一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法
【专利摘要】本发明提供一种液相色谱-串联质谱法LC-MS/MS检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的分析方法，包括以下步骤：1）配制提取溶剂；2）新鲜烟叶液氮速冻，冷冻干燥并粉碎；3）粉碎好的样品加入提取溶剂，低温超声提取；4）冷冻离心，取上清液并过滤；5）LC-MS/MS进行检测。其优点在于：前处理方法简单，只需超声并过滤，无需固相萃取柱纯化处理，与现有的方法相比，本发明中所采用的LC-MS/MS法，灵敏度高，精密度好，加标回收率高，100个样品前处理耗时小于2小时，而现有文献中所述方法前处理繁琐费时，100个样品处理约需3天。因此，本发明方法能有效地提高分析效率，适合复杂基质中低含量目标物的分析。
【专利说明】一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉 酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及烟草代谢组学新鲜烟叶样品中激素的研究，具体是一种液相色谱-串 联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法。
【背景技术】
[0002] 脱落酸和茉莉酸是植物体内两种重要的生理活性物质，在烟草植物的次级代谢、 胁迫耐受和信号转导中行使功能，从而影响烟草的生长发育和烟叶的品质。因此，精确可靠 地对痕量的脱落酸和茉莉酸进行定性、定量分析具有重要的意义。
[0003] 已有文献报道采用固相萃取-液相色谱/质谱法同时测定新鲜植物叶片中的脱落 酸和茉莉酸。（1)50 mg植物样品在液氮中研磨成粉末，加入1 mL 80%甲醇提取溶剂；（2) 超声提取30 min，10000 rpm冷冻离心10 min，取出上清液；（3)向上清液加入600 μ L三 次水，涡旋混匀；（4)将混合液通过一装填有200 mg键合硅胶的小柱进行SPE萃取、富集。 具体步骤如下：①活化吸附剂：按照先后顺序分别用5 mL甲醇，5 mL 20%甲醇活化吸附剂； ②上样：将混合液倒入活化后的SPE小柱，抽真空，调整真空度，使混合液以1滴/s的速度 通过SPE小柱；③清洗：依次用2 mL 50 mM甲酸铵溶液、3 mL三次水、2 mL 20%甲醇清洗 SPE小柱；④解吸：用5 mL含2%甲酸的乙腈将目标物从SPE小柱上解吸下来，用10 mL离 心管在出口端收集。解吸液于35 °C下氮气吹干后，用5%乙腈定容至800 μ L，取720 μ L 注入RPLC-MS/MS系统进行分析。此方法样品前处理十分繁琐，耗时长，不利于分析效率的 提高。因此，建立一种快速、灵敏的检测新鲜植物叶片中的脱落酸和茉莉酸的检测方法十分 必要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的正是针对现有技术中脱落酸和茉莉酸的测定方法前处理繁琐费时 的问题，提供一种简便的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下方式技术方案来实现的：本发明的检测方法采用提取 溶剂低温超声萃取，通过液相色谱-串联质谱联用仪实现新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的测 定，其具体步骤如下： 1) 配制提取溶剂：甲醇/水，80/20，ν/ν ; 2) 新鲜烟叶液氮速冻，冷冻干燥，粉碎机打碎； 3) 粉碎好的样品加入提取溶剂和氘代内标，0-10°C低温超声提取； 4) 提取完的样品冷冻离心，取上清液过0.22 μ m微孔滤膜； 5) LC-MS/MS对待测样品中脱落酸和茉莉酸进行检测，其液相色谱、质谱条件如下： Agilent 公司 SB-C18 超高压柱，规格 2.1 mmXlOO mm i.d·，1.8 μπι;柱温 50 °C;流 动相为：A :含0. 001%甲酸的水，B :乙腈；流速：0. 2 mL mirf1 ;梯度洗脱：0 min :80%A+20% 8,0.1?8 11^11:10〇从+90%8,8.1?10 11^11:10〇从+90%8，10.1?12 11^11:80〇从+20%8;进样量：5 μ L〇
[0006] 离子源：电喷雾离子源；负离子扫描；多反应监测；干燥气温度：180°C，干燥气流 量：11 L mirT1，雾化器压力：20 psi ;鞘气温度：400°C，鞘气流量：12 L mirT1，毛细管电压： 2000 V，喷嘴电压：2000 V，驻留时间：50 ms。
[0007] 表1各化合物的定量离子对、定性离子对、保留时间及碰撞能量
【权利要求】
1. 一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方法，其特征在于： 是采用提取溶剂低温超声萃取，通过液相色谱-串联质谱联用实现新鲜烟叶中脱落酸和茉 莉酸的测定，具体步骤如下： 1) 配制提取溶剂：甲醇/水=80/20, v/v ; 2) 新鲜烟叶液氮速冻，冷冻干燥，粉碎机打碎； 3) 粉碎好的样品加入提取溶剂和氘代内标，0-10°C低温超声提取； 4) 提取完的样品冷冻离心，取上清液过0.22 μ m微孔滤膜； 5. LC-MS/MS对待测样品中脱落酸和茉莉酸进行检测，其液相色谱、质谱条件如下： Agilent 公司 SB-C18 超高压柱，规格 2.1 mmXlOO mm i.d·，1.8 μπι;柱温 50 °C;流 动相为：A :含0. 001%甲酸的水，B :乙腈；流速：0. 2 mL mirT1 ;梯度洗脱：0 min :80%A+20% 8,0.1?8 11^11:10〇从+90%8,8.1?10 11^11:10〇从+90%8，10.1?12 11^11:80〇从+20%8;进样量：5 μ L ； 离子源：电喷雾离子源；负离子扫描；多反应监测；干燥气温度：180°C，干燥气流量：11 L mirT1，雾化器压力：20 psi;鞘气温度：400°C，鞘气流量：12 L mirT1，毛细管电压：2000 V，喷嘴电压：2000 V，驻留时间：50 ms。
2. 根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方 法，其特征在于：所述的氘代内标为ABA-d6。
3. 根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方 法，其特征在于：所述的超声提取时间为30 min。
4. 根据权利要求1所述的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中脱落酸和茉莉酸的方 法，其特征在于：在步骤4)离心过程，离心机转速为8000转，离心时间为5 min。
【文档编号】G01N30/06GK104297410SQ201410613361
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】陈霞, 周会娜, 刘萍萍, 陈千思, 金立锋, 翟妞, 郑庆霞, 卢鹏, 王燃, 林福呈 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院