玻璃化冷冻观察装置及其应用的制作方法

本发明涉及一种玻璃化冷冻观察装置及其在玻璃液筛选、组织平衡时间优化中的应用。

背景技术：

组织冷冻保存在生殖医学领域中的应用价值己得到公认，并取得了一些成就，但进展仍然缓慢，其中玻璃化冷冻法最早于2002年应用于在卵巢组织冷冻保存研究中，原理是高浓度冷冻保护液在快速降温时可形成玻璃化液，无细胞内外冰晶形成，更适合冷冻保存结构复杂的人卵巢组织，2013年第一例玻璃化冻存卵巢组织片自体移植后婴儿出生。玻璃液浓度越高，玻璃态越易形成，但随浓度升高其对组织毒性也越大，如何筛选出最适合人卵巢组织的玻璃液配伍及浓度就成为提高人卵巢组织冷冻保存效果的关键步骤；同时人卵巢组织在不同玻璃液中所需的渗透平衡时间也不同，过短无法保证在冷冻过程不受冷冻损伤，过长则会增加玻璃液对组织的化学毒性和渗透毒性，如何快速确定最合适的平衡时间也是提高冷冻效果的重要环节。

目前常用筛选最优玻璃液及组织平衡时间的方法有：①组织形态学分析；②移植后或体外培养性激素水平的测定；③组织细胞内超微结构变化；④组织细胞的凋亡情况；⑤卵泡的增殖发育能力等。这些方法检测周期长，不灵活，不能及时发现玻璃液配伍的问题，极易使后续检测成为无效工作。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明主要解决的技术问题是提供一种玻璃化冷冻观察装置，所述玻璃化冷冻观察装置应用在最优玻璃液筛选和组织平衡时间优化时，可便捷地观察快速冷冻和复融过程中不同玻璃液的玻璃化状态和组织在玻璃液中平衡过程中表面积变化，完成初步玻璃态筛查工作和组织平衡时间的优化及确定，具有快速、简单方便的特点，极大减少无效工作。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种玻璃化冷冻观察装置，包括：

立式显微镜，所述立式显微镜连接拍摄装置，用于观察和拍摄玻璃化冷冻——复融过程及组织在玻璃液中的平衡过程；

设有中空部的隔离盒，置于所述立式显微镜的置物台上，所述中空部呈圆柱形，包括上下相通的第一中空部和第二中空部，且所述第一中空部的直径扩大形成所述第二中空部，使得第二中空部与第一中空部交界处形成环形平台，用于承载观察材料和通过所述立式显微镜置物台下方光线；

培养皿，置于所述隔离盒的第二中空部，用于放置观察材料。

优选地，所述隔离盒呈长方体形，长、宽、高分别为15厘米、15厘米和5厘米。隔离盒长宽的尺寸与立式显微镜置物台（ 热台）面积相匹配，并且大于培养皿的面积；隔离盒高度设置为5厘米，既方便立式显微镜调节焦聚，又不会使培养皿中加入液氮后在显微镜的置物台（ 热台）表面产生水雾。

优选地，所述第一中空部在距离所述隔离盒表面1厘米处直径扩大形成所述第二中空部。即第二中空部的高度为1厘米，该高度与玻璃培养皿的深度相配合，使玻璃培养皿恰好能嵌入第二中空部。

优选地，所述第一中空部的直径为9厘米，所述第二中空部的直径为10.5厘米。第二中空部的直径为10.5cm，方便置入直径10cm透明玻璃培养皿，并且玻璃培养皿侧壁本身的厚度使其置入第二中空部时，能与第二中空部的侧壁紧贴，使得玻璃培养皿不易晃动；此外，第二中空部的直径大于第一中空部的直径，使得第二中空部与第一中空部交界处形成环形平台，这样玻璃培养皿置于第二中空部时，玻璃培养皿的底部置于环形平台上，环形平台可托住玻璃培养皿。

优选地，所述隔离盒由具有耐超低温和保温性能的材料制成。耐超低温和保温性能的材料可以对培养皿中加入的液氮或温水起到一定保温作用。

本发明一方面还提供所述玻璃化冷冻观察装置在玻璃液筛选中的应用，包括以下步骤：

（1）玻璃液快速冷冻观察

A．在所述培养皿中倒入液氮，调节所述立式显微镜的焦距；

B．用内径0.5微米的单精子卵胞浆显微注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）用注射针吸取一定体积待检测玻璃液，置于所述培养皿中标记好的对焦位置；

C．拍摄并记录所述玻璃液的变化，观察指标包括快速冷冻过程中晶体、碎片的形成；

（2）玻璃液复融观察

A．在所述培养皿中倒入37℃水，调节所述立式显微镜的焦距；

B．取出所述液氮中冷冻后的ICSI注射针置于所述培养皿中标记好的对焦位置；

C．拍摄并记录玻璃液变化情况，观察指标包括复融过程中冰晶、去玻璃和再结晶形成情况。

本发明另一方面还提供所述玻璃化冷冻观察装置在组织平衡时间优化中的应用，包括以下步骤：

（1）在所述培养皿中加入一定量的玻璃液；

（2）将组织置于所述玻璃液中，渗透平衡一定时间；

（3）调整焦距，拍摄记录组织表面积变化。

进一步地，在所述步骤（2）之前还包括将所述组织置于等渗磷酸盐缓冲液中的步骤。

具体地，所述玻璃化冷冻观察装置在组织平衡时间优化中的应用，包括以下步骤：

（1）在所述培养皿中加入一定量的玻璃液；

（2）将组织置于等渗磷酸盐缓冲液中；

（3）再将组织移入所述玻璃液中，渗透平衡一定时间；

（4）调整焦距，每间隔一分钟镜下拍照一次，拍摄记录组织表面积变化；

（5）以组织在所述等渗磷酸盐缓冲液中的表面积为百分之百等渗表面积，计算置于所述玻璃液内的组织表面积占等渗表面积的百分比，比较不同时间点组织表面积与等渗表面积的比值，最小比值出现的时间点为所述玻璃液最佳渗透脱水时间。

本发明的玻璃化冷冻观察装置可以用于包括但不限于肾脏组织、肝脏组织、胚胎组织、卵巢组织在玻璃液中的平衡时间的优化。

优选地，所述玻璃化冷冻观察装置应用于卵巢组织在玻璃液中的平衡时间的优化。

本发明的有益效果是：区别于现有筛选最优玻璃液及组织平衡时间方法检测周期长、不灵活、不能及时发现玻璃液配伍问题、易使后续检测成为无效工作的情况，本发明玻璃化冷冻观察装置应用在最优玻璃液筛选和组织平衡时间优化时，可便捷地观察快速冷冻和复融过程中不同玻璃液的玻璃化状态和组织在玻璃液中平衡过程中表面积变化，完成初步玻璃态筛查工作和组织平衡时间的优化及确定，具有快速、简单方便的特点，极大减少无效工作。

附图说明

图1为本发明的玻璃化冷冻观察装置结构示意图；

图2为图1中的隔离盒的剖视图；

图3为图1中培养皿置于隔离盒中的状态剖面图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

请参见图1、图2和图3，玻璃化冷冻观察装置包括立式显微镜1、隔离盒2和培养皿3。立式显微镜1包括镜头装置101、置物台102和置物台102下方的光源103，立式显微镜1连接有拍摄装置，用于观察和拍摄玻璃化冷冻——复融过程以及组织在玻璃液中的平衡。

隔离盒2置于立式显微镜的置物台102上，隔离盒2呈长方体形，由具有耐超低温和保温性能的材料制成，长、宽、高分别为15厘米、15厘米和5厘米，中央设有中空部21，中空部21呈圆柱形，包括上下相通的第一中空部211和第二中空部212，第一中空部211的直径为9厘米，在距离隔离盒2表面1厘米处直径扩大为10.5厘米并形成第二中空部212，使得第二中空部212与第一中空部211交界处形成环形平台。隔离盒2用于承载观察材料和通过立式显微镜1的置物台102下方光源103的光线。

培养皿3为透光的玻璃培养皿，直径10厘米，置于隔离盒2的第二中空部212，由于第二中空部212的直径为10.5cm、高度为1厘米，该高度与玻璃培养皿3的深度相配合，使玻璃培养皿3恰好能嵌入第二中空部212。直径10cm的透明玻璃培养皿3置入第二中空部212时，玻璃培养皿3侧壁本身的厚度使其与第二中空部212的侧壁紧贴，使得玻璃培养皿3不易晃动；此外，玻璃培养皿3置于第二中空部212时，玻璃培养皿3的底部置于第二中空部212与第一中空部211交界处形成的环形平台上，环形平台可托住玻璃培养皿3。

玻璃化冷冻观察装置的使用方法：立式显微镜1连接拍摄装置，将隔离盒2置于立式显微镜1的置物台102上，使隔离盒2中央的中空部21位于置物台102下方光源103的中央，玻璃培养皿3的中央位置根据观察物形状做不同固定标记。

实施例2

用玻璃化冷冻观察装置来筛选玻璃液，包括以下步骤：

（1）玻璃液快速冷冻观察

A．在玻璃培养皿3中倒入液氮，调节立式显微镜1的焦距；

B．用内径0.5微米ICSI注射针4吸取一定体积待检测玻璃液，置于玻璃培养皿3中标记好的对焦位置；

C．拍摄并记录所述玻璃液的变化，观察指标包括快速冷冻过程中晶体、碎片的形成；

（2）玻璃液复融观察

A．在玻璃培养皿3中倒入37℃水，调节立式显微镜1的焦距；

B．取出上述液氮中冷冻后的ICSI注射针4置于玻璃培养皿3中标记好的对焦位置；

C．拍摄并记录玻璃液变化情况，观察指标包括复融过程中冰晶、去玻璃和再结晶形成情况。

任何玻璃在冷冻和/或复融过程中出现如下变化均认为不是完全玻璃化。

（1）晶体形成：水分子从液态转为固态的冰；

（2）碎片：在快速降温和升温过程中在组织细胞内形成的冰晶，特别是当组织内外温差大时更为明显；

（3）去玻璃化：在冷冻后复融升温过程中，在玻璃液中形成冰核和冰晶的现象；

（4）再结晶：是比较复杂的过程，出现在冷冻后复融升温的过程中，玻璃液中的冰晶形成后体积发生变化，小体积冰晶皱缩而大体积冰晶变得更大。

实施例3

玻璃化冷冻观察装置在卵巢组织在玻璃液中的平衡时间优化中的应用，由于实验用卵巢块形状不规则，无法计量其体积变化，因此可通过测量其表面积变化来观察卵巢块在玻璃液中的渗透行为。所述应用包括以下步骤：

（1）在玻璃培养皿3中加入一定量的玻璃液；

（2）将卵巢组织置于等渗磷酸盐缓冲液中；

（3）再将卵巢组织移入玻璃液中，渗透平衡一定时间；

（4）调整立式显微镜1的焦距，每间隔一分钟镜下拍照一次，拍摄记录组织表面积变化，通过Image plus6.0图象分析软件测量其表面积；

（5）以卵巢组织在等渗磷酸盐缓冲液中的表面积为百分之百等渗表面积，计算置于玻璃液内的组织表面积占等渗表面积的百分比，比较不同时间点组织表面积与等渗表面积的比值，最小比值出现的时间点为所述玻璃液最佳渗透脱水时间。

每枚卵巢块为一个实验单位，每组观测6~10枚卵巢块。

本发明玻璃化冷冻观察装置应用在最优玻璃液筛选和组织平衡时间优化时，可便捷地观察快速冷冻和复融过程中不同玻璃液的玻璃化状态和组织在玻璃液中平衡过程中表面积变化，完成初步玻璃态筛查工作和组织平衡时间的优化及确定，具有快速、简单方便的特点，极大减少无效工作。

本领域技术人员不脱离本发明的实质和精神，可以有多种变形方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围，凡运用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变化，均包含于本发明的权利范围之内。