茶叶中有机氯农药和拟除虫菊酯农药的快速检测方法及其前处理方法与流程

本发明涉及一种茶叶中有机氯农药和拟除虫菊酯农药的快速样品前处理方法，还涉及使用该前处理方法、采用气相色谱-电子捕获检测器分析茶叶中有机氯农药和拟除虫菊酯农药残留量的检测技术，属于食品安全检测领域。

背景技术：

有机氯农药在世界各国曾广泛用于农业生产，其结构稳定、不易降解、污染环境，我国已于1983年禁止生产使用有机氯农药，但时至今日，水体和土壤中残存的有机氯农药仍通过农作物对人类健康产生危害。拟除虫菊酯类农药的化学结构与天然除虫菊素类似，属于仿生性杀虫剂，由于其具有高效低毒等优点，在我国的茶园中得到了普遍应用，所以茶叶中拟除虫菊酯类农药残留问题比较严重。

为了减少病虫害、提高茶叶产量，茶农在种植过程中往往喷洒了大量的化学农药，这种现象与日益严格的食品安全要求构成矛盾。目前，欧盟、日本、北美等发达国家和地区对茶叶中农药残留制定了严苛的限量值，已成为不利于我国茶叶出口的技术性贸易壁垒。为确保我国茶叶的质量安全，大量的茶叶生产商需要农药残留检测技术对茶叶原料和成品进行农药残留水平的监控。

茶叶中含有嘌呤类生物碱、糖类、色素、维生素和矿物质等成分，基质复杂，对痕量的农药残留检测有严重干扰。采用色谱法分离检测有机氯和拟除虫菊酯类农药时大多需要前处理方法对茶叶样品进行处理。目前，国内外研究茶叶中农药残留的前处理方法主要有索氏提取、振荡提取、加速溶剂萃取、分散液液微萃取、固相萃取、凝胶渗透色谱等方法。这些方法有些步骤较多，有些耗时较长，有些需操作人员与大量的有机溶剂接触，污染环境，成本较高。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有的样品前处理技术处理时间长、消耗溶剂多、成本高等缺点和不足，开发一种快速、低成本、高效率的茶叶中有机 氯农药和拟除虫菊酯农药的分析方法及其前处理技术。

为达解决上述问题，本发明所述的茶叶中有机氯农药和拟除虫菊酯农药快速检测方法的前处理技术主要由以下步骤组成：

(1)粉碎茶叶样品，得到待测干茶叶粉末；

(2)向步骤(1)中获得的待测干茶叶粉末中加入乙腈并用超声进行提取，离心并移出上清液；

(3)将步骤(2)中获得的上清液与吸附剂涡旋混合，离心后获得净化液；

(4)将步骤(3)中获得的净化液用氮气浓缩至干，再用正己烷复溶，然后利用滤器进行过滤，得到用于GC-ECD分析的待测液体样品。

在本发明的样品前处理方法的优选的实施方式中，步骤(1)中，待测茶叶的筛分粒度≤2.0mm。

在本发明的样品前处理方法的一个实施方式中，步骤(2)中，对于2.50g所述待测干茶叶粉末，所述乙腈的加入量为10mL；所述超声提取共进行20min；和/或所述离心以3000r/min进行5min。

在本发明的样品前处理方法的一个实施方式中，步骤(3)中，所使用的吸附剂为石墨化炭黑和伯仲胺；优选地，对于1.5mL的步骤(2)中获得的上清液，所述石墨化炭黑和所述伯仲胺的使用量分别是20-45mg和30-60mg；更优选地，对于1.5mL的所述上清液，所述石墨化炭黑和所述伯仲胺的使用量分别是30-35mg和40-45mg；所述涡旋混合共进行3min；和/或所述离心以6000r/min进行3min。

在本发明的样品前处理方法的一个实施方式中，步骤(4)中的氮气浓缩在室温温和条件下进行，优选在30℃下进行；氮气浓缩至干的残余物用正己烷复溶至0.8mL；使用尼龙滤膜进行所述过滤，优选所述尼龙滤膜的孔径为0.22μm。

在另一方面，本发明提供了一种对茶叶样品中有机氯农药和拟除虫菊酯农药进行检测的方法，所述方法包括：

(a)用本发明所述的前处理方法进行处理待测茶叶，以得到待测液体样品；

(b)使用GC-ECD对步骤(a)中得到的待测液体样品进行分析。

本发明以有机氯和拟除虫菊酯农药为分析对象，采用分散固相萃取技术作为前处理手段，气相色谱-电子捕获检测器作为分析仪器，建立了茶叶中多种农药残留的快速检测方法。

本发明所述的方法与现有技术相比有以下优点：

本发明的前处理技术可快速处理茶叶样品，在有效提取多种有机氯农药和拟除虫菊酯农药的同时，最大限度地去除大部分茶叶基质，减少茶叶中原有成分的干扰，还具有宽的线性检测范围。另一方面，与现有技术相比，本发明的方法大大缩短了茶叶样品的处理时间，在实际检测中，可在2小时内同时对20个样品完成处理，且处理成本也显著得到了降低，每个样品的处理成本可降至小于5元。因此，本发明的前处理技术和检测方法可应用于大规模快速检测，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是25种有机氯和拟除虫菊酯农药标准品的GC-ECD色谱图(0.050μg/mL)。

图1中色谱峰分别为：(1)α-BHC(α-六六六)、(2)β-BHC(β-六六六)、(3)γ-BHC(γ-六六六)、(4)δ-BHC(δ-六六六)、(5)Heptachlor(七氯)、(6)Aldrin(艾氏剂)、(7)o,p’-DDD(o,p’-滴滴滴)、(8)o,p’-DDE(o,p’-滴滴伊)、(9)o,p’-DDT(o,p’-滴滴涕)、(10)p,p’-DDD(p,p’-滴滴滴)、(11)p,p’-DDE(p,p’-滴滴伊)、(12)p,p’-DDT(p,p’-滴滴涕)、(13)α-Endosulfan(α-硫丹)、(14)β-Endosulfan(β-硫丹)、(15)Endosulfan-sulfate(硫丹硫酸酯)、(16)Bifenthrin(联苯菊酯)、(17)Fenpropathrin(甲氰菊酯)、(18)Cyfluthrin(高效氯氟氰菊酯)、(19)Permethrin(氯菊酯)、(20)λ-Cyhalothrin(氯氰菊酯)、(21)Flucythrinate(氟氰戊菊酯)、(22)Esfenvalerate(高效氰戊菊酯)、(23)Deltamethrin(溴氰菊酯)、(24)Tetradifon(三氯杀螨砜)、(25)Pyridaben(哒螨灵)。

图2示出了使用本发明的方法对三种实际茶叶样品进行测试的结果。其中，各个色谱峰标号的对应关系与图1中相同。

具体实施方式

本发明使用石墨化炭黑(GCB)和伯仲胺(PSA)对茶叶提取液进行吸附。上述吸附剂能够吸附茶叶中的多种成分，排除对农药残留检测的干扰，同时并不显著影响有机氯和拟除虫菊酯农药的检测精度。

在现有技术中，还存在一些适用于有机磷农药检测方法的前处理步骤。然而，大部分有机磷农药是极性或强极性的，而有机氯和拟除虫菊酯类农药是弱极性或非极性的；部分有机磷农药不稳定、易分解，而有机氯和拟除虫菊酯类农药稳定、短期内不易分解。所以在处理有机磷农药时，采用例如4-8min的旋涡振荡提取，这是一种比较温和的提取方式，不会引起有机磷农药的分解；而在处理较稳定的有机氯和拟除虫菊酯类农药时，则宜采用例如20min的超声提取。长时间的超声同时存在强烈的分子间作用和温度的升高，进一步增强有机氯和拟除虫菊酯类农药的提取效率。

此外，有机磷农药需要用气相色谱-火焰光度检测器(GC-FPD)检测，这是一种高选择性、高灵敏度的检测器。当检测器上装有磷的滤光片时，检测器只检测能发射出波长为526nm的含磷有机化合物。也就是说除有机磷农药外，其他茶叶中的基质、有机溶剂在FPD上均无信号，所以前处理时样品经过简单的提取和净化即可上机检测。

有机氯和拟除虫菊酯类农药中大多含有卤素，需要用气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)检测。这是一种只对含有电负性元素(卤素、氧、氮、硫等)的化合物具有高灵敏度的检测器，且电负性越强，检测灵敏度越高。由于采用乙腈(含氮原子)作为提取溶剂，当大量的乙腈进入ECD后将引起ECD的饱和，不仅影响有机氯和拟除虫菊酯类农药的检测，严重时甚至会损毁ECD。所以在提取和净化后，需要将乙腈全部吹干，再用正己烷(仅含碳原子和氢原子)代替乙腈溶解农药后，进行GC-ECD检测。

实施例

下面通过实施例具体描述本发明。然而应当理解本发明并不限于这些实施例。

本发明实施例所采用的GC-ECD检测使用GC-2010Plus气相色谱仪(配 ECD检测器，日本岛津公司)，并使用以下操作参数：

色谱柱：DB-35ms毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm；

升温程序：150℃保持2min，然后以10℃/min升至300℃，保持30min；

载气：N₂，纯度≥99.999％；

流速模式：恒线速率模式，初始流速1.0mL/min；

检测器温度：320℃；

进样口：分流模式，分流比10:1，进样温度280℃；

进样量：1μL。

本发明实施例使用的农药标准品纯度为87.0％～99.6％，均市购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。使用的石墨化炭黑(GCB)、伯仲胺(PSA)市购自北京BESEP公司。使用的溶剂(乙腈、正己烷、石油醚、丙酮、甲苯)均为色谱纯，市购自美国Fisher公司。茶叶样品均为市购产品。

在本发明的实施例中，所使用的前处理方法具体步骤如下：

(1)标准溶液的配制

精确称取25种农药的标准品，用甲苯-丙酮混合溶液配制成1mg/mL的标准储备液，于-18℃条件下储存。

混合农药标准储备液：根据25种农药在仪器上的响应值分别准确移取各种农药标准品适量，用正己烷配制成混合标准储备液，于冰箱中保存，使用时根据实际需要进行稀释。

(2)样品前处理

(2-1)粉碎：取茶叶样品100g，用粉碎机粉碎，用圆孔筛筛出≤2.0mm颗粒。混匀，装入洁净容器内，密封，冷藏保存。

(2-2)提取：取2.50g(精确到0.01g)干茶叶粉末于50mL离心管中，加入10mL乙腈，超声提取20min，于3000r/min离心5min。

(2-3)净化：取一10mL离心管，加入30-35mg GCB、40-45mg PSA吸附剂，转入上述上清提取液1.5mL，涡旋混合3min，于6000r/min离心3min。

(2-4)浓缩：取一5mL(精准刻度的)玻璃离心管，加入上清净化液0.8mL，在30℃条件下氮吹近干后以正己烷复溶至0.8mL，样品过0.22μm尼龙滤膜后，进行GC-ECD分析。

实施例1：工作曲线的绘制

用空白茶叶基质配制25种有机氯和拟除虫菊酯农药的混标工作液，以峰面积对浓度做工作曲线，线性范围、线性方程及相关系数见表1。

图1示出了上述混标工作液在0.050μg/mL的浓度下的标准色谱图。由图1可见，根据本发明的实验方法，25种有机氯和拟除虫菊酯农药分离良好。

表1线性范围、线性方程及相关系数

实施例2：方法加标回收和精密度实验

称取2.5g空白茶叶基质，分别加入适量的农药标准品，使各农药的 加标浓度为10倍定量限(LOQ：S/N＝10)，实验平行操作5次，计算方法的平均回收率和相对标准偏差，结果见表2。

表2是25种农药添加实验的平均回收率、相对标准偏差与检出限

由以上表1和表2可以看出，本发明的前处理技术及使用该技术的检测方法对于多种有机氯和拟除虫菊酯具有良好的检测分离度，线性范围较宽，能够获得优秀的检测准确率。

与现有技术的比较：目前，国家标准GB 2763-2014最大农残限量标准中对检测茶叶中的农残量推荐了多种方法，其中NY/T 761-2008和GB/T 5009.19-2008标准所使用的检测方法与本方法一致，均为GC-ECD检测方法。但是NY/T 761-2008的前处理方法是液液萃取结合固相萃取 净化，共需要进行2次氮吹浓缩；而GB/T 5009.19-2008的前处理方法是液液萃取结合凝胶色谱净化。这2种标准方法的前处理时间长(处理单个样品大约需要1.5-2小时)、成本高、消耗有机溶剂量大。与之相比，本发明所述的方法具有简单快速(处理单个样品所需时间小于1h)、消耗溶剂少、成本低等众多优点。

实施例3：实际样品检测实验

按本发明的实验方法对3种市售的实际茶叶样品中的农药残留量进行了检测，以待测茶叶样品制备混标工作液，以外标法定量。结果如图2所示。由图2可见，3种实际茶叶样品中均未明显检出25种有机氯和拟除虫菊酯农药。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。