甘氨酸或其代谢调节剂在提高家蚕丝产量中的应用及其方法
【专利摘要】本发明公开了甘氨酸或甘氨酸代谢调节剂1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACPC)在提高家蚕丝产量中的应用，以及通过给予幼虫期家蚕外源性的甘氨酸或ACPC来提高家蚕丝产量的方法；本发明采用基于GC-MS的代谢组学技术研究丝产量有较大差异的不同品种家蚕的血淋巴代谢物谱的变化，发现家蚕丝素蛋白的重要组成成分甘氨酸(占丝素蛋白的42.8％)与茧层率之间具有较强的相关性(相关系数为-0.892)，体外给予甘氨酸或甘氨酸代谢调节剂ACPC干预幼虫期蚕体代谢可以显著提高家蚕丝产量，由此，本发明不仅拓宽了甘氨酸或ACPC在生物领域中的应用，而且为桑蚕业提高丝产量提供了一种新方法。
【专利说明】甘氨酸或其代谢调节剂在提高家蚕丝产量中的应用及其方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及家蚕代谢组学研究结果的应用。
【背景技术】
[0002]家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目昆虫,是一种完全变态昆虫,一生经过卵、幼虫、蛹、成虫等四个形态和生理机能完全不同的发育阶段。家蚕是寡食性昆虫，以桑叶为食，是具有很高经济价值的吐丝昆虫。蚕丝作为一种天然动物蛋白，主要由丝素和丝胶构成。构成蚕丝的氨基酸种类比较集中，主要是甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。蚕丝的应用非常广泛，不仅应用于丝绸行业，还用于化妆品行业、医药行业和保健品行业等。随着商品经济的日益发展和海外贸易的逐渐扩大，社会上对蚕丝尤其是高品质蚕丝的需求量逐渐增大。虽然通过改善桑叶质量和饲育方法，以及不断的杂交和改良家蚕品种，目前家蚕的丝产量已经得到了显著提高，但依靠传统的选育方法已经很难继续提高家蚕产丝量，因此，开发其他方法提高家蚕的蚕丝生产能力迫在眉睫。
[0003]目前，家蚕基因组框架图及精细图谱绘制工作已经完成，家蚕重要组织器官的蛋白质组学研究也取得了较大的进展，而关于家蚕小分子代谢物谱的研究尚未见报道。由于小分子代谢物的研究是揭示代谢机理的重要环节，因此，将代谢组学研究技术应用到家蚕研究中，可能开发出新的提高家蚕丝产量的方法。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于采用基于色谱-质谱的代谢组学方法研究丝产量有较大差异的不同品种家蚕的血淋巴代谢物谱的变化，结合多变量和单变量的数据分析，寻找与家蚕丝产量相关的小分子代谢物，进而提供一种提高家蚕丝产量的方法。
[0005]经研究，本发明提供如下技术方案:
[0006]1.甘氨酸或甘氨酸代谢调节剂1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)在提高家蚕丝产量中的应用。
[0007]1-氨基环丙烷-1-羧酸是与N-甲基-D-天门冬氨酸受体络合物有关联的甘氨酸调节中心的选择性配体，能够调控甘氨酸的运输和结合。
[0008]2.提高家蚕丝产量的方法，是给予幼虫期家蚕外源性的甘氨酸或甘氨酸代谢调节剂1-氨基环丙烷-1-羧酸。
[0009]一种具体技术方案是从家蚕幼虫期5龄第2天至5龄第6天，每日给予家蚕外源性的甘氨酸。
[0010]更具体的，家蚕幼虫期5龄第2天给予甘氨酸100 μ g，5龄第3天和第4天各给予甘氨酸300 μ g, 5龄第5天和第6天各给予甘氨酸500 μ g。
[0011]另一种具体技术方案是从家蚕幼虫期5龄第2天至5龄第6天，每隔I日给予家蚕外源性的甘氨酸代谢调节剂1-氨基环丙烷-1-羧酸。[0012]更具体的，从家蚕幼虫期5龄第2天至5龄第6天，每隔I日给予Ing的甘氨酸代谢调节剂1_氨基环丙烧_1_羧酸。
[0013]本发明的有益效果在于:本发明采用基于GC-MS的代谢组学技术研究丝产量有较大差异的不同品种家蚕的血淋巴代谢物谱的变化，发现家蚕丝素蛋白的重要组成成分甘氨酸(占丝素蛋白的42.8% )与茧层率之间具有较强的相关性(相关系数为-0.892)，体外给予甘氨酸或甘氨酸代谢调节剂ACC干预幼虫期蚕体代谢可以显著提高家蚕丝产量。由此，本发明不仅拓宽了甘氨酸或ACC在生物领域中的应用，而且为桑蚕业提高丝产量提供了一种新方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0015]图1为裸蛹、大造和21-872三个品种家蚕的主成分分析(A)以及甘氨酸在三种家蚕中量的关系(B)。
[0016]图2为分别敲除fib-H基因㈧和摘除丝腺⑶后甘氨酸在家蚕体内量的变化。
[0017]图3为分别给予甘氨酸(A)和1-氨基环丙烷-1-羧酸(B)后对家蚕丝产量和茧
层率的影响。
【具体实施方式】
[0018]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
[0019]一、代谢组学方法筛选与家蚕丝产量相关的代谢物
[0020]选取丝产量有较大差异的三个品种家蚕:裸蛹(几乎不产丝品种)、大造和21-872 (高产丝量品种)，分别收集上述家蚕幼虫期5龄第6天(家蚕丝蛋白大量合成时期)的血淋巴样品，采用基于GC-MS的代谢组学技术分析血淋巴代谢物谱。具体方法如下:
[0021](I)样品前处理:取80 μ L血淋巴，用320 μ L甲醇(含十三烷酸内标)沉淀蛋白，润旋2min, 13000rpm离心弃上清,蛋白沉淀冷冻干燥后用80 μ L20mg/mL甲氧胺的卩比唳溶液复溶，涡旋混匀并超声15min，37°C肟化1.5h，再加入65 μ L N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，37°C烷基化lh。
[0022](2)GC-MS分析:将步骤(I)处理后的样品进行GC-MS分析。色谱条件:DB_5MS毛细管柱(0.25 μ m, 0.25mmX 30m),以氦气为载气,流速恒定为1.19mL.mirT1,进样口温度为300°C，进样体积为lyL，分流比为10:1 ;程序升温程序:起始温度70°C维持3min，然后以50C /min 升至 170°C，再以 4°C /min 升至 234°C，再以 5°C /min 升至 270°C，最后以 10°C /min升至300°C并维持5min。质谱条件:采用电子轰击电离源(EI),电离电压为70eV,离子源温度为250°C，溶剂切割时间为7min，电离源温度为230°C，质量扫描范围为33-600m/z。
[0023](3)代谢组学数据处理:首先使用仪器自带软件从步骤(2)获得的GC-MS原始数据中提取出代谢物的峰面积并对数据进行归一化处理，进而对数据进行多变量分析(主成分分析)和单变量分析(非参数检验分析)。
[0024]主成分分析结果表明，不同品种的家蚕血淋巴代谢物谱存在明显差异(图1A)，特别是多种代谢物在不产丝的裸蛹与产丝的家蚕(大造和21-872)中有非常显著的差异。
[0025]非参数检验分析结果显示，家蚕丝素蛋白的重要组成成分甘氨酸(占丝素蛋白的42.8%)的量在不产丝的裸蛹与产丝的家蚕(大造和21-872)中差异显著(p〈0.001)，裸蛹中甘氨酸的平均含量比大造高462%，比21-872高1037% (图1B)。
[0026]二、采用基因敲除技术干预蚕丝的合成，验证甘氨酸与丝产量的关系
[0027]选取fib-H基因敲除的大造家蚕(fib-H基因是家蚕丝素重链基因，其编码蛋白是丝素蛋白的重要成分，敲除该基因后，家蚕丝素蛋白合成受阻，仅形成一层薄薄的茧层)与其对照家蚕(正常大造家蚕)，分别收集上述家蚕幼虫期5龄第6天的血淋巴样本，GC-MS联用检测血淋巴中的甘氨酸含量。另外，统计fib-H基因敲除家蚕与其对照家蚕的茧层率，计算甘氨酸含量与茧层率的相关系数。
[0028]血淋巴中甘氨酸含量检测结果见图2A，fib-H基因敲除家蚕血淋巴中的甘氨酸含量是其对照家蚕的2.13倍，差异显著(p〈0.001)。茧层率统计结果显示，家蚕的甘氨酸含量与茧层率的相关系数为-0.892，存在较强的相关性。
[0029]三、采用摘除丝腺手段干预蚕丝的合成，验证甘氨酸与丝产量的关系
[0030]选取5龄第2天的21-872家蚕，分别进行摘除丝腺手术和假手术。分别收集摘除丝腺的21-872家蚕、假手术的21-872家蚕以及正常(未手术)的21-872家蚕幼虫期5龄第6天的血淋巴样本，GC-MS联用检测血淋巴中的甘氨酸含量。
[0031]血淋巴中甘氨酸含量检测结果见图2B，摘除丝腺的21-872家蚕血淋巴中的甘氨酸含量是假手术的21-872家蚕的2.43倍，差异显著(p〈0.001)。
[0032]上述实验结果说明，血淋巴中的甘氨酸含量与家蚕丝产量具有密切关系。
[0033]四、体外给予甘氨酸对家蚕丝产量的影响
[0034]在25 ± 2 °C、光照12小时+黑暗12小时的条件下，用新鲜桑叶饲养大造家蚕，将家蚕分为三组:实验组、对照组和正常组。实验组家蚕从幼虫期5龄第2天开始，连续5天经腹足注射外源性甘氨酸，其中，5龄第2天注射甘氨酸100 μ g，5龄第3天和第4天各注射甘氨酸300 μ g，5龄第5天和第6天各注射甘氨酸500 μ g。对照组家蚕按上述方法注射等体积水。正常组家蚕不注射任何物质。随后三组家蚕正常饲养，直至吐丝结茧，统计各组家蚕的茧层重和茧层率。
[0035]结果见图3A，对照组家蚕与正常组家蚕的茧层率无显著差异；而实验组家蚕的茧层重和茧层率较对照组家蚕分别提高了 6.5%和3.54%，差异显著(P < 0.001)。
[0036]五、体外给予甘氨酸代谢调节剂对家蚕丝产量的影响
[0037]在25±2°C、光照12小时+黑暗12小时的条件下，用新鲜桑叶饲养大造家蚕，将家蚕分为三组:实验组、对照组和正常组。实验组家蚕从幼虫期5龄第2天开始至5龄第6天结束，每隔I天经腹足注射Ing ACPC0对照组家蚕按上述方法注射等体积水。正常组家蚕不注射任何物质。随后三组家蚕正常饲养，直至吐丝结茧，统计各组家蚕的茧层重和茧层率。
[0038]结果见图3B，对照组家蚕与正常组家蚕的茧层率无显著差异；实验组家蚕的茧层率较对照组家蚕提高了 3.89%，差异显著(P < 0.001)。
[0039]上述实验结果说明，甘氨酸在调节家蚕丝产量中起着重要作用，以甘氨酸干预幼虫期蚕体代谢可以提高家蚕丝产量，通过ACPC调节幼虫期蚕体甘氨酸代谢也可以提高家蚕丝产量。
[0040]另外，甘氨酸或ACC对幼虫期蚕体代谢的干预方式除了通过腹足注射给予以外，还可以采用其它给予方法，例如在幼虫期家蚕的食物中添加甘氨酸或ACC，同样可以达到本发明所述技术效果。
[0041]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.甘氨酸或甘氨酸代谢调节剂1-氨基环丙烷-1-羧酸在提高家蚕丝产量中的应用。
2.提高家蚕丝产量的方法，其特征在于，给予幼虫期家蚕外源性的甘氨酸或甘氨酸代谢调节剂1_氨基环丙烧_1_羧酸。
3.如权利要求2所述的提高家蚕丝产量的方法，其特征在于，从家蚕幼虫期5龄第2天至5龄第6天，每日给予家蚕外源性的甘氨酸。
4.如权利要求3所述的提高家蚕丝产量的方法，其特征在于，家蚕幼虫期5龄第2天给予甘氨酸100 μ g，5龄第3天和第4天各给予甘氨酸300 μ g，5龄第5天和第6天各给予甘氨酸500 μ go
5.如权利要求2所述的提高家蚕丝产量的方法，其特征在于，从家蚕幼虫期5龄第2天至5龄第6天，每隔I日给予家蚕外源性的甘氨酸代谢调节剂1-氨基环丙烷-1-羧酸。
6.如权利要求5所述的提高家蚕丝产量的方法，其特征在于，从家蚕幼虫期5龄第2天至5龄第6天，每隔I日给予Ing的甘氨酸代谢调节剂1-氨基环丙烷-1-羧酸。
【文档编号】G01N30/88GK103983726SQ201410233620
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】夏庆友, 许国旺, 陈全梅, 刘心昱, 赵萍, 孙艳慧, 赵欣捷 申请人:西南大学, 中国科学院大连化学物理研究所