一种c反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种C反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸，C反应蛋白半定量检测试剂包括以下组分：包被用CRPⅠ抗体划线：0.1-3mg/ml；包被用goatantirabbit抗体C1线：0.1-1mg/ml；包被用goatantirabbit抗体C2线：0.1-1mg/ml；标记用CRPⅡ抗体：每毫升胶体金中CRPⅡ抗体含量为1-10μg；标记用兔IgG抗体：每毫升胶体金中兔IgG抗体含量为5-20μg；金重悬液：含20mMTris的Tris-Hcl重悬液,pH7-10；样品垫处理液：含20mMTris的Tris-Hcl溶液,pH7-10；样品稀释液：含20mMTris的Tris-Hcl溶液,pH8。本发明的检测试剂及试纸，使用方便，检测效率高，响应速度快，灵敏度高，特异性好。
【专利说明】一种C反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种分子生物学领域C反应蛋白检测试剂及应用该试剂的试纸，特别是一种C反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸。
[0003]本专利文件中所涉及之术语含义:
0.9% Nacl:表不配直完成后的溶液中每10mL含Nacl0.9g。
[0004]类似格式均表示类似含义，本文另有说明的除外。
[0005]
【背景技术】
[0006]C反应蛋白，1930年Tillet和Francis在急性大叶性肺炎患者血清中发现能在隹丐离子存在时与肺炎球菌C多糖起沉淀反应而得名，是人类重要的急性期反应蛋白，急性期浓度可升高上千倍，循环中的CRP半衰期为19小时。人类CRP是由肝脏产生，由五个相同的亚基依靠非共价键形成的环状五聚体，这一特征性结构使其归类于五聚素(一组具有免疫防御特性的钙结合蛋白)家族。低等动物同样存在CRP，如在鲎、河蛘等中也发现过，但并不一定起急性期反应蛋白的作用。CRP特征反应是能在钙离子存在的条件下特异性结合磷酸胆碱基团。
[0007]人高敏C 反应蛋白(Human C-reactive protein, CRP),简称 HS-CRP,因其能和肺炎双球菌的细胞壁的C多糖起沉淀反应而得名，是相对分子质量为115-140KD的血清β球蛋白。CRP持续增高提示机体存在慢性炎症或自身免疫疾病，CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受患者的个体差异、机体状态和治疗药物的影响。近年来，随着检测技术的进步，采用超敏感方法检测到的CRP被称为超敏CRP。大量的文章研究显示，它在冠心病、中风、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用，甚至被认为是心血管病危险评估的“金标准”。从检测角度上来说，目前临床上用于测定HS-CRP的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。
[0008]CRP是由5个完全相同的非糖基化的亚单位非共价联结，每个亚单位相对分子质量23017，由206个氨基酸残基组成。CRP这种盘状五聚体特征结构使其归于五聚素(pentraxins)家方矣。
[0009]CRP是在组织受损、发炎或感染时，经细胞因子如白细胞介素6 (IL-6)等诱导，主要在肝脏中合成，为急性期时相反应蛋白。CRP在健康人血清中浓度很低，但对炎症反应非常敏感，炎症开始4h?7h其浓度就显著升高，是非特异性的炎症指示剂。CRP水平可以反映机体潜在的炎症活跃程度，广泛应用于临床。
[0010]健康人的CRP值非常低，一般小于0.8mg/L，90%的健康人CRP〈0.3mg/L。而在炎性反应或急性损伤后，CRP的合成则在4?6h内迅速增加，36?50h达高峰，峰值可为正常值的100?1000倍。其半衰期较短(4?6h)，经积极合理治疗后，3?7天迅速降至正常。
[0011]胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。
[0012]由于血清CRP的含量分布差异较大从零点几毫克每升到几百毫克每升，其测定方法需要较高的灵敏度和特异性。目前，免疫比浊法是最为普遍通用的方法，但是传统的CRP检测不适合单人份测试、检测时间较长，并且需要大型的生化检测仪，不适用于规模较小的医院。
[0013]
【发明内容】
[0014]为解决上述问题，本发明公开了一种C反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸，该试剂灵敏度高，线性范围宽，生产成低，使用方便，同时该试剂的试纸使用方便，灵敏度高，测试准确，极大地方便了对C反应蛋白的测定。
[0015]本发明公开的C反应蛋白半定量检测试剂包括以下组分:
包被用CRP I抗体划线:0.l-3mg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗体 Cl 线:0.1-lmg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗体 C2 线:0.1-lmg/ml ；
标记用CRP II抗体:每毫升胶体金中CRP II抗体含量为1-10 μ g ；
标记用兔IgG抗体:每毫升胶体金中兔IgG抗体含量为5-20 μ g ；
金重悬液:含20mM Tris的Tris-Hcl重悬液，pH 7-10 ；
样品垫处理液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 7-10 ；
样品稀释液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 8。
[0016]作为一种优选,金重悬液中Tris-Hcl重悬液还含0.1-0.5% casein, 5-20%鹿糖，1-3% BSA,0.1-0.3% tween20,0.05% NaN3。
[0017]作为一种优选，样品垫处理液中Tris-Hcl溶液还含1-5% PVP,l-5% tritonX
100,0.1-0.5% Casein,0.05% NaN3。
[0018]作为一种优选，样品稀释液中Tris-Hcl溶液还含0.9% Nacl,0.05% NaN3。
[0019]本发明公开的试纸，包括底板、样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸，底板、样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均为长条形，样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均设置在底板上表面，样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸顺次由底板一端向底板另一端设置。
[0020]作为一种优选，样品垫与金标垫相邻端、金标垫与醋酸纤维膜相邻端以及醋酸纤维膜与吸水纸相邻端重叠，重叠部分宽度均为2_，所述样品垫与金标垫相邻端为样品垫叠放在金标垫上，所述金标垫与醋酸纤维膜相邻端为金标垫叠放在醋酸纤维膜上，所述醋酸纤维膜与吸水纸相邻端为吸水纸叠放在醋酸纤维膜上。通过叠放部分形成不同结构间良好的桥接作用，便于展开剂展开并且与介质充分接触，提高试纸响应速度、改善检测效果和检测稳定性。
[0021]作为一种优选，底板为PVC板，并且所述底板、样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均为等宽长条形。如此不仅规格整齐，还可以保证试纸具有稳定的结构便于保存，同时能够保证在稳定的尺寸下，保证层析过程具有良好的稳定性和显示平滑性。
[0022]作为一种优选，样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均为多孔材质板。
[0023]本发明公开的C反应蛋白半定量检测试剂，反应灵敏，应用范围广泛，通过半定量测试方法在C反应蛋白检测中可以迅速对其生理指数进行检测，对检测对象的身体状态进行初步判断，降低了检测应用成本。
[0024]
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1、本发明试纸的结构示意图。
[0026]附图标记列表:
1、底板；2、样品塾； 3、金标塾；
4、醋酸纤维膜； 5、吸水纸。
[0027]
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和【具体实施方式】，进一步阐明本发明，应理解下述【具体实施方式】仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
[0029]本发明公开的C反应蛋白半定量检测试剂包括以下组分:
包被用CRP I抗体划线:0.l-3mg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗体 Cl 线:0.1-lmg/ml ；
包被用 goat anti rabbit 抗体 C2 线:0.1-lmg/ml ；
标记用CRP II抗体:每毫升胶体金中CRP II抗体含量为1-10 μ g ；
标记用兔IgG抗体:每毫升胶体金中兔IgG抗体含量为5-20 μ g ；
金重悬液:含20mM Tris的Tris-Hcl重悬液，pH 7-10 ；
样品垫处理液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 7-10 ；
样品稀释液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 8。
[0030]作为一种优选,金重悬液中Tris-Hcl重悬液还含0.1-0.5% casein, 5-20%鹿糖，1-3% BSA,0.1-0.3% tween20,0.05% NaN3。
[0031]作为一种优选，样品垫处理液中Tris-Hcl溶液还含1-5% PVP,l-5% tritonX
100,0.1-0.5% Casein,0.05% NaN3。
[0032]作为一种优选，样品稀释液中Tris-Hcl溶液还含0.9% Nacl,0.05% NaN3。
[0033]本发明公开的试纸，包括底板1、样品垫2、金标垫3、醋酸纤维膜4和吸水纸5，底板1、样品垫2、金标垫3、醋酸纤维膜4和吸水纸5均为长条形，样品垫2、金标垫3、醋酸纤维膜4和吸水纸5均设置在底板I上表面，样品垫2、金标垫3、醋酸纤维膜4和吸水纸5顺次由底板I一端向底板I另一端设置。
[0034]作为一种优选，样品垫2与金标垫3相邻端、金标垫3与醋酸纤维膜4相邻端以及醋酸纤维膜4与吸水纸5相邻端重叠，重叠部分宽度均为2_，所述样品垫2与金标垫3相邻端为样品塾2置放在金标塾3上，所述金标塾3与醋酸纤维I吴4相邻端为金标塾3置放在醋酸纤维膜4上，所述醋酸纤维膜4与吸水纸5相邻端为吸水纸5叠放在醋酸纤维膜4上。
[0035]作为一种优选，底板I为PVC板，并且所述底板1、样品垫2、金标垫3、醋酸纤维膜4和吸水纸5均为等宽长条形。
[0036]作为一种优选，样品垫2、金标垫3、醋酸纤维膜4和吸水纸5均为多孔绵材质板，材料中微孔孔径10-100 μ m占75-80%，并且样品垫2、金标垫3、醋酸纤维膜4和吸水纸5比表面积均大于lm2/g。
[0037]以下实施例均采用薄层层析法来举例说明本申请，但本申请试剂的应用不仅仅限于薄层层析法，还可以采用其它方案，如柱层析或纸层析。
[0038]实施例1
1.样品(血清或血浆)用样品稀释液按1:200稀释；
2.取40μ I稀释好的样品，滴加到本发明公开的试纸上样品垫上；
3.室温水平静置1min；
4.1Omin后，根据质控线判断样品测试结果。
[0039]一、胶体金的制备原材料:
2% HAucl4Clg HAucl4溶解于50ml去离子水中)
I %柠檬酸三钠溶液(Ig柠檬酸三钠二水溶于10ml去离子水中)
方法:
1、取198ml ddH20( 二次蒸馏水)于锥形瓶中，加入2ml 2% HAuCL4溶液，混匀。
[0040]2、锥形瓶置于上，加热沸腾。
[0041]3、迅速一次性加入5ml I %柠檬酸三钠溶液，继续煮沸。
[0042]4、观察溶液颜色变化，由浅黄一黑色一紫色一紫红色，当完全变为紫红色时，继续保持沸腾5分钟。
[0043]5、停止加热，冷却至室温，制得胶体金。
[0044]二、抗体的标记(金标液，按照下述步骤逐步配置)
1、取2个1.5ml离心管
2、分别加入4μ I 0.2Μ K2CO3溶液
3、分别加入Iml前述胶体金混匀
4、分别加入2μg CRP II与5μ g兔IgG，加入抗体后立即混匀，再静置15min
5、加入1%BSA，混匀后静置15min
6、离心机1000rpm离心5min,轻轻吸取上清液
7、最后用Iml 金重悬液 pH9.4, 2OmM Tris-Hcl 重悬(含 0.2% casein, 10%鹿糖，2%BSA,0.1% tween20 ；0.05% NaN3)重悬即可。
[0045]三、划线与点金划线:
1、将CRP I抗体稀释至lmg/ml，稀释溶剂为PBS (10nM-50mM，以磷酸根浓度计，本处优选浓度1nM)，得到包被用CRP I抗体划线用试剂。
[0046]GAR (goat anti rabbit)抗体分别稀释至0.12和0.25mg/ml,稀释溶剂为PBS(10-50mM,以磷酸根浓度计,本处优选浓度20mM),分别作为包被用goat anti rabbit抗体Cl线和包被用goat anti rabbit抗体C2线划线用试剂。
[0047]2、用划线仪分别在距离醋酸纤维(NC)膜一端(金标垫侧)7.5mm, 11.5mm, 15.5mm处划lmg/ml CRP I (检测线)，0.12mg/ml (包被用goat anti rabbit抗体Cl线，质控线)与0.25mg/ml (包被用goat anti rabbit抗体C2线,质控线)的GAR抗体线。划线速度为1.0ul/cm。
[0048]3、画完后，除湿机前烘干。
[0049]点金:
30cm*0.6cm的金标垫用500 μ I (CRP11与兔IgG金标液都为250 μ I组成)的金标液均匀浸润，至于除湿机前烘干
四、样品垫的预处理样品垫预处理液:
20Mm Tris-hcl pH 10:含 2% PVP，2% tritonX 100,0.2% Casein ；0.05% NaN30
[0050]30cm*1.7cm的样品垫用3ml的样品垫预处理液处理,至于除湿机前烘干
五、试纸组装
试纸的组装如图1，样品垫为18mm,金标垫为6mm,醋酸纤维膜为25mm,吸水纸为17mm,样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸重叠部分都为2_，底板选用PVC板，底板长度至少为样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸的长度总和。组装后用斩切机切成4_宽的试纸条。
[0051]六、样品测试
样品稀释液:20mM Tris-hcl pH 8(0.9% Nac 1,0.05% NaN3)
样品经样品稀释液稀释后，以滴40ul于试纸上样品垫距底端5-8mm处，室温静置1min,流动方向为图1中箭头方向。
[0052]七、检测结果
以下样品的检测可以选用本申请试纸为载体也可以选用专用检测仪或者光度仪。
[0053]1、相关性实验
将本C反应蛋白半定量检测试纸与CRP定量生化检测仪比对临床血清样品。结果显示本研发的试纸检测结果与定量生化检测仪检测的结果有较好的相关性。
【权利要求】
1.一种C反应蛋白半定量检测试剂，其特征在于:所述C反应蛋白半定量检测试剂包括以下组分: 包被用CRP I抗体划线:0.1-3 mg/ml ； 包被用 goat anti rabbit 抗体 Cl 线:0.1-1 mg/ml ； 包被用 goat anti rabbit 抗体 C2 线:0.1-1 mg/ml ； 标记用CRP II抗体:每毫升胶体金中CRP II抗体含量为1-10 μ g ； 标记用兔IgG抗体:每毫升胶体金中兔IgG抗体含量为5-20 μ g ； 金重悬液:含20mM Tris的Tris-Hcl重悬液，pH 7-10 ； 样品垫处理液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 7-10 ； 样品稀释液:含20mM Tris的Tris-Hcl溶液，pH 8。
2.根据权利要求1所述的C反应蛋白半定量检测试剂，其特征在于:所述金重悬液中 Tris-Hcl 重悬液还含 0.1-0.5%casein, 5-20% 蔗糖，1_3%BSA，0.1-0.3% tween20,0.05%NaN3。
3.根据权利要求1所述的C反应蛋白半定量检测试剂，其特征在于:所述样品垫处理液中 Tris-Hcl 溶液还含 1-5% PVP，1-5% tritonX 100，0.1-0.5% Casein, 0.05% NaN30
4.根据权利要求1所述的C反应蛋白半定量检测试剂，其特征在于:所述样品稀释液中 Tris-Hcl 溶液还含 0.9% Nacl,0.05% NaN30
5.一种应用如权利要求1所述的C反应蛋白半定量检测试剂的试纸，其特征在于:所述试纸包括底板、样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸，所述底板、样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均为长条形，所述样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均设置在底板上表面，所述样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸顺次由底板一端向底板另一端设置。
6.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于:所述样品垫与金标垫相邻端、金标垫与醋酸纤维膜相邻端以及醋酸纤维膜与吸水纸相邻端重叠，重叠部分宽度均为2mm，所述样品垫与金标垫相邻端为样品垫叠放在金标垫上，所述金标垫与醋酸纤维膜相邻端为金标垫叠放在醋酸纤维膜上，所述醋酸纤维膜与吸水纸相邻端为吸水纸叠放在醋酸纤维膜上。
7.根据权利要求5或6所述的试纸，其特征在于:所述底板为PVC板，并且所述底板、样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均为等宽长条形。
8.根据权利要求5或6所述的试纸，其特征在于:所述样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均为多孔材质板。
9.根据权利要求7所述的试纸，其特征在于:所述样品垫、金标垫、醋酸纤维膜和吸水纸均为多孔材质板。
【文档编号】G01N33/68GK104198731SQ201410430781
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】蒋海, 张闻, 周海滨, 王建飞 申请人:宁波瑞源生物科技有限公司