一种基于酶联免疫分析的hpv核酸检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学、免疫学及核酸化学【技术领域】，具体涉及一种基于酶联免疫分析的HPV核酸检测试剂盒及其应用。该试剂盒基于一种利用Sdr单克隆抗体检测高危HPV16型E6、E7RNA的免疫检测方法，检测过程不需反转录和PCR等技术对靶序列进行扩增，而是利用不需标记的DNA探针与HPV16型E6、E7RNA进行杂交，形成DNA：RNA杂合体，然后利用Sdr单克隆抗体对杂合体进行识别和后续的信号放大。检测方法具有快速、低成本、高灵敏、不需复杂的扩增和检测仪器，以及可检测初始病毒载量的优点。
【专利说明】—种基于酶联免疫分析的HPV核酸检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学、免疫学及核酸化学【技术领域】。具体涉及一种基于酶联免疫分析的HPV核酸检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]人乳头瘤病毒(以下简称HPV)是环状双链DNA病毒，属于乳头瘤病毒科，α乳头瘤病毒属。自20世纪70年代被首次发现以来，现已公布HPV的基因型已有100种以上。其中一些基因型已经被证实与多种上皮或粘膜组织的恶性病变有关，尤其是是子宫颈癌。在全球的女性中，子宫颈癌是仅次于乳腺癌的普遍存在的恶性肿瘤。在美国，每年有1.2万名女性被诊断为宫颈癌。目前已经公认，HPV是导致全球几乎所有宫颈癌的因素。HPV导致了99%的宫颈癌，而高危HPV基因型16和18占到了 70%。更重要的是，该病毒中的Ε6和Ε7基因及其转录翻译产物是决定其侵袭和治病能力的关键因素。
[0003]几十年来，女性一直依靠细胞学检查作为检测子宫颈癌存在与否的工具。女性需要获取更好的筛查工具，包括HPV初级筛查，以降低罹患子宫颈癌的风险。现在诊断HPV感染的方法很多，比如:组织学、血清学及分子生物学等。但是，目前为止基于HPV病毒本身的特点，还不能进行体外培养，因此培养法还不现实；另外，由于针对HPV的免疫分析缺乏足够的灵敏度和特异性，血清或蛋白检测也未能应用于临床。因此，目前用于HPV检测的方法还依赖于其核酸(DNA或RNA)，例如，针对DNA的检测有基于原位杂交、DNA测序方法的直接法，基于分枝DNA分析、杂交捕获系统和Cervista高危HPV检测方法的信号放大法，基于Real-Time PCR、整合HPV序列PCR(DIPS-PCR)的靶扩增分析；针对RNA的检测有反转录PCR、基于核酸序列扩增(NASBA)法和转录介导的扩增(TMA)法等。其中，值得注意的是2003年FDA批准的Qiagen公司的Hybrid Capture2法和2014年FDA批准的罗氏(Roche)公司的cobas HPV Test 法。
[0004]然而，以上针对HPV核酸的检测方法也有其不足之处，比如,有些方法操作相对复杂、困难导致成本较高，有些方法除需要相应的扩增和检测仪器还不能真实的反映出初始的病毒载量。而病毒载量却是与病人的病程和病毒传播危害程度相关的重要因素。目前研究表明，以高危HPV基因组DNA>lpg/ml (100, 000HPV拷贝)为阈值，宫颈上皮肉瘤变(CIN)I1-1II期中阳性率为97.5%，CIN III期中阳性率为100%，宫颈癌中阳性率为100%。因此，理想的HPV的检测方法应该是基于核酸的杂交分析不需扩增HPV的靶核酸。
[0005]单克隆抗体Sdr是鼠源的针对DNA: RNA杂合体的高特异性和亲和力的抗体。我们的专利技术即是建立了一种利用Sdr单克隆抗体检测高危HPV16型E6、E7RNA的免疫检测方法，该方法不需反转录和PCR技术对待检靶序列进行扩增，而是利用不需标记的DNA探针与HPV16型E6、E7RNA进行杂交，形成DNA =RNA杂合体，然后利用Sdr单克隆抗体进行识别和后续的信号放大。检测方法具有快速、低成本、高灵敏、不需复杂的扩增和检测仪器，以及可检测初始病毒载量的优点。
【发明内容】
[0006]本发明需要解决的问题:针对现有HPV核酸的检测方法的不足之处，比如操作相对复杂、困难导致的成本较高，需要相应的扩增和检测仪器，不能真实的反映出初始的病毒载量。提供一种快速检测HPV的方法和试剂，并组装成检测试剂盒，并确定试剂盒的使用方法，可对高危HPV16型E6、E7RNA进行快速、低成本、高灵敏检测，检测过程不需复杂的扩增和检测仪器，可检测初始病毒载量。
[0007]本发明的总体技术路线:样本的采集、处理,从病样(血液、组织，宫颈分泌物、细胞脱落物等)提取HPV16型DNA或RNA ;根据GenBank公布的标准序列设计的引物进行克隆，序列分析；根据GenBank公布的标准序列设计与靶核酸进行杂交的寡核苷酸片段(探针)；在特定的杂交条件下，寡核苷酸探针与待检核酸进行杂交；杂交产物结合于PLL预先包被的酶标板上；加入针对DNA-RNA杂合体的单克隆抗体；加入抗单克隆抗体的酶标二抗；加入酶的底物显色，终止反应后测吸光度值。对实验流程中的关键反应条件、试剂成分及浓度进行优化，将探针混合液，退火缓冲液，一抗、二抗稀释液，底物显色液，反应终止液开发成检测HPV16型E6、E7RNA的试剂盒。
[0008]使用本试剂盒对体外转录的HPV16型E6、E7RNA进行检测，并进行方法学考察。该检测方法可检测HPV16E6及E7RNA的检测限分别为0.923pg/mL及0.424pg/mL,浓度线性范围分别是从 92.3pg/mL 至 0.923pg/mL 及从 42.4pg/mL 至 0.424pg/mL。
[0009]本发明的技术方案:1.提取病样中的基因组DNA ；2.根据GenBank公布的标准序列设计体外转录引物，对靶序列进行克隆，序列分析；3.根据GenBank公布的标准序列设计与靶核酸进行杂交的寡核苷酸片段(探针)；4.建立HPV16型E6、E7RNA的免疫检测方法；
5.优化关键反应条件、试剂成分及浓度，确定其使用方法；6.HPV16型E6、E7RNA的免疫检测方法的灵敏度实验。详述如下:
[0010]1.提取病样中的基因组DNA或RNA
[0011]酚/氯仿抽提法或基因组DNA或RNA提取试剂盒直接从病样(血液、组织，宫颈分泌物、细胞脱落物等)提取HPV16型病样的DNA或RNA。测量核酸浓度，调整核酸浓度至10ng/uLo
[0012]2.根据GenBank公布的标准序列设计体外转录引物，对靶序列进行克隆，序列分析
[0013]根据NCBI公开的HPV16型完整基因组序列(参考序列:NC_001526.2)设计针对E6、E7整个基因片段的体外转录引物，引物序列(5’-3’):HPV16E6基因上游引物 TAATACGACTCACTATAGGGATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAG, HPV16E6 基因下游引物TTACAGCTGGGTTTCTCTACGTGTTCTTG ；HPV16E7 基因上游引物 TAATACGACTCACTATAGGGATGCATGGAGATACACCTACATTGCAT，HPV16E7 基因下游引物 TTATGGITTCTGAGAACAGATGGGGCACAC。PCR 扩增上述提取的核酸模板；胶回收阳性PCR产物；连接到载体后转化入感受态细胞，挑取阳性克隆后扩大培养，提取质粒经鉴定阳性后进行测序分析。确定使用的模板为HPV16型E6、E7基因片段。
[0014]3.根据GenBank公布的标准序列设计与靶核酸进行杂交的寡核苷酸片段(探针)
[0015]根据NCBI公开的HPV16型完整基因组序列(参考序列:NC_001526.2)设计针对E6、E7基因片段的寡核苷酸探针，序列如下:[0016]
【权利要求】
1.一种基于酶联免疫分析的HPV16型E6、E7RNA检测试剂盒，其特征是试剂盒的组成部分为: (1)预包被的酶标板:P11处理的聚苯乙烯微孔板，BSA封闭，储藏条件为4°C，保质期半年； (2)探针混合液1:针对HPV16E6RNA片段的探针组合，E6DNA1、E6DNA2、E6DNA3，浓度均为 10uM ； (3)探针混合液2:针对HPV16E7RNA片段的探针组合，E7DNA1、E7DNA2，浓度均为10uM;
(4)10X 退火缓冲液:Tris-HC110OmM, ρΗ7.5，EDTA1OmM, NaC11M ； (5)针对DNA-RNA的鼠源单克隆抗体Sdr溶液； (6)针对Sdr的酶标二抗溶液； (7)底物显色溶液:ΤΜΒ溶液； (8)洗涤缓冲液:10XPBS溶液； (9)反应终止液:2MH2SO4。
2.根据权利要求1所述试剂盒用于体外转录RNA模板或直接从病样中提取的RNA的检测方法，其特征是由以下步骤构成: (1)将体外转录RNA模板或直接从病样中提取的RNA与探针混合液I或2进行杂交，杂交体系:10u11O X退火缓冲液，3u1或2u1探针混合液，RNA模板溶液10u1，补充DEPC H2O至10Ou1 ;杂交条件:95V 5min,65°C 2h，冰上冷却5min ； (2)预包被的酶标板中，每孔加入10Ou1杂交产物，室温孵育1h，300u1PBST洗5次；每孔加入10Ou1 Sdr单克隆抗体溶液，室温孵育1h，如上洗涤；每孔加入10Ou1酶标二抗溶液，室温孵育1h，如上洗涤；加入10Ou1 TMB底物显色溶液，37°C孵育20min ;每孔加入50u1反应终止液终止反应，测Abs值，测量波长450nm，参比波长570nm。
3.根据权利要求1所述试剂盒在高危HPV16型人乳头瘤病毒检测中的应用。
【文档编号】G01N33/577GK104020291SQ201410298037
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】沈萍萍, 丁森, 卢彦 申请人:南京大学