一种基于等重二甲基化标记的多重蛋白质定量方法与流程

文档序号:12174169阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于等重二甲基化标记的多重蛋白质定量方法,其特征在于:利用作用位点为赖氨酸羧基的蛋白酶将蛋白质酶切成肽段,根据肽段的N末端氨基和C末端赖氨酸侧链氨基在pH酸性条件下反应速度不同的性质,依次在酸性、碱性条件下对肽段N末端和C末端进行二甲基化标记;通过二甲基化标记试剂甲醛CH2O、氰基硼氢化钠NaBH3CN及其相应同位素13CH2O、CD2O、13CD2O、NaBD3CN的组合实现两重至六重中一种或二种以上的标记,使肽段每端的标记有所不同,而肽段的总质荷比相同,从而使肽段在液质联用的质谱仪中得到的一级谱具有相同的质荷比,而二级谱每种碎片离子都存在质荷比差异,利用二级谱碎片离子强度进行蛋白质的多重定量分析。

2.按照权利要求1所述的定量方法,其特征在于:所述依次在酸性、碱性条件下对肽段N末端和C末端进行二甲基化标记,并通过二甲基化标记试剂甲醛、氰基硼氢化钠及其相应同位素的组合实现六重标记,六重标记试剂为:

肽段N末端:13CH2O+NaBH3CN——肽段C末端:CD2O+NaBD3CN;

肽段N末端:CD2O+NaBH3CN——肽段C末端:13CH2O+NaBD3CN;

肽段N末端:13CD2O+NaBH3CN——肽段C末端:CH2O+NaBD3CN;

肽段N末端:CH2O+NaBD3CN——肽段C末端:13CD2O+NaBH3CN;

肽段N末端:13CH2O+NaBD3CN——肽段C末端:CD2O+NaBH3CN;

肽段N末端:CD2O+NaBD3CN——肽段C末端:13CH2O+NaBH3CN。

3.按照权利要求1所述的分析方法,其特征在于:六重标记在每张二级谱上都同时出现,故提取每种标记肽段在二级谱上六重标记都同时出现的a、b、y碎片离子强度并加和,作为该种标记肽段的强度;将每重强度相比作为相对定量结果,进而实现六重定量分析。

4.按照权利要求2所述的定量方法,其特征在于:

蛋白质样品经过变性还原烷基化后,加入作用位点为赖氨酸羧基的蛋白酶,孵育;将一份酶解后的蛋白样品首先在酸性条件下选择性二甲基化标记肽段末端的氨基;然后在碱性条件下相应的二甲基化标记肽段赖氨酸上的氨基;

酸性条件控制在pH值为2.0~5.0,标记时间5~120min;碱性条件控制pH值为7.5~12,标记时间5~120min。

5.按照权利要求1所述的定量方法,其特征在于:所述的液质联用中的质谱仪包括静电场轨道阱(Orbitrap)、飞行时间管(TOF)或傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(FT-ICR)。

6.按照权利要求1所述的定量分析,其特征在于:包括两重、三重、四重、五重或六重样品中一种或二种以上的同时定量分析。

7.按照权利要求1所述的定量分析,其特征在于:作用位点为赖氨酸羧基的蛋白酶为Lys-C酶。

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