一种竞争elisa试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法
【专利摘要】一种竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法，属于生物技术检测领域，将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板；再将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中；并同时分别将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中，水浴后用PBST洗涤，再向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应，测得各板孔的OD450值，计算各板孔的抑制率。本发明利用建立的cELISA方法对小肠结肠炎耶尔森菌O9和大肠杆菌O157高免阳性血清进行检测，PI值均低于30%，可以有效地排除假阳性结果的发生。
【专利说明】—种竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术检测领域，具体涉及对牛、羊的布鲁氏菌病的一种检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病，反刍动物特别是牛和羊容易感染。根据抗原型和宿主类型将布鲁氏菌分为6类，患病母畜一般症状是流产，雄性则引起不育等生殖障碍。近几年在世界范围内布病呈现出反弹的趋势，在中国，牛种布鲁氏菌(B.abortus)和羊种布鲁氏菌(B.melitensis)造成的危害尤为广泛和严重,该病给畜牧业和公共卫生事业造成巨大经济损失，加强对布病的防控具有重要的现实意义。
[0003]对布病进行准确诊断是防止该病蔓延的首要措施，常见的布病血清学诊断方法主要有凝集试验、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光偏振试验(FPA)。由于牛种布鲁氏菌和某些杆菌(最主要的是小肠结肠炎耶尔森菌09、大肠杆菌0157)在脂多糖链(LPS)上存在共同的抗原位点，一般认为这些抗原位点属于脂多糖上可溶的蛋白类物质，因此血清学检测中往往因为交叉反应的存在而造成假阳性结果。相对而言，凝集试验的特异性和敏感性均较低，在一些发达国家已停止使用。CFT虽然特异性和敏感性均比较高，但由于操作繁琐，不适合常规检验，更不适合高通量检测，往往只用于确诊或作为其它诊断方法的仲裁。利用单克隆抗体(Mab)建立的检测动物血清中抗体的竞争ELISA (cELISA)方法已然成为目前检测布病的可靠方法之一。
[0004]目前为止，已制备针对位于脂多糖O链上(O-LPS)的A抗原、M抗原、C抗原和C/Y抗原的单克隆抗体；另一方面，学者们发现某些特定的外膜蛋白也存在免疫原性，如0MP31等利用这些单克隆抗体建立的cELISA方法早已应用于对布病的血清学检测，但由于不同单抗灵敏度和特异性等因素的限定，以及交叉反应的干扰，在实际检测当中往往会出现漏检、错检的结果。事实上，经本发明人研究发现，利用补体结合实验(CFT)和已建立的cELISA方法在检测临床样品时存在一定的不吻合率，特别是对一些介于阴性和阳性之间的疑似样品的判定。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提出一种能够提高检测准确性的竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法。
[0006]本发明的技术方案包括以下步骤:
1)将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板；
2)将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中；并同时分别将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中，37°C水浴I小时后，用PBST洗涤，再向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应； 3)测得各板孔的0D450值；
4)由公式IOOX(1-OD阴性对照/OD待检样品)％分别计算各板孔的抑制率；
其中，ODb31wm为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的D45tl值畑_#@为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的 OD45tl 值；
5)判定待检血清样品:抑制率>30%，则判定待检血清样品为阳性。
[0007]本发明采用单克隆抗体Bru_5C10建立的cELISA通过软件的ROC分析给出的最佳临界值PI=25%，此时特异性为96.3%，敏感度为99.1% ;为了提高检测过程中的特异性，本发明选择PI=30%作为临界值，此时特异性为98.8%，敏感度为96.2%。
[0008]本发明利用建立的cELISA方法对小肠结肠炎耶尔森菌09和大肠杆菌0157高免阳性血清进行检测，PI值均低于30%，说明本发明可以有效地排除假阳性结果的发生。
[0009]为了建立更准确的检测布病的cELISA方法，本发明利用灭活的牛种布鲁氏菌2308免疫小鼠，通过细胞融合技术获得I株对牛种布鲁氏菌有良好反应性的单克隆抗体，命名为单克隆抗体bru-5C10。本发明的单克隆抗体bru-5C10为杂交瘤细胞株bru_5C10分泌获得。
[0010]本发明的单克隆抗体bru-5C10，于2014年5月7日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC N0.9219，
生物材料:Bru-5C10，分类命名:杂交瘤细胞株。
[0011]另外，将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99按1.75μδ/孔溶于ρΗ=9.6的碳酸盐缓冲液中，ΙΟΟμΙ/孔加入酶标版中，4°C孵育12h，弃去酶标板中的液体后，用PBST配制的5%脱脂乳，ΙΟΟμΙ/孔加入酶标版中，封闭后于37°C放置，3h后弃去封闭液，再用PBST洗涤2次，即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。该酶标板包被抗原的获得采用超声裂解法，相对于热酚法降低了繁琐度并保证了有效性；其中包被过程中，各条件的选择都采用控制单一变量原则经实验分析得出，保证了最佳反应性。
[0012]所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是:用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(简称:TSA，由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成)上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80°C水浴灭活2h后调节菌液浊度，使其浊度约为lX101(lCFU/ml ;然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3?4次，15min/次。
[0013]本研究所建立的检测牛布氏杆菌病的cELISA方法，通过对320份临床牛血清样品的检测并与商品化布病cELISA试剂盒(Svanova公司)比较，结果显示两者的符合率为95.6%，且经第三方实验(补体结合实验)验证不吻合样品，本研究所建立的方法有更高的符合率。其意义在于本方法对布氏杆菌病的血清学检测特异性更强，敏感性更好。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为单抗Bru_5C10的免疫印迹试验图。
【具体实施方式】
[0015]一、通过细胞融合技术获得对牛种布鲁氏菌有良好反应性的单克隆抗体bru-5C10:取经过常规免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照标准程序进行细胞融合。收集杂交瘤细胞上清，用间接酶联免疫吸附实验法(iELISA)筛选与牛种布鲁氏菌A99粗提的LPS具有强反应，而与小肠结肠炎耶尔森菌09粗提的LPS无反应的阳性杂交瘤细胞株。按照有限稀释法进行2次亚克隆获得单克隆抗体bru-5C10。
[0016]二、单克隆抗体bru_5C10的保存证明信息:
保藏号CGMCC N0.9219，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日:2014年5月7日。生物材料:Bru-5C10，分类命名:杂交瘤细胞株。
[0017]三、制作牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板:
用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基(简称:TSA。胰蛋白胨大豆琼脂培养基由酪蛋白、大豆粉木瓜、氯化钠、琼脂等组成)上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80°C水浴灭活2h，调节菌液浊度，使其浊度约为I X 1010CFU/ml ;然后再利用超声裂解破碎菌体:超声频率为30HZ，15min/次，进行3~4次。
[0018]将超声裂解处理过的牛种布鲁氏菌A99按1.75μδ/孔溶于ρΗ=9.6的碳酸盐缓冲液中，100μΙ/孔加入酶标版中，4°C孵育12h。弃去酶标板中的液体后，用PBST配制的5%脱脂乳，100μΙ/孔加入酶标版中，封闭后于37°C放置，3h后弃去封闭液，再用PBST洗涤2次，即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。
[0019]四、检测试验:
以PBST为缓冲液， 将待检样本稀释20倍，待用。
[0020]以PBST为缓冲液，分别将牛的阴性血清和阳性血清稀释20倍，待用。
[0021]向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的各孔分别加入50μ1稀释后的待检样品和50μ1用PBST按照1:4000进行稀释的单克隆抗体Bru_5C10。
[0022]同时取标准阴性血清和阳性血清作为阴阳对照组，向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的A1-A2孔中分别加入50μ1稀释后的阴性血清和50μ1工作浓度的单克隆抗体bru-5C10，向包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板的A3-A4孔中分别加入50μ1稀释后的阳性血清和50μ1工作浓度的单克隆抗体bru-5C10。
[0023]分别将各孔中的体系充分混匀后，将酶标板在37°C孵育30min后，再分别以PBST洗涤4次。再向每孔加入100μΙ HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育30min后，以PBST洗涤5次。然后加入底物显色液室温作用IOmin,以2M硫酸终止。
[0024]分别读取各孔的0D450值。
[0025]OD83ft5iwS加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru_5C10和已知的阴性血清的板孔的OD45tl值加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD45tl值。
[0026]并根据公式100 X (1-0D阴性对照/OD待检样品)%分别计算抑制率(PI)。
[0027]计算结果:已知的阳性血清相应的抑制率(PI)≥30%,已知的阴性血清相应的抑制率(PI) < 30%。
[0028]以此为标准，将待检样本各孔的抑制率(PI)进行加合后求平均值，如平均值为^ 30%，则待检样本为阳性；如平均值为< 30%，则待检样本为阴性。
[0029]五、cELISA的重复性:经重复性实验结果证明，本发明所建立的cELISA批内重复性的平均变异系数为2.2% ;批间重复性的平均变异系数为5.9%，表明该cELISA方法具有良好的可重复性。
[0030]六、试剂盒中的单克隆抗体与小肠结肠炎耶尔森菌09、大肠杆菌0157没有交叉反应。
[0031]如图1的单抗Bru_5C10的免疫印迹试验图所示，其中:
I显示了牛种布鲁氏菌S2308超声裂解后的上清液与单抗Bru-5C10反应结果；
2显示了牛种布鲁氏菌A99超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果；
3显示了小肠结肠炎耶尔森菌09超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果；
4显示了大肠杆菌0157超声裂解后上清液与单抗Bru-5C10反应结果。
【权利要求】
1.一种竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99包被ELISA酶标板； 2)将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品加入酶标板的板孔中；并同时分别将抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10分别和已知的阴、阳性血清加入酶标板的板孔中，37°C水浴后，用PBST洗涤，向各板孔中分别加入抗小鼠IgG酶标抗体，孵育洗涤后，进行显色反应； 3)测得各板孔的OD45tl值； 4)由公式100X(1-OD阴性对照/OD待检样品)％分别计算各板孔的抑制率； 其中，ODPj3ft5iw为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和已知的阴性血清的板孔的OD45tl值；00#|&#@为加入了抗布鲁氏菌特异单克隆抗体bru-5C10和稀释的待检血清样品的板孔的OD45tl值； 5)判定待检血清样品:抑制率>30%，则判定待检血清样品为阳性。
2.根据权利要求1所述竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法，其特征在于单克隆抗体bru-5C10为杂交瘤细胞株bru-5C10分泌获得。
3.根据权利要求1所述竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法，其特征在于将超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99按1.75μδ/孔溶于pH为9.6的碳酸盐缓冲液中，ΙΟΟμΙ/孔加入酶标版中，4°C孵育12h，弃去酶标板中的液体后，用PBST配制的5%脱脂乳，ΙΟΟμΙ/孔加入酶标版中，封闭后于37°C放置，3h后弃去封闭液，再用PBST洗涤2次，即得包被牛种布鲁氏菌A99的ELISA酶标板。
4.根据权利要求1或2或3所述竞争ELISA试剂盒检测牛布氏杆菌病的方法，其特征在于所述超声裂解处理的牛种布鲁氏菌A99的方法是:用生理盐水洗下在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长的牛种布鲁氏菌S2308，置于80°C水浴灭活2h后调节菌液浊度，使其浊度约为I X 1010CFU/ml ;然后以频率为30HZ的超声裂解破碎菌体3?4次，15min/次。
【文档编号】G01N33/577GK103995123SQ201410266781
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】秦爱建, 王志明, 丁家波, 邵红霞, 钱琨, 冯忠武 申请人:扬州大学