响应强度积分值同标志肽段浓度线性相关，此可转换为肽段的浓度值，进一步计算得到样本中血红蛋白的浓度。血红蛋白浓度已有浓度的确定，可采用氰化高铁血红蛋白(HiCN)法、氧合血红蛋白法、各型血红蛋白仪测定方法等进行。
[0027]在质谱进行测试时，可采用质谱的多重反应监测(MRM)模式，对一个或多个标志肽段及其多个母离子/子离子组合对进行分析。进一步，优选两个标志肽段，定量分析每个标志肽段的一对母离子/子离子组合对；或者选择一个标志肽段，定量分析该标志肽段的两对母离子/子离子组合对。每个母离子/子离子组合对可相应建立一个回归方程，两个回归方程计算的结果可相互印证。
[0028]进一步，选择SEQ ID NO:1所示的序列为标志肽段，定量分析其729.4/262.lm/z和729.4/430.2m/z的两对母离子/子离子组合对。当选用这两对母离子/子离子组合对时，优选的MRM扫描参数见表1:
[0029]表1 α珠蛋白链Tl (729.4m/z)标志肽段MRM扫描参数
【权利要求】
1.一种测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤: A、取血红蛋白样品进行 分解，得珠蛋白多肽链的裂解片段； B、对所述裂解片段进行分离，以分离获得的一条或多条裂解片段为标志肽段，利用质谱进行定量测试； C、设立已知浓度的血红蛋白浓度梯度，按照本方法进行测定，建立质谱响应强度与血红蛋白浓度的线性回归方程，将待测样品质谱响应强度值带入方程计算，即得样品的血红蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于:所述标志肽段为SEQID NO:1~11中的一条或多条。
3.根据权利要求1所述的测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于:所述步骤B采用液相色谱串联质谱完成裂解片段的分离和定量测试。
4.根据权利要求3所述的测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于:所述液相色谱串联质谱进行测试时，设置的主要参数如下: 液相色谱自动进样器参数:冲洗体积:200ul，推针行程:50mm，冲洗流度:35ul/sec，进样流速:5ul/sec,排气时间:25min,浸润时间:3sec,冲洗模式:Before and after,冷却温度:15 °C，控制瓶推针行程:52mm ； 液相色谱采样时间程序:0.1Os时流速为0.25ml/min，0.1ls时流速为0.020ml/min,0.40s时流速为0.085ml/min,0.45s时流速为0.60ml/min,0.55s时停止；液相色谱流速为0.15ml/min ;压力允许范围为O~15Mpa ； 质谱仪参数:气帘气:25MPa，碰撞气:5MPa，喷雾电压:5500V，离子化温度:350°C，雾化气:30MPa，加热辅助气:40MPa，界面加热器:on，扫描模式:Positive。
5.根据权利要求1至4任一项所述的测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于:所述步骤B中，采用质谱的多重反应监测模式，选择两个标志肽段，定量分析每个标志肽段的一对母离子/子离子组合对；或者选择一个标志肽段，定量分析该标志肽段的两对母离子/子离子组合对。
6.根据权利要求5所述的测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于:所述标志肽段的序列如SEQ ID NO:1所示，定量分析该标志肽段729.4/262.lm/z和729.4/430.2m/z的两对母离子/子离子组合对。
7.根据权利要求1至4任一项所述的测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于:所述血红蛋白样品为干血滤纸片标本。
8.利用血红蛋白浓度测定装置测定血红蛋白浓度的方法，其特征在于，所述测定装置为液相色谱仪串联的三重四级杆质谱仪，包括以下测定步骤:用酶消化血红蛋白，得珠蛋白多肽链的裂解片段；用液相色谱仪串联的三重四级杆质谱仪对裂解片段进行分离和定量分析，采用质谱的多重反应监测模式，以珠蛋白α链的裂解片段为标志肽段，选择两个标志肽段，定量分析每个标志肽段的一对母离子/子离子组合对；或者选择一个标志肽段，定量分析该标志肽段的两对母离子/子离子组合对；设立已知浓度的血红蛋白浓度梯度，按照本方法进行测定，建立质谱响应强度与血红蛋白浓度的线性回归方程，将样品质谱响应强度值带入方程计算，即得样品的血红蛋白浓度。
9.基于血红蛋白的裂解片段作为标志肽段在血红蛋白浓度测定中的应用。
10.根据权 利要求9所述的应用，其特征在于:所述标志肽段为SEQ ID NO:1~11中的一条或多条。
【文档编号】G01N30/88GK103954717SQ201410174460
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】邹琳, 余朝文, 张娟, 袁召建, 苗静琨, 刘浩, 万科星, 刘珊 申请人:重庆医科大学附属儿童医院