一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色检测方法
【专利摘要】本发明属于环境监测【技术领域】，涉及一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色传感检测方法。向0.05～10mM?PNC中加入1～50mg/mL的EDC和1～50mg/mL的NHS，反应5～90min，与1～100μg/L的微囊藻毒素抗体混合，10～50℃震荡1～24h，静置1～24h。用截留分子量为30K纳滤膜进行分离，加入不大于10μg/L的微囊藻毒素，30～50℃震荡0.5～12h，用截留分子量为50K的纳滤膜对产物进行分离，加入0.01～10mg/mL显色剂1～60min，加入0.1～10.0M终止液。比传统酶检测方法成本低，稳定性、实用性强。
【专利说明】—种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境监测【技术领域】，涉及一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色传感检测方法。
【背景技术】
[0002]微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一类由产毒水华蓝藻分泌的次级代谢物质，具有强烈的肝毒性。其中，毒性最大的Microcystin-LR (MC-LR)对小白鼠的LD5tl值仅为43 μ g/kg,低于剧毒物质氰化钾。如今，水体富营养化程度加剧,水华频发,饮用水源水和自来水厂出水中均有微囊藻毒素检出，其对水体环境和人群健康造成严重威胁，已成为全球关注的重大环境问题之一。由于其急性毒性强，世界卫生组织(WHO)规定饮用水中微囊藻毒素的标准仅为I μ g/L。因此，发展灵敏、快速、高效、实时的检测方法对监测环境中的微囊藻毒素具有重要意义。
[0003]传统的微囊藻毒素检测方法有仪器检测法，生物法/生化法等，由于其固有的缺陷已难以应对目前的环境监测需求。例如，高效液相色谱法耗时、费力、成本高；全细胞法灵敏度低、特异性差；酶联免疫吸附测定虽然具有较高的灵敏度和选择性，但操作过程复杂，体系对极端环境的适应性差，阻碍了该法的推广使用。近年来，无机纳米材料仿生酶，包括仿生过氧化酶、仿生氧化酶等，可在分子层面上模仿天然酶，不仅拥有接近或高于天然酶的催化性能，且相较于天然酶更稳定，实用性更强，更加经济易于生产，已被广泛运用于传感分析检测中(Chemical Communications, 2011, 47 (23), 6695-6697 ；ACS ΝΑΝΟ, 2012，6(4)，3142-3151)。目前，人们也已利用仿生酶材料成功建立了一些针对藻毒素检测的传感平台(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2013, 103, 38-44 ；Science, 2010, 330 (6001)，188-189)，但这些方法均基于仿生过氧化酶的催化性能，即必须在反应体系中加入一定量的H2O2，才能实现催化过程的顺利进行。由于H2O2不仅易降解，在长期存储过程中易失效，而且其强氧化性易造成生物底物组织结构破坏，影响了实验效率与检测结果。
[0004]纳米二氧化铈，基于Ce3+与Ce4+的相互转化作用而具有仿生氧化酶的催化性质，从而可以快速催化氧化多种有机底物，而无需额外添加任何氧化剂。如今纳米二氧化铈仿生氧化酶材料由于其优异的性质已被用于传感分析中(AngewandteChemie-1nternationalEdition, 2009, 48(13), 2308-2312 ；Biosensors and Bioelectronics, 2014, 52, 397-402)。本发明将纳米二氧化铈仿生氧化酶材料应用于水中微囊藻毒素的检测，建立一种微囊藻毒素的比色分析方法，解决了传统方法繁琐耗时、成本高、实用性差等缺点，应用前景非常广泛。
【发明内容】
[0005]本发明解决了现有检测微囊藻毒素方法繁琐耗时、前处理过程复杂、成本高、实用性差等不足，提供了一种简便、快捷、经济、实用的检测水中微囊藻毒素的方法。
[0006]六水合硝酸铈和聚丙烯酸在氨水存在条件下，经搅拌，一步合成聚丙烯酸包被的纳米二氧化铈(PNC)，其仿生氧化酶的催化性能可使底物中的显色剂从常态氧化至氧化态，从而使体系吸光度值发生改变。PNC表面羧基经过活化，与微囊藻毒素抗体通过脱水缩合反应结合，形成抗体-纳米二氧化铈复合物。检测时利用纳滤膜分离去除游离的纳米二氧化铈后，与目标物分子，即微囊藻毒素发生抗原-抗体特异性结合，形成抗原-抗体-纳米二氧化铈复合物。再利用纳滤膜过滤分离去除未进行特异性结合的游离的抗体-纳米二氧化铈复合物。过滤截留的抗原-抗体-纳米二氧化铈复合物的浓度与目标物微囊藻毒素的浓度正相关，在显色剂存在条件下，复合物与显色剂发生反应产生颜色变化，并且体系吸光度值在一定范围内与微囊藻毒素的浓度正相关，从而为微囊藻毒素的定量分析提供依据。
[0007]本发明提供了一种基于PNC仿生氧化酶的微囊藻毒素的检测方法，具体步骤如下:
[0008](I)向0.05?IOmM PNC中依次加入浓度为I?50mg/mL的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和浓度为I?50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应5?90min，活化PNC表面原有的羧基官能团。
[0009](2)将步骤⑴获得的表面羧基活化的PNC与浓度为I?100 μ g/L的微囊藻毒素抗体混合，10?50°C温度下震荡I?24h，然后静置I?24h。利用截留分子量为30K纳滤膜对溶液进行分离，去除游离的PNC。向去除游离PNC后的溶液中加入浓度不大于10 μ g/L的微囊藻毒素，30?50°C温度条件下震荡0.5?12h，用截留分子量为50K的纳滤膜对产物进行分离，去除未进行特异性结合的游离抗体-PNC复合物。
[0010](3)向步骤⑵得到的产物中加入0.01?10mg/mL显色剂，反应I?60min，加入
0.1?10.0M终止液终止反应。
[0011]所述的显色剂包括四甲基联苯胺(TMB)、2，2_联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)等。
[0012]所述的终止液为硫酸、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
[0013]所述的微囊藻毒素抗体为微囊藻毒素单克隆抗体。
[0014]本发明的有益效果:
[0015](I)检测下限可达0.45 μ g/L,符合WHO规定的饮用水中微囊藻毒素的标准I μ g/L0
[0016](2)纳米二氧化铈仿生氧化酶的制备采用磁力搅拌一步合成，过程简单、快捷。
[0017](3)相较于传统天然酶检测方法，成本低，稳定性、实用性强。
[0018](4)相较于传统仿生过氧化酶传感检测方法，体系无需H2O2,过程安全且对生物分子无影响，便于运输。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明所述的检测微囊藻毒素的方法过程示意图。
[0020]图2是本发明的方法获得的检测微囊藻毒素的标准工作曲线。
[0021]图中:藝表面包被聚丙烯酸的纳米二氧化铈(PNC)；[0022]
【权利要求】
1.一种基于PNC仿生氧化酶的微囊藻毒素的检测方法，其特征在于如下步骤: (1)向0.05?IOmM PNC中依次加入浓度为I?50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和浓度为I?50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应5?90min，活化PNC表面原有的羧基官能团； (2)将步骤(I)获得的表面羧基活化的PNC与浓度为I?100μ g/L的微囊藻毒素抗体混合，10?50°C温度下震荡I?24h，然后静置I?24h ;利用截留分子量为30K纳滤膜对溶液进行分离，去除游离的PNC ；向去除游离PNC后的溶液中加入浓度不大于10 μ g/L的微囊藻毒素，30?50°C温度条件下震荡0.5?12h，再用截留分子量为50K的纳滤膜对产物进行分离，去除未进行特异性结合的游离抗体-PNC复合物； (3)向步骤(2)得到的产物中加入0.01?10mg/mL显色剂，反应I?60min后，加入0.1?10.0M终止液终止反应。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的显色剂为四甲基联苯胺或2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的终止液为硫酸或十二烷基硫酸钠。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的微囊藻毒素抗体为微囊藻毒素单克隆抗体。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的微囊藻毒素抗体为微囊藻毒素单克隆抗体。
【文档编号】G01N33/577GK103983777SQ201410191509
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】赵慧敏, 袁芳, 全燮, 陈硕 申请人:大连理工大学