一种适用于菊花的流式细胞术样品的制备方法
【专利摘要】本发明属于流式细胞术检测领域，提供一种适用于菊花的流式细胞术样品的制备方法。该方法包括：裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染色的细胞核；染色步骤：对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。本发明针对菊花流式细胞术分析采用了适当的细胞裂解缓冲液，能够有效地去除菊花完整的细胞核中残留的胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集；并保护DNA不被降解；并提供适合的环境用来进行专一的核DNA化学染色，有效地降低胞质成分对染色的负面影响；本发明中，样品制备流程的优化有效的减少了上机测试中杂峰的出现，提高了检测结果的精确性、准确性和稳定性。
【专利说明】一种适用于菊花的流式细胞术样品的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于流式细胞术检测领域，特别涉及一种适用于菊花的流式细胞术样品的 制备方法，该方法通过针对菊花配制合适的细胞裂解缓冲液等反应液，得到合适的用于流 式细胞术分析的菊花样品。
【背景技术】
[0002] 菊花（chrysanthemum morifolium)是菊科（compositae)菊属（chrysanthemum) 植物，原产我国，是中国传统十大名花和世界四大切花之一，也是北京市的市花。我国是栽 培菊花的起源中心和菊属种质资源的分布中心（李辛雷，2004)，野生资源和栽培品种十分 丰富，其瓣型花型变异繁多。在一千六百多年的栽培和应用历史过程中形成了大量色彩丰 富且姿态各异的品种，不仅可用于观赏，而且广泛用于食用、药用和茶用。确定一些具有重 要研究价值和经济性状的菊花物种的基因组大小，无论对将来的菊花全基因组测序还是其 起源进化研究以及杂交育种工作等方面均能提供有价值的参考。菊花细胞染色体倍性的了 解对于品种的鉴定、杂交组合的选配、杂交后代材料的提前筛选、亲缘关系的鉴定等均具有 十分重要的意义。
[0003] 流式细胞术从1980开始作为一项重要的技术应用到植物研究中，其主要用途在 于用来估计核DNA含量，确定植物染色体倍性和细胞周期分析（Galbraith，2004 ;Shapiro， 2004 ;Bennett and Leitch，2005)。流式细胞术与其他传统的方法相比具有快速、方便和精 确的特点（Dolez V el and Bartos, 2005)。流式细胞术的普及主要得益于相对简单的样品 准备方法，简要的方法主要包括三步：（1)将植物组织样品在适合的缓冲液中切碎，释放细 胞核。（2)用荧光染料对细胞核进行染色，定量的与DNA结合，因此基因组越大，DNA染色也 越多。（3)染色的细胞核上机检测。通过与已知基因组大小的植物物种比较荧光染色量的 多少，得出被测样品的基因组大小。
[0004] 样品制备中最重要的环节是将植物组织在细胞核裂解液中均匀的粉碎 (Galbraith et al.，1983)。细胞裂解缓冲液应该能够去除完整的细胞核中残留的胞质 碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集。细胞裂解缓冲液还应该保护DNA不被 降解，并提供适合的环境用来进行专一的核DNA化学染色，尽可能降低胞质成分对染色 的负面影响。L 〇Ureir〇(2006a)等系统的比较了四种常用的不同化学组分的核游离缓冲 液：Galbraith (Galbraith et al.，1983) LBOl (Dolez "el et al.，1989) Otto (Mlrich andM lrich，1991 ;Dolez v el and Go -- hde，1995) Tris，MgC12 (Pfosser et al.，1995)。由 于植物组织在结构和化学组成上的多样性，很难有一种单一的缓冲液很好地适用于所有物 种（Dolez V el and Bartos ' 2005)。许多实验室倾向于研发自己的细胞裂解缓冲液配方。
[0005] 菊花由于其品种变异丰富，分布广泛，形态各样，它的起源及遗传背景相比其它众 多植物要复杂得多，导致有些品种的菊花在用常规细胞裂解缓冲液处理时不能得到理想的 效果，因此需要针对菊花特殊的形态结构和生理特点改进细胞裂解缓冲液和染色液，最终 制备得到的样品适用于流式细胞仪的分析。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用于菊花的流式细胞术样品 的制备方法，可以得到合适的用于流式细胞术分析的菊花样品。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，包括以下步骤：
[0009] 裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染色的细 胞核；
[0010] 染色步骤：对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。
[0011] 进一步地，所述菊花的种类为甘菊、异色菊、亚菊、毛华菊、朝鲜菊、日本雏菊、紊 蒿、紫花野菊。
[0012] 进一步地，所述裂解步骤中，菊花组织样品为菊花未开花植株上部的新生幼嫩叶 片。
[0013] 进一步地，所述裂解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：
[0014] 15mM的MOPS缓冲液，2mM的乙二胺四乙酸二钠，0. 5mM的四盐酸精胺，80mM的氯化 钾，20mM的氯化钠，0-1 % (v/v)的聚乙二醇单辛基苯基醚，0-1 % (w/v)的聚乙烯批咯烧酮 (平均分子量为10,000)，0-0. 2 % (v/v)的P -巯基乙醇；所述细胞裂解缓冲液的pH值为 7. 5。
[0015] 进一步地，所述裂解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：
[0016] 15mM的MOPS缓冲液，2mM的乙二胺四乙酸二钠，0. 5mM的四盐酸精胺，80mM的氯 化钾，20mM的氯化钠，0. 1% (v/v)的聚乙二醇单辛基苯基醚，1% (w/v)的聚乙烯批咯烧 酮（平均分子量为1〇,〇〇〇)，〇. 1% (v/v)的￠-巯基乙醇；所述细胞裂解缓冲液的pH值为 7. 5。
[0017] 进一步地，所述裂解步骤的离心处理中，转速为900-3000rpm rpm，温度为4°C，时 间为3-10分钟。
[0018] 进一步地，所述裂解步骤的离心处理中，转速为1300rpm rpm，温度为4°C，时间为 10分钟。
[0019] 进一步地，根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，所述 染色步骤的染色处理中，采用的染色液含有50 y g/ml的Rnase A、50 y g/ml的碘化丙陡。
[0020] 本发明相比现有技术具有以下有益效果：
[0021] 1、因为本发明针对菊花流式细胞术分析进行了细胞裂解缓冲液的配制，所以能够 有效地去除菊花完整的细胞核中残留的胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝 集，保护DNA不被降解，并提供适合的环境用来进行专一的核DNA化学染色，有效地降低胞 质成分对染色的负面影响。
[0022] 2、本发明中，样品制备流程的优化有效的减少了上机测试中杂峰的出现，提高了 检测结果的精确性、准确性和稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图 1 :实施例 1 中，突光微球（Flow-Check? Fluorospheres)校准图。
[0024] 图2 :实施例1中，甘菊（C. lavandii lifolium)叶部照片及流式细胞仪分析结果。
[0025] 图3 :实施例1中，异色菊（C. dichrum)叶部照片及及流式细胞仪分析结果。
[0026] 图4 :实施例1中，亚菊（C. glabriuscii Ium)叶部照片及及流式细胞仪分析结果。
[0027] 图5 :实施例1中，毛华菊（C. vestitum)叶部照片及及流式细胞仪分析结果。
[0028] 图6 :实施例1中，朝鲜菊叶部照片及流式细胞仪分析结果。
[0029] 图7 :实施例1中，日本雏菊叶部照片及流式细胞仪分析结果。
[0030] 图8 :实施例1中，紊蒿叶部照片及流式细胞仪分析结果。
[0031] 图9 :实施例1中，紫花野菊（C. zawadskii)叶部照片及流式细胞仪分析结果。
【具体实施方式】
[0032] -种适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，包括以下步骤：
[0033] 第一步、裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染 色的菊花细胞核。
[0034] 具体来说，该步骤具体包括以下操作：
[0035] A、取菊花叶片，放入盛有预冷的细胞裂解缓冲液的培养皿（优选直径为6cm)中， 将菊花叶片用锋利的刀片在Imin内切为碎片；
[0036] 菊花种类为：甘菊、异色菊、亚菊、毛华菊、朝鲜菊、日本雏菊、紊蒿、紫花野菊；菊 花叶片选取菊花未开花植株上部新生幼嫩叶片；
[0037] 菊花叶片和细胞裂解缓冲液的质量体积（w/v)比为1-10 :100(比如为1:100、 2:100、3:100、4:100、5:100、6:100、7:100、7. 5:100、8:100、9:100、10:100 等中任意或任意 两者之间的范围，优选为5:100)，该质量体积比（w/v)的含义为：菊花叶片的质量与胞裂解 缓冲液的体积之间的比例；
[0038] 细胞裂解缓冲液是以LB01(Dolez V el et al. (1989))裂解液为基础加入15mM 的MOPS替换Tris，并加入1% (w/v)的pvp-10、0.1% (v/v)的￠-巯基乙醇，调PH值为 7. 5。LBOl 裂解液的组分为：15mM 的 Tris，2mM 的 Na2EDTA, 0? 5mM 的 spermine. 4HC1，80mM 的 KC1，20mM 的 NaCl，0. 1% (v/v)的 TritonX-100, pH 8. 0 ;
[0039] 改进之后，本发明的细胞裂解缓冲液包括以下组分：
[0040] 15mM 的 MOPS，2mM 的 Na2EDTA, 0? 5mM 的 spermine. 4HCL，80mM 的 KCl，20mM 的 NaCl， 0-1% (v/v)的 TritonX-100,0-1% (w/v)的 pvp-10,0-0.2% (v/v)的 巯基乙醇，pH 7. 5 ；
[0041] 以上组分中，TritonX-100的体积百分比可以为0? 01%、0. 02%、0. 03%、0. 04%、 0. 05%,0. 75%,0. 08%,0. 09%,0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 4%,0. 5%,0. 6%,0. 7%,0. 75%, 0. 8%、0. 9%、1%等中任意或任意两者之间的范围；该体积百分比为：配制细胞裂解缓冲 液时，加入的TritonX-100的体积与得到的细胞裂解缓冲液的体积之间的百分比。
[0042] pvp-10 的质量体积百分比可以为 0? 01 %、0? 02 %、0? 03 %、0? 04 %、0? 05 %、 0. 75 %,0. 08 %,0. 09 %,0. 1 %,0. 2 %,0. 3 %,0. 4%,0. 5 %,0. 6 %,0. 7 %,0. 75%,0. 8%, 0.9%、1%等中任意或任意两者之间的范围；该质量体积百分比（w/v)为：配制细胞裂解缓 冲液时，加入的pvp-10的质量与得到的细胞裂解缓冲液的体积之间的百分比。
[0043] P -巯基乙醇的体积百分比可以为0? 01 %、0? 02 %、0? 03 %、0? 04 %、0? 05 %、 0. 75%、0. 08%、0. 09%、0. 1%、0. 13%、0. 15%、0. 18%、0. 2%等中任意或任意两者之间的 范围；该体积百分比为：配制细胞裂解缓冲液时，加入的￠-巯基乙醇的体积与得到的细胞 裂解缓冲液的体积之间的百分比。
[0044] 细胞裂解缓冲液配制完成后，再滤膜过滤，于4°C保存。
[0045] 细胞裂解缓冲液选择上述组分是因为：
[0046] 上述MOPS和Tris均为有机缓冲液，有利于DNA的荧光染料染色；但MOPS的pKa 值为7. 2, Tris的pKa值为8. 1，MOPS在该细胞裂解缓冲液中的缓冲能力好于Tris ;
[0047] 上述Na2EDTA为螯合剂用来结合二价阳离子（常作为DNase的辅酶因子），防止 DNA被降解；
[0048] 上述四盐酸精胺（spermine. 4HCL)为核染色质稳定剂，作用在于保持DNA的完整 性；
[0049] 上述聚乙二醇单辛基苯基醚（TritonX-IOO)为非离子去污剂有利于细胞核的释 放并阻止其凝集；
[0050] 上述KCl、NaCl为无机盐用来保持缓冲液稳定的离子强度；
[0051] 上述聚乙烯批咯烧酮（average mol wt 10, 000，平均分子量为10,000) (PVP-10) 为高分子化合物，主要作用在于减少多酚类物质和其他次生代谢物如丹宁酸对于DNA荧光 染色的影响，并有效地减少菊花样品中次生代谢物造成的峰图质量较差的问题；
[0052] P _巯基乙醇（P-mercaptoethanol)为有机化合物，主要作用是作为还原剂阻止 蛋白质氧化和高分子聚合物，有效地阻止菊花样品处理中易氧化的现象；
[0053] 上述细胞裂解缓冲液由于采用了合适的试剂配制，各种组分协同作用，有效地去 除菊花完整的细胞核中残留的胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集；并保 护DNA不被降解；并提供适合的环境用来进行专一的核DNA化学染色，有效地降低胞质成分 对染色的负面影响。
[0054] B、再向碎片中加入预冷的细胞裂解缓冲液，释放细胞核，得到细胞核悬浮液。
[0055] C、将细胞核悬浮液用300目尼龙网过滤，得到细胞核滤液，再将细胞核滤液转移 至塑料离心管。
[0056] D、将细胞核滤液于4°C转速900-3000rpm进行离心处理3-10min，弃上清保留沉 淀，该沉淀即为待染色的细胞核；
[0057] 以上离心处理的转速可以为 900rpm、lOOOrpm、1300rpm、1500rpm、1700rpm、 2000rpm、2300rpm、2500rpm、2800rpm、3000rpm等中任意或任意两者之间的范围；以上离心 处理的时间可以为 3min、4min、5min、6min、7min、7. 5min、8min、9min、10min 等中任意或任 意两者之间的范围，优选为5min。
[0058] 第二步、染色步骤：用荧光染料对待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞 核。
[0059] 选用PI染色液作为荧光染料，该PI染色液是浓度为50 iig/ml的碘化丙啶 (propidium iodide)的水溶液，该PI染色液中还含有终浓度50ii g/ml的Rnase A。
[0060] 具体来说，该步骤具体包括以下操作：
[0061] 向待染色的细胞核中加入的PI染色液，混匀；再于4°C黑暗处放置5-40min (比如 为 5min、lOmin、15min、20min、25min、30min、35min、40min 等任意值或两个任意两者之间的 范围），使PI染色液定量地与菊花DNA结合，得到染色的细胞核。
[0062] 第一、二步骤的样品制备流程的优化有效的减少了上机测试中杂峰的出现，提高 了检测结果的精确性、准确性和稳定性。
[0063] 第三步、检测步骤：将染色后的细胞核在流式细胞仪中进行检测和分析。
[0064] 具体来说，该步骤具体包括以下操作：上机检测中，先进行荧光微球校准，再检测 细胞核的染色量，再利用软件分析样品基因组的大小。
[0065] 突光微球为Co ii Iter Flow-Check? Fluorospheres，的校准为用488激光线性检 测荧光微球HPCV〈3%;流式细胞仪的仪器型号：Cell Lab Quanta?SC(Beckman Coulter);
[0066] 参数设置：488nm激发光，电压：4. 52V，激光功率：22mw，FL2激发光收集通道；流 速：30-50个细胞/s ;
[0067] 采用Quanta SC软件对各个样品的染色体大小进行分析。
[0068] 上述 Tris, Na2EDTA, spermine. 4HC1, KC1, NaCl, TritonX-100, pvp-10 等化学试剂 购自Sigma-Aldrich公司，染色用propidium iodide购自Sigma-Aldrich公司，校准用突 光微球Coulter Flow-Check? Fluorospheres购自贝克曼库尔特公司，所述仪器Cell Lab QuantaTMSC购自贝克曼库尔特公司；操作过程中使用的刀片、6cm培养皿、300目尼龙网购 自江晨宏伟生物技术公司。
[0069] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不 用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0070] 实施例1 :
[0071] 一种适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，包括以下步骤：
[0072] (1)、取菊花叶片50mg，放入滴有Iml的预冷的细胞裂解缓冲液的培养皿中，将菊 花叶片用吉列双面刀片在Imin内切为碎片；
[0073] 菊花的种类为：甘菊、异色菊、亚菊、毛华菊、朝鲜菊、日本雏菊、紊蒿、紫花野菊； 菊花叶片选取菊花未开花植株上部新生幼嫩叶片；
[0074] 细胞裂解缓冲液的组分为：
[0075] 15mM 的 MOPS，2mM 的 Na2EDTA, 0? 5mM 的 spermine. 4HCL，80mM 的 KCl，20mM 的 NaCl， 0.1<%(￥/￥)的1'1'；[1：011)(-100，1(%(￥/￥)的卩￥卩-10,0.1 (%(￥/￥)的6-巯基乙醇，卩117.5;
[0076] (2)、再向碎片中加入Iml预冷的细胞裂解缓冲液，释放细胞核，得到细胞核悬浮 液；
[0077] (3)、将细胞核悬浮液用300目尼龙网过滤，得到细胞核滤液，再转移至一次性2ml 塑料离心管；
[0078] (4)、将细胞核滤液于4°C转速1300rpm进行离心处理5min，弃上清保留沉淀，该沉 淀即为待染色的细胞核；
[0079] (5)、向待染色的细胞核中加入400 ill的PI染色液，混匀；再于4°C黑暗处放置 IOmin,得到染色的细胞核；
[0080] (6)、将染色的细胞核在流式细胞仪中进行检测和分析。
[0081] 具体来说，该检测和分析步骤具体包括以下操作：
[0082] 上机检测中，先进行荧光微球校准，再检测细胞核的染色量，再利用软件分析样品 基因组的大小。
[0083] 突光微球为Co ii Iter Flow-Check? Fluorospheres，的校准为用488激光线性检 测荧光微球HPCV〈3% ;图1为荧光微球（Flow-Check? Fluorospheres)校准的结果：
[0084]
【权利要求】
1. 一种适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： 裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染色的细胞 核； 染色步骤：对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。
2. 根据权利要求1所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所述菊 花的种类为甘菊、异色菊、亚菊、毛华菊、朝鲜菊、日本雏菊、紊蒿、紫花野菊。
3. 根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所 述菊花组织样品为菊花未开花植株上部的新生幼嫩叶片。
4. 根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所 述裂解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：15mM的MOPS缓冲液，2mM 的乙二胺四乙酸二钠，0. 5mM的四盐酸精胺，80mM的氯化钾，20mM的氯化钠，0-1% (v/v)的 聚乙二醇单辛基苯基醚，0-1% (w/v)的平均分子量为10000的聚乙烯吡咯烷酮，〇-〇. 2% (v/v)的P -巯基乙醇；所述细胞裂解缓冲液的pH值为7. 5。
5. 根据权利要求4所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所述裂 解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：15mM的MOPS缓冲液，2mM的 乙二胺四乙酸二钠，0. 5mM的四盐酸精胺，80mM的氯化钾，20mM的氯化钠，0. 1% (v/v)的聚 乙二醇单辛基苯基醚，1% (w/v)的平均分子量为10000的聚乙烯吡咯烷酮，〇. 1% (v/v)的 3 -巯基乙醇；所述细胞裂解缓冲液的pH值为7. 5。
6. 根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所 述裂解步骤的离心处理中，转速为900-3000rpm rpm，温度为4°C，时间为3-10分钟。
7. 根据权利要求6所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所述裂 解步骤的离心处理中，转速为1300rpm rpm，温度为4°C，时间为10分钟。
8. 根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所 述染色步骤的染色处理中，采用的染色液包括如下组分：50li g/ml的Rnase A，50ii g/ml的 碘化丙啶。
9. 根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所 述染色步骤中的染色处理中，将所述待染色的细胞核中加入染色液后混匀，再于4°C黑暗处 放置5-40分钟。
10. 根据权利要求9所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：所述染 色步骤中的染色处理中，将所述待染色的细胞核中加入染色液后混匀，再于4°C黑暗处放置 10分钟。
【文档编号】G01N1/28GK104374617SQ201410553962
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】罗昌, 陈东亮, 黄丛林, 程曦, 梁宏霞, 苏国辉, 黄敦辉 申请人:北京农业生物技术研究中心