一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法
【专利摘要】本发明适用于药物分析【技术领域】，提供一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：A)供试品溶液的制备；B)参照物溶液的制备；C)复方血栓通制剂指纹图谱的检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪检测，得到复方血栓通制剂指纹图谱；所述液相色谱仪的检测条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％体积百分含量的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为270nm，柱温为18～22℃。本发明提供的检测方法可以同时检出黄芪、丹参和玄参中代表性较强的活性成分，重复性好，专属性强，有利于保证产品质量的均一性和稳定性。
【专利说明】一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物分析【技术领域】，尤其涉及一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方 法。
【背景技术】
[0002]中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段， 得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。以指纹图谱作为中药提取物及其制剂的质 量控制方法，已成为国际共识，符合中药特色的指纹图谱控制技术体系是当前中药领域的 研究热点之一。
[0003]复方血栓通制剂是由三七、黄芪、丹参和玄参制成的纯中药制剂，具有活血化癒， 益气养阴的功能，对眼底病、心绞痛和糖尿病视网膜病变等具有显著的疗效。复方血栓通制 剂包括見方血栓通股囊、复方血栓通片、复方血栓通软胶囊、复方血栓通颗粒、复方血检通 滴丸。 2〇 10年版中国药典中收载了复方血栓通胶囊的标准，该标准中描述了三七皂苷R1、 人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbl的含量测定方法并规定其含量的总和不得少于9. 0mg/粒。 三七为复方血栓通胶囊的君药，现有的中国药典标准主要对三七的活性成分进行检测，尚 无法对复方血检通股囊中的化学成分进行全面、系统的检测。中国专利ZL 200510033778. 3 公开了一种复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建方法，虽然可以同时对四味药材中的成 分进行检测，但主要针对三七的活性成分，无法检出丹酚酸B等其他三位药材中代表性较 强的活性成分。因此，现有技术对三七活性成分的检测研究较为充分，但无法同时检出黄 芪、丹参和玄参中代表性较强的活性成分。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于：提供一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，旨在解决现 有的检测方法无法同时检测出复方血栓通制剂中的黄苗、丹参和玄参中代表性较强的活性 成分的问题。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：
[0006] 一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
[0007] A)供试品溶液的制备：称取复方血栓通制剂〇· 1?10· 〇g,加入5〇%?1〇〇%体积 百分含量的甲醇，超声处理，摇勻，滤过,取滤液，得到供试品溶液；
[0008] B)参照物溶液的制备：分别称取丹酚酸B对照品、毛蕊异黄酮一7一〇- β -D-卩比喃葡 萄糖苷对照品、哈巴俄苷对照品、肉桂酸对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮I对照品和丹参 酮II Α对照品适量，加甲醇制成每lml各含丹酚酸Β 25 μ g、毛蕊异黄酮-7-0_β _D-批喃 葡萄糖苷1 μ g、哈巴俄苷3 μ g、肉桂酸0· 5 μ g、隐丹参酮1· 5 μ g、丹参酮I h 5 μ g、丹参丽 II A 2· 5μ g的溶液，摇匀，得到参照物溶液； ' 少
[0009] C)复方血栓通制剂指纹图谱的检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各 20 μ 1，注入液相色谱仪检测，得到复方血栓通制剂指纹图谱；所述液相色谱^仪的检测条件 包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0· 1 %体积百分含 量的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为270nm，柱温为18?22°C。
[0010] 本发明以甲醇为提取溶剂，采用超声处理的方法对复方血栓通制剂中的黄蔑、丹 参和玄参活性成分进行提取，不仅对其中的活性成分提取较为完全，且方法较简便。此 夕卜，本发明以270mn为检测波长，以乙腈-0. 1 %的磷酸溶液为流动相，通过梯度洗脱， 可以达到基线较平稳，分离度、峰形和柱效较佳，出峰个数较多的效果，实现毛蕊异黄 酮-7-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹酚酸B、哈巴俄苷、肉桂酸、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮 Π A等的陆续出峰。其中，毛蕊异黄酮-7-〇-f3-D-批喃葡萄糖苷来自黄芪，丹酚酸B、隐丹 参酮、丹参酮I和丹参酮II A来自丹参，哈巴俄苷和肉桂酸来自玄参。
[0011] 优选地，所述超声处理的功率为250?300W,频率为40?50KHz，时间为0. 5? 1.证。更优选地，所述超声处理的功率为300W,频率为45KHz，时间为lh。
[0012]优选地，所述梯度洗脱包括：〇?30min时，流动相A 15%-35%，流动相B 85% -65%;30?5〇11^11时，流动相4 35%-65%,流动相865%-35%;50?7〇111丨11时，流动 相A 65%，流动相B 35%。
[0013] 优选地，所述步骤C)中，柱温为20°c。
[0014]优选地，所述步骤A)中的甲醇为8〇%体积百分含量的甲醇。以不同浓度的甲醇为 提取溶剂，对供试品的提取有较大的影响，本发明结合本发明提供的色谱检测条件对甲醇 浓度进行优化：25%甲醇作为溶剂时，几乎提取不到供试品的脂溶性成分； 5〇%甲醇作为 溶剂，提取的水溶性成份较多，而脂溶性成份相对较少；80 %甲醇作为溶剂，提取的水溶性 成份和脂溶性成份均相对较多；甲醇作为溶剂时，提取的水溶性成份较少，但脂溶性成份最 多。因此，优选80%甲醇作为提取溶剂。
[0015] 优选地，所述步骤C)中的色谱柱为Thermo ODS Hypersil C18。
[0016] 优选地，所述复方血栓通制剂为复方血栓通胶囊或复方血栓通片。
[0017]优选地，所述梯度洗脱还包括：70?75min时，流动相A 65%- 15%，流动相B 35%-85% ;75 ?90min 时，流动相 A15%，流动相 B 85%。
[0018]本发明的突出优点是：本发明通过供试品处理、检测波长、流动相、洗脱梯度、色谱 柱温等方面的研究，提供了一种可以同时检出黄芪、丹参和玄参中代表性较强的活性成分 的指纹图谱检测方法，该检测方法的重复性好，专属性强，有利于保证产品质量的均一性和 稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明提供的流动相1和流动相2的考察结果图；
[0020] 图2是本发明提供的流动相3和流动相4的考察结果图；
[0021] 图3是本发明提供的流动相5的考察结果图；
[00221图4是本发明提供的流动相梯度丨和梯度2的考察结果图；
[0023]图5是本发明提供的流动相梯度3和梯度4的考察结果图；
[0024] 图6是本发明提供的流动相梯度5的考察结果图；
[0025] 图7是本发明提供的柱温15°C和2(TC的考察结果图；
[0026] 图8是本发明提供的柱温25°C和35。(：的考察结果图；
[0027] 图9是本发明提供的复方血栓通胶囊的HPLC参照指纹图谱；其中1为毛蕊异黄 酮-7-0-β-D-吡喃葡萄糖苷，5为丹酚酸B，7为哈巴俄苷，9为肉桂酸，10为隐丹参酮，n 为丹参酮I，12为丹参酮II A ;
[0028] 图10是本发明提供的20批次供试品溶液的匹配色谱图；其中R(16)为对照指纹 图谱。
【具体实施方式】
[0029]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0030] 本发明提供的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法可以同时检出黄芪、丹参和玄 参中代表性较强的活性成分，重复性好，专属性强，有利于保证产品质量的均一性和稳定 性。
[0031] 三七是复方血栓通制剂的君药，来自三七的活性成分及其含量较多，现有技术往 往以三七活性成分的检测为主要目标进行研究，从而对其他药材的活性成分检测产生影 响，导致无法同时检出黄芪、丹参和玄参中代表性较强的活性成分。发明人通过供试品处 理、检测波长、流动相、洗脱梯度、色谱柱温等方面的研究，意料不到地发现：本发明提供的 复方血栓通制剂指纹图谱检测方法可以同时检出黄芪、丹参和玄参中代表性较强的活性成 分，有利于保证产品质量的均一'性和稳定性，通过补充针对三七活性成分三七阜音&、人参 皂苷R&、人参皂苷Rbi、人参皂苷Re的现有检测技术，即可对复方血栓通制剂进行全面、系 统的检测。
[0032]以下实施例中，丹酚酸B对照品、毛蕊异黄酮-7-〇- β _D-吡喃葡萄糖苷对照 品、哈巴俄苷对照品、肉桂酸对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮I对照品和丹参酮II A对 照m均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为：111562_200807、1 11920_201203、 111730-200605、110786-200503、10852-200305、0867-200205、110766-200518。
[0033]除非特指，本发明中的百分含量均为体积百分含量。
[0034] 实施例一流动相的考察 。 筛选出合适的流动相，发明人使用供试品溶液对不同的流动相进行考察，按 度^洗脱，结果如图1至图3所示。其中，流动相1 :以乙腈为流动相A，以水 ? St ?Γ动相2:以乙睛为流动相Α，以0· 02%憐酸溶液为流动相Β ;流动相3 :以乙腈 =$日R 憐酸溶液为流动相Β Γ流动相4 :以乙臆減动相Α，以〇. 02 %醋酸溶液 动相上以乙腈为流动相Α，以〇_ 1%醋酸碰为流动相Β。从图i至图3可 知，乙〇. 1 %磷酸溶液为流动相时，基线较平稳，分离度峰 _6]表卜流动椰嫌臟度 桃概獻仏
[0037]
【权利要求】
1. 一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括如下步骤： A) 供试品溶液的制备：称取复方血栓通制剂0. 1?10. Og，加入50%?100%体积百分 含量的甲醇，超声处理，摇匀，滤过，取滤液，得到供试品溶液； B) 参照物溶液的制备：分别称取丹酚酸B对照品、毛蕊异黄酮-7-0-β-D-吡喃葡萄 糖苷对照品、哈巴俄苷对照品、肉桂酸对照品、隐丹参酮对照品、丹参酮I、对照品和丹参 酮ΙΙΑ对照品适量，加甲醇制成每lml各含丹酚酸Β25μ g、毛蕊异黄酮-7-0-3-D-吡喃葡 萄糖苷1 μ g、哈巴俄苷3 μ g、肉桂酸0.5 μ g、隐丹参酮1.5 μ g、丹参酮11.5 μ g、丹参酮 IIA2. 5 μ g的溶液，摇匀，得到参照物溶液； C) 复方血栓通制剂指纹图谱的检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液备20 μ 1，注 入液相色谱仪检测，得到复方血栓通制剂指纹图谱；所述液相色谱仪的检测条件包括：色 谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相Α，以0. 1 %体积百分含量的磷酸 溶液为流动相Β，进行梯度洗脱，检测波长为270nm，柱温为18?22°C。
2. 如权利要求1所述的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述超声 处理的功率为250?300W，频率为40?50KHz，时间为0. 5?1. 5h。
3. 如权利要求1所述的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述梯度 洗脱包括：〇?30min时，流动相A15% - 35%，流动相B85% - 65% ;30?50min时，流动 相A35% - 65%，流动相B65% - 35% ;50?70min时，流动相A65%，流动相B35%。
4. 如权利要求1-3任一所述的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所 述步骤C)中，柱温为20°C。
5. 如权利要求1-3任一所述的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所 述步骤A)中的甲醇为80%体积百分含量的甲醇。
6. 如权利要求1-3任一所述的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所 述步骤C)中的色谱柱为Thermo ODS Hypersil C18。
7. 如权利要求1-3任一所述的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所 述复方血栓通制剂为复方血栓通胶囊或复方血栓通片。
8. 如权利要求3所述的复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述梯度 洗脱还包括：70?75min时，流动相A65% - 15%，流动相B35% - 85%;75?90min时，流 动相A15%，流动相B85%。
【文档编号】G01N30/02GK104297360SQ201410389635
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】谢称石, 龙超峰, 杜静, 黄爱君 申请人:广东众生药业股份有限公司