Ndm-1 锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了NDM-1锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用，具体是设计锁核酸修饰探针，固定在电极表面为特异性探针，其中锁核酸探针的5’端修饰有巯基，通过Au-S键的化学键合可将其固定到电极表面，锁核酸探针与目标基因的部分序列相互补，本发明获得的电极为多重耐药菌的检测提供了全新思路和检测手段。
【专利说明】NDM-I锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于电化学检测领域，具体涉及NDM-I锁核酸（Locked nucleic acid,LNA) 探针修饰电极，还涉及该电极的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前研究报道的传感器表面固定的大多是DNA探针，存在诸多缺点。探针长度一 般为20个碱基左右，DNA探针与较长的祀序列杂交时，结合力不高，碱基错配识别能力低。 另外，由于单链DNA无法与未解旋的双链祀序列直接结合，所W待检测的标本需经PCR扩增 后才能与之反应。同时，NDM-I探针的反应受离子强度的影响，酸性或碱性环境中DNA固定 数量最多，而中性条件下杂交效果最好，固定双链探针比固定单链探针时杂交效果好，分析 原因可能是单链固定时会对杂交产生更大的空间障碍。众多的研究者均未能很好地解决上 述问题，从而无法提高DNA探针的特异性。而LNA的出现是解决W上问题的理想途径。
[0003] 锁核酸是一种新型、特殊的双环状寡核巧酸衍生物，含有一个或多个 2' -0, 4' -C-亚甲基-B-D-巧喃核糖核酸单体，结构中核糖的2' -0, 4' -C位通过不同的缩水 作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，连接成环形，巧喃糖的结构锁定在C3内 型的N构型，形成了刚性的缩合结构，降低了核糖体构象的可塑性，增强了磯酸盐骨架局部 结构的稳定性，从而形成刚性缩合结构。相比其他寡核巧酸，LNA具有诸多优势；（1)和DNA、 RNA互补的双链有很强的热稳定性；（2)抗3'脱氧核巧酸酶降解的稳定性；（3)LNA-DNA杂 交物能激活RNaseH ; (4)与RNA/DNA杂交时，具有较强的碱基错配识别力；(6)水溶性好； (7)高效的自动寡聚化作用，合成方法简单。
[0004] NDM-I多重耐药菌是指携带NDM-I耐药基因的细菌。NDM-I耐药酶其全称是"新德 里金属-目-内醜胺酶"，是一种高效耐药酶。研究显示，抗生素滥用是NDM-I出现的首要原 因，目前DM-I多重耐药菌正在全球快速传播，其感染病例在全球均有分布，死亡率高。多重 耐药菌所带来的风险越来越大，防控形势极为严峻，该类细菌对几乎所有抗生素都具有抗 药性。NDM-I耐药基因可W在细菌之间传播，从而使对抗生素敏感的细菌获得耐药性。因 此，研发NDM-I直接快速特异的检测方法，具有重要意义。
[0005] 目前，NDM-I多重耐药菌的诊断主要包括筛查、表型确认和基因确证等3个步骤。 表型筛查是在细菌药物敏感性测定中，W美洛培南或亚胺培南纸片法化-B法）或最低抑菌 浓度0OC)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查；表型确认是采用双纸片协同实 验或亚胺培南（美洛培南）/邸TA复合纸片，进行K-B法药敏试验来判定产金属酶；基因确 证是采用NDM-I的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-I基因。 但该些诊断方法存在着费时烦琐、敏感性和特异性较低及检测成本高等缺陷。
[0006] 电化学DNA生物传感器具有分析时间短、设备微型化、特异性强、灵敏度高、检测 限低、使用简单W及成本低廉等显著优点。目前电化学生物传感器的研究主要是致力于提 高传感器的特异性和灵敏度，而特异性和灵敏度在很大程度上受探针与互补链间的相互作 用影响，因此，利用LNA探针提高电化学生物传感器的特异性是检测NDM-I的基因的关键。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供NDM-I锁核酸探针修饰电极；本发明的目 的之二在于提供所述NDM-I锁核酸探针修饰电极的制备方法；本发明的目的之H在于提供 含有检测NDM-I的电化学生物传感器；本发明的目的之四在于提供所述NDM-I锁核酸探针 修饰电极或所述电化学传感器的应用；本发明的目的之五在于提供利用所述检测NDM-I的 电化学生物传感器检测NDM-I基因的方法。
[000引为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 1、NDM-I锁核酸探针修饰电极，所述电极是在金电极表面固定5'端修饰琉基的 NDM-ILNA探针，最后封闭非特异性吸附位点而得。
[0010] 优选的，所述5'端修饰琉基的NDM-I锁核酸探针的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所 /Jn O
[0011] 2、所述NDM-I锁核酸探针修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
[001引 a.将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用；
[0013] b.向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含5'端修饰琉基的NDM-I LNA探针的溶 液，修饰后用琉基己醇溶液封闭，超纯水清洗得NDM-I锁核酸探针修饰电极。
[0014] 优选的，步骤a是将金电极分别用0. 3 U m、0. 05 U m的Al2〇3粉末打磨抛光，每次打 磨后用水洗净，再分别于硝酸、丙丽和超纯水中各超声洗涂，干燥，备用。
[0015] 优选的，步骤b是向步骤a所得清洁的金电极表面滴加5'端修饰琉基的NDM-I LNA 探针浓度为0. 5?2. 5 y M的溶液，固定后用浓度为Immol/L的琉基己醇溶液封闭，清洗得 NDM-I锁核酸探针修饰电极。
[0016] 更优选的，所述5'端修饰琉基的NDM-I LNA探针的浓度为1. 5 y M。
[0017] 更优选的，5'端修饰琉基的NDM-I LNA探针固定的条件为37C下恒温1小时。
[0018] 3、检测NDM-I的电化学生物传感器，包括工作电极、对电极、参比电极和为测试底 液；所述工作电极为所述NDM-I锁核酸探针修饰电极，所述对电极为笛电极，所述参比电极 为饱和甘隶电极，所述为测试底液为抑7.4的含2111111〇1/11(3化佑脚6-1(4。6化脚6和5111111〇1/1 KCl的PBS溶液。
[0019] 4、所述NDM-I锁核酸探针修饰电极或所述检测NDM-I的电化学生物传感器在检测 NDM-I基因中的应用。
[0020] 5、利用所述检测NDM-I的电化学生物传感器检测NDM-I基因的方法，包括如 下步骤：将NDM-I锁核酸探针修饰电极与样品溶液杂交后，然后W NDM-I锁核酸探针修 饰电极为工作电极，笛电极为对电极，饱和甘隶电极为参比电极，pH 7.4的含2mmol/L KjFe (CN) e-K/e (CN) e和5mmol/L KCl的PBS溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用 循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-0. 3V?0. 7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂 交前后峰电流变化检测NDM-I基因。
[0021] 本发明的有益效果在于：本研究利用锁核酸的高特异性，针对NDM-I全基因组，设 计针对NDM-I基因的LNA，将NDM-I LNA探针固定在金电极后获得NDM-I锁核酸探针修饰 电极，然后与电化学技术相融合获得检测NDM-I基因的电化学生物传感器，从而构建检测 NDM-I基因的技术平台，为多重耐药菌的检测提供简单、快速、灵敏、特异的检测工具。
【专利附图】
【附图说明】
[002引为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[002引 图1为不同修饰电极的循环伏安图。a ;裸电极在抑7. 4含有2mmol/L K3Fe(CN)e-K/e(CN)e和5mmol/L KCl的PBS中循环伏安曲线；b ;电极表面修饰LNA探针后在 pH 7. 4 含有 2mmol/L Kg化（CN)e-K/e(CN)6 和 5mmol/L KCl 的 PBS 中循环伏安曲线；C ;LNA 探针修饰、琉基己醇封闭后的电极在抑7. 4含有2mmol/L K3化(CN) e-K4Fe (CN) e和5mmol/L KCl的PBS中循环伏安曲线；d ;检测液中加入NDM-I祀序列后，电极在抑7. 4含有2mmol/ L KsFe(We-KJeKN)B和5mm0l/L KCl的PBS中循环伏安曲线；e ;裸电极在抑7. 4不含 2mmol/L K3Fe(CN)e-K/e(CN)e 和 5mmol/L KCl 的 PBS 中的循环伏安曲线。
[0024] 图2为不同浓度探针修饰电极的循环伏安图。
【具体实施方式】
[0025] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0026] 本发明的思路是利用锁核酸的高特异性，针对NDM-I全基因组，设计并合成NDM-I LNA探针，并在LNA探针5'端修饰琉基，NDM-I LNA探针的序列为5' -SH-(Og。-gcttttggt K￡ct￡cctgat-3'(甜代表琉基基团，下划线部分碱基经锁核酸修饰）（SEQ ID NO. 1)，将LNA 技术与电化学技术相融合创建了用于检测NDM-I基因的电化学DNA生物传感器。具体方法 是；先设计针对NDM-I全系列的特异性LNA探针，并在LNA探针5'端修饰有琉基，利用Au-S 键的化学键合可将锁核酸探针固定到电极表面；检测时利用特异性探针与目标基因的部分 序列相互补，当杂交溶液中含有目标基因时，特异性探针与其对应的互补序列杂交形成复 合物，该复合物在电极表面发生还原-氧化反应，从而产生电化学信号；如果杂交溶液中不 含目标序列，则与特异性锁核酸探针不能发生杂交反应，所检测的目标基因无法通过杂交 修饰到电极表面，其产生电化学信号的强度很弱，同时还可W通过检测电流信号大小来判 断互补序列与错配序列。
[0027] 实施例1
[0028] NDM-I锁核酸探针修饰电极的制备方法，包括如下步骤：
[002引 a.金电极的清洗：取直径为3mm的金电极，分别用0. 3 y m、0. 05 U m的AI2O3粉末 打磨抛光成镜面，每次打磨后均用超纯水冲洗，再分别于硝酸、丙丽及超纯水中各超声洗涂 Smin，干燥，得清洗的金电极，备用。
[0030] b. LNA探针的固定；取20 y L 5'端修饰琉基的浓度为1. 5 y mol/L的NDM-I LNA 探针溶液滴加于已清洗的金电极表面，然后于37C下恒温箱中恒温1小时，使锁核酸通过 Au-S键的化学键合将其修饰到电极的表面，再将电极浸入浓度为Immol/L的琉基己醇溶 液中封闭非特异性吸附位点1小时，封闭后用水清洗电极，即得锁核酸修饰NDM-I探针的 NDM-I电极，4°C避光保存备用。
[0031] C.杂交反应：将NDM-I LNA探针修饰电极分别浸泡在150 y 1终浓度为100 y g/L 的NDM-I祀序列溶液（pH7. 40. Imol/L PB巧中，于37°C恒温杂交45分钟。
[0032] 实施例2、组建检测NDM-I的电化学生物传感器
[0033] W NDM-I锁核酸探针修饰电极作为工作电极，饱和甘隶电极为参比电极，笛电极 作为对电极组建检测NDM-I的电化学生物传感器。将制备好的电化学传感器联入电化学工 作站，W pH 7. 4 的含 2mmol/L KjFe (CN) e-K/e (CN) e，Smmol KCl 的 PBS 为测试底液，然后在 室温下利用循环伏安法进行扫描测定，工作电位为-0. 3V?0. 7V，扫描速度为50mV/s。检测 NDM-I的电化学生物传感器的检测原理为：利用NDM-I锁核酸探针修饰电极表面发生杂交 反应后，生成的杂交复合物阻碍了电极表面的电子传递，使传感器响应电流变化值增大。该 信号变化的大小A I与杂交反应的程度呈正相关，A I值越大，表明与电极表面固定的LNA 探针结合的检测物越多。NDM-I锁核酸探针修饰电极测定的初始还原峰电流记为I。；当核 酸杂交反应结束后，测定的还原峰电流并记为I ;则峰电流在核酸杂交反应前后变化A I = I - I。。W下W此原理为依据对NDM-I进行检测。
[0034] 实施例3、检测NDM-I锁核酸探针修饰电极的电化学特性
[0035] 利用循环伏安法表征电极在修饰及检测过程中的电化学特性，具体检测方法为： 将不同阶段的电极按实施例2的方法组建电化学生物传感器后，分别将电极浸泡在150 U L NDM-I祀序列终浓度为100 y g/L的溶液（pH7. 40. Imol/L磯酸盐溶液）中，在37C恒温箱 中杂交45分钟。杂交过程中传感器采用H电极体系测量传感器电流，获得的循环伏安曲线 如图1所示。
[003引其中，曲线a为裸金电极在抑7. 4含有2mmol/L Ks [Fe (CN) 6] /? [Fe (CN) 6] 和5mmol/l KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，在PBS溶液中加入了氧化还原探针 IUFeKN)6]/KJFeKN)6]，所W循环伏安曲线出现了一对准可逆的氧化还原峰；曲线b为 NDM-I 锁核酸探针修饰电极在抑7. 4 含有 2mmol/L Ks [Fe (CN) e] /? [Fe (CN) e]和 5mmol/ I KCl的PBS溶液中的循环伏安曲线，由于锁核酸探针的磯酸骨架带负电荷，溶液中的 [Fe (CN) 6] 3-同样带有负电荷，同种电荷相排斥，导致[Fe (CN) 6] 3-的电子在金电极表面传递 速度减慢，在一定程度上阻碍了溶液中导电离子在电极表面的电子传递，因此氧化还原峰 的峰电流值有所降低，当LNA探针修饰电极后，为了防止LNA"倒伏"在电极表面而出现非特 异吸附，而采用琉基己醇封闭非特异性吸附位点；曲线C为琉基己醇封闭后的循环伏安曲 线，可见琉基己醇在封闭非特异性吸附位点的同时也阻碍了电子的传输，因此峰电流值进 一步减小；曲线d为NDM-I锁核酸探针修饰电极与含100 y g/L的NDM-I的溶液反应后的循 环伏安曲线，由于电极表面的杂交复合物是没有电活性的生物大分子，进一步阻碍了电极 表面的电子传输，与曲线C相比，氧化还原峰的峰电流在赔育前后响应电流明显降低；曲线 e为锁核酸修饰NDM-I探针的NDM-I电极在抑7. 4不含2mmol/L Ks[Fe (CN) e] /? [Fe (CN) e] 和5mmol/l KCl的PBS中的循环伏安曲线，由于体系中缺少氧化还原活性物质，在-0. 3V? 0. 7V扫描范围内，LNA探针修饰电极在PBS溶液中未出现明显的氧化还原峰。W上实验结 果表明，NDM-I锁核酸探针修饰电极能够检测NDM-I祀序列，并且组建的检测NDM-I的电化 学生物传感器也能检测NDM-I祀序列。
[0037] -个检测周期结束后，再进行下一个LNA浓度的检测，操作步骤同上。通过检测反 应前后响应电流的变化，检测终浓度分别为0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 y mol/L探针溶液进行 杂交反应所引起的A I及反应所需时间。实验重复3次取平均值，W验证传感器的重复性。
[0038] 实施例4、LNA探针最佳浓度的优化
[0039] 为了确定LNA探针的最佳浓度，本实施例对LNA的浓度进行了优化实验。首先将 LNA探针溶液配制成浓度分别为0. 5 y M、I. O y M、I. 5 y M、2. O y M、2. 5 y M的溶液，然后分别 将它们修饰于金电极表面，制备成不同浓度NDM-I锁核酸探针修饰电极，并测定其循环伏 安响应电流，实验结果见图2所示。结果显示，修饰LNA探针前后电极的循环伏安曲线有明 显改变，说明探针已成功固定于电极上。从图2还可W看出，LNA修饰的电极的电流响应变 化值随LNA探针浓度的增大呈先增大后下降的趋势，当LNA探针浓度由0. 5 y M依次增至 1. 5 y M时，响应电流变化值呈上升的趋势；而当LNA探针浓度从1. 5 y M递增至2. 5 y M时， 响应电流变化值则呈递减趋势；其中，当LNA探针浓度为1. 5 y M时，传感器的响应电流变化 值最大。因此，LNA探针的最佳浓度为1. 5 y M。
[0040] 实施例5、NDM-I电化学生物传感器的灵敏度和特异性试验
[0041] 为了证实LNA探针的高特异性，选用LNA探针和DNA探针分别与几种不同匹配程 度的祀序列进行杂交反应，具体序列如下（下划线部分碱基为错配碱基）：
[0042] (1)完全匹配（Tl) ;5,-atcaggcagccaccaaaagc-3，（SEQ ID NO. 2);
[0043] (2) 一个碱基错配（T2) ;5' -atca￡gcagccaccaaaagc_3'（SEQ ID NO. 3);
[0044] (3) H个碱基错配订3) ;5' -atcaccgagccaccaaaagc-3' (SEQ ID NO. 4)；
[0045] (4)五个碱基错配（T4) 5' -atcaccgtcccaccaaaagc-3' (SEQ ID NO. 5)；
[0046] 上述四种不同祀序列，在最佳反应条件下，分别与固定在电极表面上的LNA及DM 探针进行杂交反应，比较几种不同情况下的电流变化差值A I之间的差异。结果显示，当与 完全互补的祀序列（Tl)杂交时，所引起的A I (峰电流变化差值）为11. 33 + 0. 47 uA，而 DNA探针杂交反应所引起的A I为10. 27 + 0. 40 uA，二者相比具有显著性差异（P<0. 05)。 当祀序列有一个碱基错配（T2)时，LNA杂交所引起的A I值骤降至3. 37 + 0. 15 uA，而DNA 探针杂交反应引起的A I值仍有9. 06 + 0. 49 y A，二者相比具有非常显著性差异（P<0. 01)。 当祀序列有H个碱基错配（T3)时LNA与祀序列结合峰电流的变化值极小，为0. 7 y A，但 DNA探针的A I值却仍有6. 90 + 0. 36 uA，二者相比具有非常显著性差异（P<0. 01)。当祀 序列有五个碱基错配（T4)时LNA已无法与祀序列结合而检测不到峰电流的变化，但DNA探 针的A I值却仍有2. 26 + 0. 21 y A，二者相比具有非常显著性差异（P<0. 01)。LNA与对应的 NDM-I探针相比，其特异性明显增强。产生上述结果的原因是LNA与核酸分子结合力强、特 异性高，且LNA/DNA、LNA/RNA的结合较DNA/DNA、DNA/RNA的杂交分子具有更高的热稳定性。 因此LNA与核酸序列的结合有着极高的特异性，LNA能够区分正确配对及错配的序列，LNA 对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低，本实施例中用LNA分别与祀序列杂交 时，发现与不同的祀序列发生杂交反应所引起的峰电流变化有显著差异，当与错配H个碱 基的祀序列杂交，基本检测不到峰电流的改变，和上述理论基本符合，说明LNA对碱基错配 的识别能力强，用LNA作探针可大大提高核酸杂交检测的特异性，同时由于LNA本身所具有 的优越性，与普通的LNA相比可结合更多的祀序列，在一定程度上也可提高反应的灵敏度。 两种探针与不同互补程度的祀序列杂交反应实时检测结果见表1。
[0047] 表1、LNA和DNA探针与完全匹配及错配的祀序列杂交反应结果P±S.D.)
[0048]
【权利要求】
1. NDM-1锁核酸探针修饰的电极，其特征在于，所述电极是在金电极表面固定5'端修 饰疏基的NDM-1LNA探针，最后用疏基乙醇封闭非特异性吸附位点而得。
2. 根据权利要求1所述NDM-1LNA探针修饰的电极，其特征在于：所述5'端修饰巯基 的NDM-1锁核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 权利要求1或2所述NDM-1LNA探针修饰电极的制备方法，其特征在于：包括如下步 骤： a. 将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用； b. 向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含5'端修饰巯基的NDM-1LNA探针溶液，修饰 完成后用巯基己醇溶液封闭，超纯水清洗得NDM-1LNA探针修饰电极。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤a是将金电极分别用0. 3 μ m、 0. 05 μ m的A1203粉末打磨抛光，每次打磨后用超纯水洗净，再分别于硝酸、丙酮和超纯水中 各超声洗涤，干燥，备用。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤b是向步骤a所得清洁的金电 极表面滴加5'端修饰巯基的NDM-1LNA探针，浓度为0. 5?2. 5 μ Μ的溶液，修饰后用浓度 为lmmol/L的巯基己醇溶液封闭，清洗得NDM-1LNA探针修饰电极。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述5'端修饰巯基的NDM-1LNA探 针的浓度为1. 5 μ M，所述锁核酸的浓度为1. 5 μ M。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：5'端修饰巯基的NDM-1LNA探针固定 的条件为37°C下恒温1小时。
8. 检测NDM-1的电化学生物传感器，其特征在于：包括工作电极、对电极、参比电 极和测试底液；所述工作电极为权利要求1或2所述NDM-1LNA探针修饰电极，所述对 电极为钼电极，所述参比电极为饱和甘萊电极，所述为测试底液为pH7. 4的含2mmol/ LK3Fe (CN) 6-K4Fe (CN) 6 和 5mmol/L KC1 的 PBS 溶液。
9. 权利要求1?2任一项所述NDM-1LNA探针修饰电极或权利要求8所述检测NDM-1 的电化学生物传感器在检测NDM-1基因中的应用。
10. 利用权利要求8所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法，其 特征在于，包括如下步骤：将NDM-1LNA探针修饰电极与样品溶液杂交后，然后以NDM-1LNA 探针修饰电极为工作电极，钼电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，PH7. 4的含2mmol/ LK3Fe (CN) 6-K4Fe (CN) 6和5mmol/L KC1的PBS溶液为测试底液构建电化学生物传感器，采用 循环伏安法进行扫描测定，电位扫描范围为-〇. 3V?0. 7V，电位扫描速率为50mv/s，根据杂 交前后峰电流变化检测NDM-1基因。
【文档编号】G01N27/327GK104237353SQ201410557136
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】张立群, 王云霞, 府伟灵 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院