用于细胞悬浮和监测的系统和方法与流程

本申请要求2014年2月26日提交的题为“细胞监测和/或分离的系统和方法”的美国临时专利申请系列号61/944,707的权益，并且还要求2014年10月29日提交的题为“用于细胞悬浮和监测的系统和方法”的美国临时专利申请系列号62/072,040的权益。这些申请的内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。

联邦资助研究或开发的声明

本申请在国家科学基金会授予的合同CBET 1150733以及国立卫生研究院授予的R01AI093282、R15HL115556、R01EB015776-01A1、R21HL112114、R01HL096795、和P01HG000205的政府支持下完成。政府对本发明享有某些权利。

背景

本发明涉及细胞的异质群悬浮，并且更具体地，涉及基于细胞和悬浮介质之间在磁化率上的差异以及磁性与校正重力之间的平衡来分离细胞。

磁性悬浮常规用于分析单个宏观物体的密度和磁化率，并且作为在分离食物中有效的手段，确定牛奶、奶酪和花生酱中的脂肪含量，基于其固有密度比较多种颗粒，引导物体的自组装，和表征法医学相关证据。这些较早的基于磁性悬浮的实验使用不与显微术相容或不适合显微术的大装置来进行。

由于胞内顺磁性活性物质，例如活性氧物质(ROS)或活性氮物质(RNS)的形成或猝灭，广泛的生理和病理细胞过程伴随着细胞的体积质量密度或磁性特征的瞬时或永久变化。这些事件包括细胞周期阶段、分化、细胞死亡(凋亡/坏死)、恶性、疾病状态、激活、吞噬、体内和离体细胞衰老、病毒感染、以及对药物的特异性和非特异性应答。

技术实现要素：

很少尝试以高精确度测量单个活细胞密度。一种这类技术包括提供低通量并且需要使用复杂泵送机制在不同密度的流体之间转移细胞的纳米制造的悬浮的微通道共振器。因此，针对高分辨率、实时监测和定量细胞的磁性特征和体积质量密度的可靠工具将有助于阐明复杂的细胞机制。

本发明通过提供与显微装置相容并且基于针对细胞的校正重力与磁体诱导的磁力之间的平衡来分离细胞的细胞悬浮系统克服了前述缺陷。校正重力是考虑在具体介质中具体细胞的比较密度(即，细胞浮力)的作用在细胞上的重力，如下文发明详述部分中更为详细的描述。

根据本发明的一个方面，提供了用于分离细胞的异质群的方法。该方法包括将细胞的异质群加载到含有磁性响应介质(例如，顺磁性介质，反磁性介质，或含有能够产生对分离而言足够的环境差异的自由基的溶液)的毛细管通道中，将含有细胞样品和磁性响应介质的毛细管通道放到悬浮系统中，并且在磁性响应介质中悬浮细胞的异质群。使用的悬浮系统由一组产生磁场的2个磁体组成，在两个磁体之间有大小经调整以接受毛细管通道的空间。另外，悬浮系统包含显微装置，其在这组2个磁体之间有平台，在该平台上放置毛细管通道。通过对由磁体的磁场施加到各细胞上的磁力与磁性响应介质中细胞的校正重力进行平衡，来实现悬浮细胞的步骤，其随后分离细胞的异质群。该机制与之前实践的机制相反，已知之前的机制是用惯性力和曳力平衡磁力，而不是用校正重力平衡磁力。

在一些具体形式中，细胞的异质群可选自血红细胞、白细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、血小板、癌细胞等。磁性响应介质也可能是顺磁性介质，并且包含钆或者是钆基的，其中介质可以是纯钆，或者可以是其他组分。

在另一种可能性中，异质群内的单个细胞可基于其由细胞变异产生的磁化率和细胞密度中的至少一种互相区分。细胞变异可能由细胞之间的多种差异造成，例如细胞类型、细胞周期阶段、恶性、疾病状态、活化状态、细胞年龄、感染状态、细胞分化、细胞凋亡、和细胞吞噬作用。

在一些形式中，可用电磁体产生磁场梯度。这些电磁体可用交流电产生梯度。在一些形式中，一组两个磁体可以是反亥姆霍兹构造的2个永磁体。

在一些形式中，单独细胞的分离可发生在一种平衡状态下，该平衡状态显示出针对单独细胞的重力和磁力之间的平衡。

此外，细胞群的分离液可能发生在护理点，只要正在使用中的悬浮系统不干扰可用于远程诊断的移动装置。

在该方法的一些形式中，该方法还可包括使用显微装置实时观察细胞的异质群的步骤，并且该显微装置可提供一段时间上细胞的异质群的多个图像。

在这段时间中，可进行其他步骤。例如，可改变异质细胞群的物理环境，并且可观察到异质细胞群对物理环境的响应。又例如，治疗剂(例如，药物或抗生素)可引入异质细胞群并且可观察到该异质细胞群对引入治疗剂的响应。如果引入治疗剂，则该方法还可包括监测异质细胞群的连续响应来确定异质细胞群对治疗剂发生耐受。

在一些形式中，可在观察步骤期间单独监测并追踪异质细胞群中的单独细胞。

在该方法的一些形式中，观察步骤可包括在细胞生命周期的不同阶段监测异质细胞群。

在该方法的其他形式中，异质细胞群可在患者样品中悬浮，并且还考虑患者样品可能是血液。当然，血液仅仅是一个示例，并且并不认为患者样品仅限于血液。

在该方法的一些形式中，细胞可从不健康细胞分离。例如，癌细胞可从健康细胞中分离。又例如，可悬浮血红细胞来检测是否存在I型糖尿病。

在该方法的一些形式中，在悬浮步骤期间，异质细胞群中的活细胞可与死细胞分离。可使用这种异质细胞群中活细胞与死细胞分离例如来确定治疗剂的功效或者确定物理环境中的变化对细胞的影响。

在该方法的其他形式中，在分离步骤期间，不同的微生物可互相分离。

在该方法的一些形式中，可通过毛细管通道中细胞的测量高度来确定异质细胞群中至少一些的特性。通过这种方式，可在不与参考健康细胞比较的情况下检测不健康的细胞。

在该方法的其他方面中，悬浮系统可包括毛细管通道的第一开放侧上的第一镜，毛细管通道的第二开放侧上的第二镜，其中镜相对于镜之间的通路呈倾斜角度取向。在悬浮细胞时，该方法还可包括用第一镜反射来自显微镜内光源的光通过细胞样品并照向第二镜来实时分析细胞群。显微装置也可能是侧边横向水平的直立荧光显微镜，从而允许对细胞群进行成像而无需用镜对光反射。另外，显微装置可以是侧视显微镜、手机相机、无透镜电耦合装置(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)系统、或倒置显微镜。

根据本发明的一个方面，提供了对细胞进行实时调查的方法。该方法包括将异质细胞群的样品加载到含有磁性响应介质的毛细管通道中，将含有细胞样品和磁性响应介质的毛细管通道置于悬浮系统中，在磁性响应介质中悬浮异质细胞群，并且改变磁性响应介质的磁性。同时，使用的悬浮系统由一组产生磁场的2个磁体组成，两个磁体之间的空间大小经调节以接受毛细管通道。另外，该系统包含显微装置，其在这组2个磁体之间有平台，在该平台上放置毛细管通道。通过平衡由磁体的磁场施加到各细胞上的磁力与磁性响应介质中细胞的校正重力来悬浮细胞，其随后分离细胞的异质群。

如上所述，异质细胞群可选自血红细胞、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、血小板、癌细胞等。磁性响应介质也可能是顺磁性介质，并且包含钆或者是钆基的，其中介质可以是纯钆，或者可以是其他组分。在另一种可能中，局部改变磁性响应介质的磁性可能通过磁性响应介质接触低强度激光束来完成。

在一些形式中，异质细胞群内的单独细胞可能基于其由细胞变异产生的磁化率和细胞密度中的至少一种互相区分。变异可由细胞之间的多种差异导致，例如，细胞类型、细胞周期阶段、恶性、疾病状态、活化状态、细胞年龄、感染状态、细胞分化、细胞凋亡和细胞吞噬。

此外，单独细胞的分离可能形成平衡状态，该平衡状态显示单独细胞上的重力和磁力之间的平衡。

此外，可在护理点进行细胞群分离，只要使用的悬浮系统不干扰可用于远程诊断的移动装置。

在一些形式中，悬浮系统还可包含在毛细管通道的第一开放侧上的第一镜和在毛细管通道的第二开放侧上的第二镜，其中镜相对于镜之间的通道呈倾斜角度取向。在悬浮细胞时，该方法还可包括用第一镜反射来自显微镜内光源的光通过细胞样品并照向第二镜来实时分析细胞群。在一些形式中，显微装置也可能是侧边水平的直立荧光显微镜，从而允许对细胞群进行成像而无需用镜对光反射。在其他形式中，显微装置可以是侧视显微镜、手机相机、无透镜电耦合装置(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)系统、或倒置显微镜。

同样，磁体可采取多种不同形式。例如，磁体可以是反亥姆霍兹(anti-Helmholtz)构造的一对永磁体。又例如，磁体可以是电磁体。通过向电磁体施加交流电，可产生磁场梯度。

在该方法的一些形式中，该方法还可包括使用显微装置实时观察细胞的异质群的步骤，并且该显微装置可提供一段时间上细胞的异质群的多个图像。

在这段时间中，可进行其他步骤。例如，可改变异质细胞群的物理环境，并且可观察到异质细胞群对物理环境的响应。又例如，治疗剂(例如，药物或抗生素)可引入异质细胞群并且可观察到该异质细胞群对引入治疗剂的响应。如果引入治疗剂，则该方法还可包括监测异质细胞群的连续响应来建立异质细胞群对治疗剂发生耐受。

在一些形式中，可在观察步骤期间单独监测并追踪异质细胞群中的单独细胞。

在该方法的一些形式中，观察步骤可包括在细胞生命周期的不同阶段监测异质细胞群。

在该方法的其他形式中，异质细胞群可在患者样品中悬浮，并且还考虑患者样品可能是血液。当然，血液仅仅是一个示例，并且并不认为患者样品仅限于血液。

在该方法的一些形式中，细胞可从不健康细胞分离。例如，癌细胞可从健康细胞中分离。又例如，可悬浮血红细胞来检测是否存在I型糖尿病。

在该方法的一些形式中，在悬浮步骤期间，异质细胞群中的活细胞可与死细胞分离。可使用这种异质细胞群中活细胞与死细胞分离例如来确定治疗剂的功效或者确定物理环境中的变化对细胞的影响。

在该方法的其他形式中，在分离步骤期间，不同的微生物可互相分离。

在该方法的一些形式中，可通过毛细管通道中细胞的测量高度来确定异质细胞群中至少一些的特性。通过这种方式，可在不与参考健康细胞比较的情况下检测不健康的细胞。

根据本发明的另一个方面，教导了用于分离异质细胞群的悬浮系统。该系统包括一组2个产生磁场的磁体和显微装置，2个磁体之间的空间大小经调整以接受适于接受异质细胞群的毛细管通道，并且显微装置在一组2个磁体之间具有其上放置毛细管通道的平台。

另外，该系统还可包含在毛细管通道的第一开放侧上的第一镜和在毛细管通道的第二开放侧上的第二镜，其中镜相对于镜之间的通道呈倾斜角度取向。考虑在其他形式中，显微装置可以是在其侧边上横向水平的直立荧光显微镜。在其他形式中，显微装置可以是例如侧视显微镜、手机相机、无透镜电耦合装置(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)系统、或倒置显微镜。

同样，系统中的磁体可采取多种不同形式或构造。例如，磁体可以是反亥姆霍兹构造的一对永磁体。又例如，磁体可以是电磁体。通过向电磁体施加加流电，可产生磁场梯度。

可通过以下详细描述和附图了解本发明的这些和其它优势。下述内容只是关于本发明的优选实施方式的描述。为了评定本发明的整个范围，对于权利要求书应理解这些优选的实施方式并非指的是权利要求书范围内的仅有的实施方式。

附图的简要说明

图1显示了对细胞的磁性介导的扫描和调节。图1a是磁场中磁性细胞悬浮和操作的示意图。图1b是优于细胞和介质的磁化率差异施加在细胞上的力的示意图。图1c是磁性悬浮系统的多种视图。图1d是由反亥姆霍兹构造的永磁体诱导的磁场梯度的前等高线和侧等高线。图1e是在40mM Gd⁺溶液中的RBCS的细胞培养图。

图2详细表征了使用磁性悬浮的细胞分离。图2a是单核细胞、淋巴细胞、嗜碱粒细胞、PMN、嗜酸粒细胞、和RBC的密度直方图。图2b是已经在30mM Gd⁺中磁性驱动的基于密度分离的荧光标记的RBC、PMN和淋巴细胞的细胞培养图像。图2c是在20、35、50、和100mM Gd⁺中悬浮的RBC的细胞培养图像。图2d是分离老和新RBC的细胞培养延时拍摄图像组。图2e是老和新RBC在其平衡悬浮高度下的荧光标记的细胞培养图像。图2f是随着老和新RBC的平衡高度变化的分析平衡时间的示意图。图2g是在磁性悬浮装置中沉淀的RBC悬浮的细胞培养延时拍摄图像组。图2h是从毛细管的底面悬浮至其平衡点的RBC的时间依赖位置的示意图。

图3详细显示了功能变化的血细胞的静止悬浮。图3a是详细显示与PMA活化相关的PMN密度变化的荧光标记的细胞培养图像。图3b是悬浮活化的和静息的PMN的低放大图像，插图显示形状和光学强度差异。图3c是在静息和活化的PMN之间圆度差异的示意图。图3d是静息和活化的PMN的荧光活化的细胞接种结果。图3e是详细显示静息、活化和GDH-处理的PMN之间限制高度差异的细胞培养图像。图3f是血细胞的磁性驱动的密度分离的细胞培养图像。左图显示PMN、淋巴细胞和血小板。右图显示静息PMN、活化的PMN(箭)和2种嗜酸粒细胞(箭头)。图3g是详细显示PMN的同型聚集的悬浮后2小时的细胞培养图像。图3h是详细显示人PMN对沙门氏菌吞噬的细胞培养图像。

图4详细显示磁性悬浮的血细胞的功能性调查。图4a显示通过局部激光照射对细胞或离散细胞群的操作。图4b是显示用UV刺激和顺磁性介导的细胞聚簇增加限制高度的细胞培养图像组(虚线圆圈)。图4c是显示由于增加的胞内ATP，导致细胞聚簇和减少悬浮的导致RBC磁性变化的细胞培养图像组。

图5详细显示了用于临床护理点诊断的磁性悬浮的通用性。图5a显示了来自添加TC的稀释血液的乳腺癌细胞(TC)、PMN和淋巴细胞悬浮的亮场图像。图5b是悬浮的细胞的荧光成像，TC是上排的较大细胞。图5c是图5a和5b的合并。图5d是在10mM焦亚硫酸钠存在下健康RBC悬浮的细胞培养图像。图5e是在10mM焦亚硫酸钠存在下镰状细胞RBC悬浮的细胞培养图像。

图6是悬浮系统的一个实施方式的示意图。图6a是悬浮系统的注释图。图6b显示了一些支持元件的尺寸。

图7是随悬浮细胞和顺磁性介质之间的密度差异变化的平衡高度的示意图。

图8是添加非小细胞肺癌(NSCLC)细胞(HCC-827)的血细胞的显微照片和相应的观察到的细胞分布概况。对于该实验，RBC在之前裂解并且用30-mM Gadavist(Gd⁺)溶液来分选细胞。

图9是从患者血液样品中检测到的非小细胞肺癌细胞(NSCLC)的显微照片。

图10显示了乳腺癌细胞的分离效率。图10a是在血液中掺入荧光标记的肺癌细胞(MDA)的显微照片。图10b显示了血液样品中以不同浓度添加的乳腺癌细胞的分离效率，其中数据点表示三次重复的平均±误差线标准偏差。

图11显示了观察到的健康和白血病患者的外周血单核细胞(PBMC)概况。

图12显示了施加盐酸(HCl)后单个细胞的实时密度变化。图12a显示了对照(未处理)和HCl-处理的MDA乳腺癌细胞的显微照片，其中对照细胞保持其悬浮高度(即，密度)，但是施加HCl的细胞沉入通道底部(即，z＝-500μm)。图12b详细显示了对施加HCl的单个细胞的实时观察，其中也使用对活细胞的钙黄绿素(绿色荧光)和对死细胞的碘化丙啶(红色荧光)来进行活力实验。荧光图像和亮场图像互相重叠以组成不同时间点的显微图像。在细胞沉淀到通道底部并且密度增加的同时，细胞上的荧光概况从绿色变成红色表示正在死亡的细胞。图12c显示了酸处理的单个细胞的实时密度测量，其中显示，即使同时向细胞施加酸，各细胞由于细胞异质性而有不同表现。

图13显示了就磁性悬浮高度而言，使用未处理和氨苄青霉素处理的细菌(即，大肠杆菌)细胞的磁性悬浮介导的平台观察到的比较高度分布概况。活细菌细胞和死细菌细胞有不同的磁性概况，其可快速实时检测。

图14显示了酵母细胞的磁性悬浮和特征。图14a拍摄了在用不同药物处理24小时后的酵母细胞活力。图14b显示了在用100μM斑蝥素和100μM氟康唑的药物处理后，酵母细胞的悬浮高度、磁性和固有磁场特征是如何变化的。

图15提供了与观察到的药物响应和观察到的药物磁性概况变化相关的数据。图15a显示光学密度(OD)概况，图15b显示通道内侧的分布，图15c显示计算的单细胞密度，并且图15d提供了对用不同浓度的药物(氟康唑)处理的细胞的各种显微照片，上述各显微图像列出了处理浓度。观察到用不同药物浓度处理后的细胞磁性概况和密度的变化，并且可在单细胞水平上用磁性悬浮系统监测这些变化。

图16显示了出芽酵母细胞在细胞周期的不同阶段有不同的密度并且具有不同的磁性概况。可通过监测器悬浮高度来测量细胞周期中的细胞(即，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的质量、密度、和体积。

图17提供了显示细胞衰老和老化的收集的磁性概况。分别通过在1400rpm下离心来分离较年轻的酵母细胞，通过在900rpm和1400rpm下离心来分离较老的细胞。一旦它们以相应的离心速度分离，公开的细胞悬浮装置显示出新和老细胞群有不同的细胞磁性概况并且悬浮在不同高度处。

图18详细显示了可如何使用细胞悬浮来鉴定微生物。图18中显示酵母和细菌细胞有不同的特征磁性概况；因此，使用基于磁性悬浮平台根据其密度以低浓度从混合培养物中鉴定并分离单独微生物。

图19提供了健康和丙肝病毒(HCV)感染的肝细胞的显微图像和相应磁性概况。感染的细胞与健康细胞在密度和磁性概况上明显有区别。

图20提供了无糖尿病和糖尿病小鼠(I型糖尿病)的RBC的磁性概况。

图21显示了抗生素处理期间磁性悬浮概况的变化。用不同类抗生素处理大肠杆菌细胞2小时；1mg/mL图21a中显示的氨苄青霉素(β-内酰胺类抗生素)，图21b中显示的环丙沙星(氟喹诺酮类抗生素)，和图21c中显示的庆大霉素(氨基糖苷类抗生素)。

图22显示了抗生素治疗期间多重耐药细菌的磁性悬浮概况变化。使用磁性悬浮系统分别研究包括氨苄青霉素、环丙沙星、和庆大霉素的不同抗生素对多重耐药性大肠杆菌的影响，如图22a、22b和22c所示。

发明详述

本发明提供了一种实时调查并监测磁性悬浮的细胞的生物功能的技术。为了实现这种技术，异质细胞群在置于2个磁体，例如一对反亥姆霍兹构造的永磁体之间毛细管通道，例如管中悬浮并受限制。这能够基于作用于细胞的磁力和校正重力之间的平衡使细胞在不同高度下平衡。

该装置中的永磁体可使该系统更易于复制并且被生物医药实验室使用，生物医药实验室将对其广泛应用感兴趣。使用永磁体系统，产生恒定的磁场线，以及因此在空间上恒定的最小磁场强度位置并且限定了细胞的悬浮高度。通过使用交流电，可在方向和强度上改变磁场，以及最小磁场强度位置。交变磁场原则上可添加新能力，如随着时间改变细胞悬浮高度。

使用这种方法，分离了血红细胞、白细胞、血小板和循环转移乳腺癌细胞、以及不同年龄的血红细胞。另外，实时监测细胞过程诸如嗜中性活化、吞噬作用、以及健康和镰状血红细胞对脱水的响应。该技术提供了一种在护理点环境下高分辨、实时细胞生物学检索、以及疾病筛查和诊断的广泛可应用工具。

本发明的基于磁性悬浮的方法的核心原理依赖于两个相反力的平衡：校正重力和磁力。存在强力的基于磁性悬浮的微流体平台，其允许对细胞群的实时、无标签、高分辨监测，并且与直立和倒置显微镜完全相容。这种技术基于其磁场特征和密度提供了对不同细胞群的快读分离，而不需要使用抗体标记的磁珠、离心、或者使用专门的连续或不连续密度梯度介质。这种悬浮平台能够在逐个细胞的基础上独特监测单独细胞随时间对多种刺激的功能性相应。这使得我们能够在准生理血流装环境中离体研究特异性的细胞-细胞和细胞-分子相互作用后的生物响应。

可如下理解在毛细管中悬浮细胞的背后机制。在由以反亥姆霍兹构造(相同极互相面对)放置的2个磁体产生的施加磁场B下，在等式1中给出了作用在细胞上的磁力F_m。等式2中给出了作用在细胞上的校正重力F_g

F_g＝(ρ_cell-ρ_m)Vg (2)

在此，μ₀＝4π×10^-7(N·A^-2)是自由空间的磁导率，ρ_m(kg·m^-3)是顺磁性介质的密度，χ_m是顺磁性介质的无量纲磁化率，ρ_cell(ρ_细胞)(kg·m^-3)是细胞的密度，χ_cell(χ_细胞)是悬浮的细胞的无量纲磁化率，V(m³)是细胞的体积，并且g是重力矢量。假设细胞在其体积上有均匀的磁化率和密度分布。

磁力F_m取决于细胞的位置(由于磁场在毛细管内的空间变化)并且指向磁场最小处。校正重力F_g并不取决于毛细管内细胞的位置。由等式5给出斯托克斯曳力F_d，针对球形颗粒半径R，和体积V＝4πR³/3。

在瞬时情况中，例如在细胞到达磁力与校正重力平衡的平衡点之前，惯性力，如等式3中的左侧项，和取决于细胞迁移速度的曳力F_d，等式5，将如等式3所述是活的。平衡状态下，曳力和惯性力消失，并且作用于细胞上的磁力和重力将互相平衡，如等式4所给出。

ma＝F_m+F_g+F_d (3)

F_d＝6πηRv (5)

在此，v是颗粒的速度(m/s)并且η是悬浮介质的动态粘度(kg/ms)。在校正重力对齐的z-轴上，力的平衡可写成

在此，假定等式8中的第三项的绝对值大于第一和第二项总和的绝对值，和B_z相对于z-轴的线性变化，从而

在将等式10给出的B代入等式8中之后，可解出等式8以得到平衡高度h，如等式11所示。平衡高度h是磁力和校正重力互相抵消处的垂直距离。从等式11中，也可提取ρ_cell并写成h的函数，等式12a，其中系数α和β如等式12b和c。

ρ_cell＝αh+β (12a)

作为细胞和悬浮液体之间的密度差异的函数的平衡高度绘于图7。

也可计算达到平衡的时间。在此，限定平衡时间t₀是细胞在毛细管中从其初始位置z_i(例如，毛细管底部)移动至另一个位置z_f(例如，悬浮高度)时延迟的时间。为了找到t₀，在此假设等式3中细胞加速度为0(α＝0)并且以其最终速度移动，如等式13所述。

0＝F_m+F_g+F_d (13)

通过将等式5、8和10代入等式13来发现等式13的z组分，代入示于图14a。在对等式14a进行积分之后，发现由等式15描述细胞到达平衡时延迟的时间。在细胞更接近平衡点时，驱动磁力变得更小并且因此，细胞的速度变得更小，这进而降低了曳力。在数学模型中，细胞永远不会达到平衡，因此，当用z_f＝h来时解出等式15时，t₀＝∞。

在图2h中，新生和成熟血红细胞的平衡时间绘成平衡高度的函数。在一些实验中，通过使其接触UV并导致形成活性氧物质(ROS)来改变细胞或周围顺磁性流体的磁化率。

实施例

下文是进行本发明的具体实施方式的示例。提供实施例仅用于说明目的，并非旨在以任意方式限制本发明的范围。

努力保证所用数值(如含量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。

实施例1：磁性悬浮方法和背后机制

悬浮物体χ₀(例如，异质细胞群)和悬浮介质((χ_介质)χ_medium)的磁化率之间的负差产生磁力场，其导致物体根据校正重力和磁体之间的平衡而被限制在不同高度处，如图1a所示。物体(χ₀)和悬浮介质(χ_medium)的磁化率之间的负差使得物体从较大磁场强度位置移向较低磁场强度。直至在顺磁性介质中悬浮的物体，例如血红细胞(RBC)达到平衡高度之前，一组力，如流体曳力、惯性力、重力和磁力持续作用在物体上。随着物体达到平衡，其速度和由此的曳力和惯性力逐渐变小，其可如图1b中所示。

在该装置中并且另外参考图6a和6b所述的装置，将50mm长和1mm x 1mm方形截面的毛细管放在反亥姆霍兹构造的两个永久性N52级钕磁体(NdFeB，长度50mm，宽度2mm，和高度5mm)之间。这些部分用由激光系统(VLS 2.30Versa激光器)切割的1.5-mm-厚聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片组装在一起。在各分开测量之间，毛细管通道用等离子体在100W，0.5Torr(IoN 3Tepla)下处理2分钟，然后放在磁体之间。两个镜以45°(或其他倾斜角度)放置以使用5×物镜或20×物镜的倒置显微镜(Zeiss Axio Observer Z1)对悬浮高度进行成像，以产生与常规显微系统相容的装置用于在悬浮期间对细胞进行高分辨率时空监测，其如图1c中所详述。由于2个磁体的具体放置，和相对于各轴对称的磁场强度分布(图1d)，悬浮的细胞在一定位置处悬浮，该位置取决于最小场强度的位置以及磁化率和细胞密度之比。

为了测试这种设定，从健康供体中分离的RBC在40mM的钆基(Gd+)顺磁性介质中悬浮。用于本文所示的所有实验的顺磁性溶液目前用于在人类中进行MRI研究，无毒性并且与人血细胞相容。在10分钟的磁性限制之后，RBC在距离底部磁体约300μm的高度处稳定悬浮，形成小的、无壁、血流状组装体，如图1e中所示。

为了进行更高分辨亮场和荧光成像(20倍、40倍和60倍)，使用与在其侧边上成水平的荧光直立显微镜耦合的无镜设定。

实施例2：通过磁性悬浮的细胞分离

人血细胞的质量密度分布在1.055和1.11g/mL之间变化，如图2a所示。由质量/单位体积定义的体积质量密度是表征细胞的最基础物理参数之一。几种细胞事件，如分化、细胞死亡(凋亡/坏死)、恶性、吞噬作用、和细胞年龄导致细胞体积质量密度上的永久或短暂变化。

通过磁性限制分离并荧光标记的RBC、多形核白细胞(PMN)、和淋巴细胞来评价该装置的细胞分离能力，如图2b所示。

为了分离PMN，通过按照贝斯以色列女子医学中心的伦理调查委员会(IRB)的指南，并且按照《赫尔辛基宣言》知情同意之后获得40mL来自健康成年志愿者的血液。将血液抽入含14mL 6％葡聚糖T500和6mL柠檬酸盐溶液的60mL注射器中。在分离1小时之后，获得血块黄层并且在15ml的Ficoll(获自GE医疗公司)的顶部上分层，并在350×g下离心15分钟。由PMN、嗜酸粒细胞和污染RBC组成的团块在25ml的0.2％NaCl中重悬45秒来裂解RBC，之后加入等体积1.6％NaCl用连续颠倒混合来平衡盐溶液。悬浮物在350xg下离心5分钟，并且洗涤成团块的PMN并在1mL HBSS⁺⁺中重悬。

结果显示在30mM Gd+溶液中悬浮的细胞形成不同密度和仅由RBC、PMN和淋巴细胞集聚的细胞特异性限制条带。

然后通过逐渐增加用于RBC悬浮的Gd+溶液的摩尔浓度来研究悬浮溶液的磁性强度对RBC的聚焦高度的影响，如图2c中所示。发现Gd+摩尔浓度增加，和由此悬浮介质的磁化率导致细胞聚焦高度逐渐增加。

在骨髓中由h(HSC)形成RBC并且在其被组织回收之前循环100-120天。循环的RBC连续释放逐渐降低其表面体积比并增加其密度的微颗粒。

为了研究该装置的敏感性分辨对于基于其不同的体积质量密度分离新(1.09g/mL)和老(1.11g/mL)RBC而言是否足够精确，由梯度分离的应该标记的新老RBC的混合物在30mM Gd+中悬浮。

为了进行荧光标记，分离新老RBC。RBC(10％红细胞比容)通过静脉穿刺或指尖收集并且在HBSS⁺⁺中洗涤3次。RBC在13mL的含77％Percoll、10％1.5M NaCl、和13％ddH₂O,的溶液中分层之后在15000xg下离心20分钟，制动器关闭。收集最上层的新RBC，洗涤以去除Percoll溶液，并且在1mL HBSS⁺⁺中重悬。类似地，收集分离到溶液底部的老RBC、洗涤并且在1mL HBSS⁺⁺中重悬。

初始在毛细管中随机分布的RBC在暴露于磁场时开始聚焦于不同的悬浮高度(按照图2d中所示的时间延迟照片)。在其相应平衡悬浮高度处的荧光标记的新老RBC示于图2e。

使用平衡过程的时间延迟记录，新老RBC的聚焦高度的特异性平衡时间功能经分析评价，如图2f所示。简言之，测量新老RBC距离底部磁体的平衡高度，并且发现分别是0.156mm和0.092mm。使用图7来计算各细胞和悬浮液体之间的密度差异，其用等式11绘制。通过将密度差异代入等式14和15，绘制平衡时间，其可示于图2f。

也测试了该装置悬浮重力沉淀的细胞的能力。将RBC加载到玻璃毛细管中，然后放在平台上持续15分钟直至所有的细胞沿着毛细管的地步被动(重力)沉淀。然后将毛细管加载到磁性悬浮装置中。由于它们与悬浮液体相比的相对反磁性，细胞开始移动原理磁体并且向其密度以来的平衡点悬浮，如图2g所示。最后，使用时间延迟显微术对随时间变化的细胞在磁性聚焦期间的位置进行定量，如图2h所示。

实施例3：功能改变的血细胞的静止悬浮

PMN是巨噬细胞，其能够感受并响应微生物特异性危险信号，之后特异性结合并内化外来微生物或颗粒。细胞吞噬事件导致形成(ROS)和ROS-接到的水解酶活化。ROS和活性氮物质(RNS)的生成将导致巨噬细胞的磁场特征变化，其中吞噬作用期间胞内和胞外过程之间的动态相互作用将直接影响活化的PMN的体积质量密度。

新鲜分离的PMN通过将其与缓冲液(静息PMN)、GSH-ME(GSH-处理的PMN)、或10nM PMA(活化的PMN)孵育5分钟，洗涤2次，混合，并且将其在35mM Gd+溶液中重悬来活化。在处理之前，用细胞追踪绿(活化的PMN)或细胞掩蔽深红(GSH-处理的PMN)来标记细胞。

通过将PMN与(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA，10nM)孵育10分钟来研究吞噬作用活化阶段人PMN的响应。作为对照，将PMN置于缓冲液中持续10分钟。然后洗涤细胞、荧光标记、混合在一起，并加载到磁性悬浮装置中。磁性聚焦显示了对照和活化的PMN之间在尺寸、形状、光学密度、以及磁性和质量密度特征方面的不同差异，如图3a所示。

活化的PMN生成胞内顺磁性ROS，其主动降低细胞和悬浮介质的磁化率之间的差异。因此，与缓冲液处理的PMN相比，活化的PMN将预期“下沉“。然而，结果显示由细胞活化促进的密度降低比磁性的瞬时增加更为明显，并且因此，细胞比对照悬浮至更高的高度。

通过测量由(周长²/(4π*面积))定义的细胞圆度来评价活化和正常PMN之间的形态差异。图3c中所示的计算的圆度差异显示PMA-活化的和缓冲剂处理的PMN之间的显著差异。同时通过流式细胞术检验相同样品的与PMA活化相关的PMN的直射和散射性质，如图3d所示。当与流式细胞术比较时，磁性悬浮允许细胞的直接可视化，以及增加的形状和尺寸监测敏感性和分辨率，同时提供了基于逐个细胞的实时密度测量。

为了进一步理解胞内ROS对悬浮细胞的最终位置的影响，使用了一种ROS清除剂，细胞穿透性谷胱甘肽(GSH)。图3e所示的结果显示，GSH-处理的PMN以更接近静息PMN的方式平衡，而活化的、低密度PMN如预期那样聚集在这两组上。

为了测试该装置的密度分辨率，悬浮了PMN、淋巴细胞和血小板的混合物。静息PMN的高度放大成像显示，虽然大多数细胞是未活化的，如图3f中的箭头所示的一些通过形状变化和高度位置(指示较低细胞密度)显示出活化的早期迹象。另外，污染嗜酸粒细胞位于PMN柱的底部，这与其密度等于或大于致密PMN相一致，如图2a所示。在连续悬浮后2小时，如图3g所示，PMN经过自活化，之后经过整联蛋白介导的同型聚集。

值得注意的是，一些PMN簇也显示出与未活化的PMN相比较低的位置，表明在活化期间形成的胞内顺磁性ROS物质也影响细胞的限制高度。接着，通过将新分离的PMN与荧光标记的蒙得维的亚沙门氏菌(Salmonella Montevideo)孵育来研究人PMN吞噬作用期间的密度变化。为了允许PMN吞噬作用，向含有600μL的HBSS/0.1％BSA的微量离心管加入细胞追踪绿-标记的PMN(5×10⁵)。以10:1的比率向PMN加入经血清调理的Alexa-594-标记的蒙得维的亚沙门氏菌(1×10⁶)，并且混合物通过在8rpm下翻转在37℃下孵育10分钟。PMN经洗涤，与Hoechst 33342-标记的静息PMN混合，并且在35mM Gd+溶液中重悬。使用的蒙得维的亚沙门氏菌(美国典型培养物保藏中心)在Bacto营养肉汤(迪菲克公司(Difco))中过夜生长并且定量(0.5OD₆₀₀＝4.5×10⁸细胞/mL)。细菌经温和形成团块、洗涤，并在HBSS中重悬。

该研究的细胞培养物示于图3h。结果显示，虽然在摄取的沙门氏菌的数量(初始如图3h中红色显示，虽然现在由于图像的灰度转化而不太明显)和PMN的限制高度之间没有清晰的关系，但吞噬活性PMN有明显降低的密度。

实施例4：磁性悬浮的血细胞的功能性调查

磁性悬浮装置允许在各时间点上获得高分辨图像，之后研究群中单独细胞的独特响应。这提供了在逐个细胞的基础上随时间对给定群进行广泛形态和功能作图的能力。

提出的平台允许通过使限制细胞的特定区域暴露于低强度激光束来进行单细胞操作，这使得能通过瞬时或局部改变钆溶液的磁性来对细胞或细胞群进行广泛时空高度调节，如图4a所示。

使用1.5-mm-厚的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)(MMC公司(McMaster Carr))来制造一个悬浮装置。将装置组件切割成图6b中给出的尺寸(VersaLASER；通用激光系统公司(Universal Laser Systems Inc.))。在该实验设置中，将具有1mm x 1mm(外缘，壁厚度0.2mm)方形截面的毛细管(VitroTubesTM方形毛细管微孔，硼硅酸盐玻璃8100，新泽西州格拉斯山的Vitrocom公司(Vitrocom,Mountain Glass,NJ))放在反亥姆霍兹构造的2个永久性钕磁体(NdFeB)之间。将2个金涂覆的镜以45度各放置在毛细管的开口侧以产生与常规显微系统相容的装置，用于对悬浮期间的细胞进行高分辨时空监测。已经设计并制造了具有易得的廉价组件和磁体的微流体芯片，其使得这种方法可在世界上被其他研究人员广泛使用。

在一个实验中，在RBC限制之后，使用Vector Photomanipulation单元(3i)用30mW，488nm激光束以0.34％强度照射稳定悬浮的RBC中部的20x20μm方形区域持续1分钟。在整个实验期间将激光束的靶标保持在相同细胞上。

在另一个实验中，UV照射悬浮的RBC、PMN和淋巴细胞的更大区域(900x900um)。为了使照射持续，由于悬浮介质的磁性增加，逐渐增大细胞悬浮高度。在UV照射关闭之后，细胞立即开始恢复到其原始位置，虽然RBC在比原始较低的高度平衡，潜在表明胞内UV诱导的ROS增加了RBC的顺磁性特征。在UV照射打开和关闭时获取细胞培养物，如图4b所示。

与UV-诱导的ROS增加了RBC的顺磁性特征相的这一可能性相一致，在具有增加的细胞密度的区域中，RBC形成不同第二的聚集体，如图4b中的红色圆圈所示，可能是由于含ROS的RBC之间的弱顺磁性吸引。为了检验这种假设，使用突然出现的胞外ATP来从血红蛋白中解离2-3DPG(2,3-二磷酸甘油酸)，这是一种也将RBC从反磁性转化成弱顺磁性细胞的过程。分离的RBC经洗涤并在含有40mM Gd+和10mM笼蔽ATP的HBSS⁺⁺(生命技术公司(Life Technologies))中重悬。将RBC加载到放在磁体之间的毛细管中，并使其聚焦。接着，选择位于悬浮RBS之上约70μm的60x900μm的区域并用488nm激光束以100％强度照射1秒。释放到悬浮物中的未笼蔽ATP将ATP的胞外浓度从0增加至接近10mM。用Slidebook 5.5记录细胞。

在光裂解之后，笼蔽ATP变成ATP，使生物活性的胞外ATP的浓度从0有效增加至10mM。与胞内(约1-1.3mM)相比胞外ATP(10mM)的高浓度促进了胞内ATP的突然增加，之后从血红蛋白解离2,3DPG，以及RBC的磁性变化，这倒置顺磁性介导的细胞聚簇(图4c中的圆圈表示)以及悬浮丧失。在RBC接近底部磁体时(图4c中的箭头所示)，顺磁性RBC与磁体之间的相互作用逐渐增加，最终克服了簇形成RBC之间的弱顺磁性相互作用，并导致RBC簇的逐渐分散。

实施例5：用于临床POC诊断的基于磁性悬浮的方法的多用性

为了证明这种基于磁性悬浮的方法在不同细胞类型上的广泛应用性，使用了循环癌细胞和镰状RBC。转移是导致恶性细胞从原发位置扩散到另一个不相邻位置的过程。当恶性细胞从肿瘤脱离时，它们通过血流或淋巴系统迁移至身体的其他区域，变成循环肿瘤细胞(CTC)。

使用的乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自美国典型培养物保藏中心并在补充10％FBS、100单位/mL青霉素、和100μg/mL链霉素的DMEM中培养并维持在37℃和5％CO₂下。

通过将用细胞穿透性DNA特异性染料Hoechst 33342预染色的乳腺癌细胞(CTC)掺入正常血液来制备异质细胞群。然后将细胞混合物在20mM Gd+溶液中磁性聚焦15分钟，这允许仅悬浮PMN和淋巴细胞，而不悬浮RBC。易于从多细胞悬浮物中鉴定CTC，如图5a中的带蓝色核的细胞所示，在上排，该悬浮物限制接近毛细管的中心，分别距离淋巴细胞和PMN数十至数百微米。

另外，显示从健康供体和对镰状细胞纯合的患者(SS)中分离的RBC可基于它们对10mM偏亚硫酸氢钠-诱导的脱水的单独响应而迅速并特异性分离，如图5c中所示。

从健康和镰状细胞疾病患者分离的RBC洗涤三次并在室温下用10μM偏亚硫酸氢钠孵育10分钟。如上所述悬浮细胞并且在10分钟后记录图像。为了增加细胞对背景的对比度，使用边缘检测算法(Roberts)来过滤图像。这种处理使镰状RBC的亚群(可能更新的RBC)比健康RBC明显更致密。

实施例6：循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤微栓(CTM)的无标记检测

参考图8-11，显示了对循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤微栓(CTM)的无标记检测。

参考图8，使用磁性悬浮系统来鉴定非小细胞肺癌(NSCLC)的CTC和CTM，其中这些癌细胞比血细胞群悬浮更高，如作图所示。在右图中，显示了相应概况，其鉴定了特定距离(即，悬浮高度)处的标准化细胞数量。从标记的峰中可以看出癌细胞和微栓向上与白细胞分离，白细胞保持在较低的高度处。

现在参考图9，也用磁性悬浮系统监测NSCLC患者血液样品中的CTC。虚线白色圆圈表示患者血液样品中的CTC。

参考图10，显示了乳腺癌细胞的分离效率。已经证明掺入血液样品中的癌细胞可与血细胞高效分离。在图10a中，提供了显微照片，其中荧光标记的乳腺癌细胞(MDA)掺入血液中并用悬浮系统分离。图10a中的插图显示了3个大点，其是表示的MDA。图10b显示了不同浓度掺入血细胞中的乳腺癌细胞的分离效率。该数据确定悬浮系统可容易地应用于用于癌症诊断和预后应用的CTC和CTM定量。

该装置也能够从血细胞中鉴定其他癌细胞。例如，如图11所示，健康和白血病患者的外周血单核细胞(PBMC)在分离后显示出不同的细胞概况(即，白血病细胞的高度高于PBMC的高度)。

实施例7：单细胞水平实时监测细胞对环境因素的响应

如图12所示，可在单细胞水平上进行细胞对环境因素的响应的实时监测。具体地，图12显示了施加盐酸(HCl)后单个细胞的实时密度变化。

图12a显示了对照(未处理)和HCl-处理的MDA乳腺癌细胞的显微照片，其中对照细胞保持其悬浮高度(即，密度)，但其中施加HCl的细胞在接触100mM HCl的40分钟内沉入通道底部(即，z＝-500μm)。

图12b详细显示了对施加HCl的单个细胞的实时观察，其中也使用对活细胞的钙黄绿素(绿色荧光)和对死细胞的碘化丙啶(红色荧光)来进行活力实验。荧光图像和亮场图像互相重叠以组成不同时间点的显微图像。在细胞沉淀到通道底部并且密度增加的同时，细胞上的荧光概况从绿色变成红色表示正在死亡的细胞。这显示在700秒的跨度上实时显示细胞死亡和这种细胞死亡与密度变化和悬浮高度变化的相关性。

图12c显示了酸处理的单个细胞的实时密度测量，其中显示，即使同时向细胞施加酸，各细胞由于细胞异质性而有不同表现。

例如，显示了如何监测环境因素(例如，pH、温度、化学物等)在细胞密度变化时对细胞的影响。这可用于分析细胞异质性，其有助于理解癌症、免疫应答、感染性疾病、耐药性和进化。

实施例8：用于药物筛选应用的实时监测

悬浮系统也允许在药物处理之后实时评价细胞概况用于药物筛选应用(例如，抗生素、化疗)，一般如图13-15中所示。可使用磁性悬浮系统快速观察感染期间和药物处理(例如，抗生素、抗真菌药物、抗癌药物)期间细胞概况的变化。

如图13所示(并且，具体地，图13的右下组图)，使用磁性悬浮介导的平台来监测未处理的和氨苄青霉素处理的细菌(例如，大肠杆菌)细胞之间的磁性悬浮高度的显著变化。在细胞响应刺激和抗生物时，它们的密度变化。这直接反映于它们的悬浮高度。

可实时使用类似技术来监测细菌中抗生素耐药性的出现。可通过监测活/死细菌随着它们的悬浮高度的变化来评价抗生素耐药性，悬浮高度在观察的细菌密度中发生改变，该密度在接触抗生素之后动态变化。

参考图14，显示了尚未或已经接触各种药物处理持续一段时间的酵母细胞的磁性悬浮和特征。图14a显示了在不同药物处理(例如，无药物处理/对照，100μM斑蝥素，或100μM氟康唑)24小时后酵母细胞的活力。观察到不同的活力并且显示了各药物处理的光学密度。图14b提供了显示在15分钟的磁性悬浮后，在用100μM斑蝥素和100μM氟康唑进行药物处理24小时后酵母细胞的悬浮高度、磁性和固有磁性特征如何变化的显微照片。

现在参考图15，该图提供了与观察到的药物响应和观察到的药物磁性概况变化相关的数据。图15a显示了各种类型的药物接触(即对照，25μM氟康唑，50μM氟康唑，或100μM氟康唑)之后的光学密度(OD)概况。图15b显示了通道内的细胞分布，并且图15c显示了计算的单细胞密度。图15d提供了用不同浓度的药物(氟康唑)处理的细胞的各显微照片，处理浓度列于各显微照片之上。观察到用不同药物浓度处理后的细胞磁性概况和密度变化(同时在高度和扩散上，其分别显示细胞的健康状况和健康变化)。还注意到可在单细胞水平用磁性悬浮系统来监测这些变化。

参考图21，显示了在不同类型的抗生物处理之后，观察到的大肠杆菌细胞磁性悬浮概况的差异。用不同他类型的抗生素，包括1mg/mL氨苄青霉素(β-内酰胺类抗生素)、环丙沙星(氟喹诺酮类抗生素)、和庆大霉素(氨基糖苷类抗生素)处理大肠杆菌细胞2小时。图21a、21b和21c中这些抗生素各自的磁性悬浮概况分别与对照(即，未处理的大肠杆菌细胞)比较。这些数据显示不同的抗生素处理以不同方式改变悬浮高度和细胞磁性概况。

另外参考图22，显示了在不同类型的抗生物处理之后，观察到的多重耐药性大肠杆菌细胞磁性悬浮概况的差异。在这些实验中，使用磁性悬浮系统研究不同抗生素(分别是氨苄青霉素、环丙沙星和庆大霉素)对多重耐药性大肠杆菌的影响。这种临床分离株对氨苄青霉素和环丙沙星有耐药性，但对庆大霉素易感。因此，在用1mg/mL氨苄青霉素和环丙沙星处理2小时后，在悬浮高度和磁性悬浮概况上没有显著变化，分别如图22a和22b所示。在另一方面，在用1mg/mL庆大霉素处理2小时后，悬浮高度和磁性悬浮概况有显著变化，如图22c所示。

因此，磁性悬浮系统具有测试抗菌治疗功效的潜力并且磁性悬浮系统可用于抗菌易感性测试应用。

实施例9：实时监测癌细胞中出现耐药性

这些相同类型的技术可用于实时监测癌细胞中出现耐药性。可通过监测在磁性悬浮期间观察到的细胞概况中变化的悬浮高度来评价癌细胞耐药性，所述细胞概况在接触抗癌药物之后动态变化。考虑也可使用这些实时方法来研究药物治疗的功效。

实施例10：在单细胞水平上对细胞异质性进行实时检测

值得注意的是，该技术能够在单细胞水平上实时检测细胞异质性，如图12所示，并且确定不同的细胞可能由于许多细胞因素而有不同响应。

类似地，这意味着可以单细胞分辨率实时监测不同细胞的药物响应的异质性。例如，进行对酸处理的单细胞的实时密度测量并且以单细胞分辨率观察到细胞响应的变化。即使同时向细胞施加酸，各细胞由于细胞异质性而有不同表现，其在图12c中精确显示。

因此，使用这种实时悬浮系统，考虑可先表征某些细胞群再处理。这种细胞群中细胞表现的差异可能是固有的，但是以单细胞分辨率监测细胞响应环境因素变化或响应不同治疗条件的能力提供了一种研究细胞群响应方式的复杂方式，这种响应可能对于更好地理解这些系统中的背后机制、行为和响应并提供游离的测试工具而言是宝贵的。

实施例11：活细胞和死细胞的检测和分离

除了图12和13中观察到的实验结果以外，可使用该平台来分离活细胞和死细胞。这潜在允许检测并表征细胞群或者潜在允许活细胞群与死细胞群互相分离。这种检测和分选可能纳入测试方案或选择性获得细胞样品的某些变体。

实施例12：细胞周期概况以及细胞衰老和老化概况

该系统或平台也可用作观察细胞周期的工具并且可用于基于其观察到的行为来表征某些类型的细胞。

如图16所示，出芽酵母细胞在细胞周期的不同阶段有不同密度。另外，该平台还显示观察到的细胞(即，酵母细胞)概况在细胞周期期间变化。例如，如图16所示，处于M-期的酵母细胞的悬浮高度比处于S-期的细胞大。

图17中提供了观察到的其他概况，其显示酵母中的细胞衰老和老化。随着酵母细胞老化，出现了许多生理和生物变化。例如，细胞尺寸增加、细胞周期减缓、细胞形状改变、细胞核趋于更大和/或更片段化、并且细胞变得不育。提供的老酵母和新酵母(分别是左图和中图)的显微照片显示较新和较老的酵母群有不同概况。这些概况还可在最右图中表征，其中在各种悬浮高度(即，距离)处提供标准化的细胞数量。因此，可在最右图中生成并比较2个非常不同的概况以显示特定细胞群的健康情况，并且此外，由于数据收集的实时性质，其可用于产生表征观察的细胞群的老化的顺序概况。

实施例13：微生物和病原体鉴定

如图18所示，可使用这一平台和系统来鉴定微生物和病原体。可使用基于磁性悬浮的平台按照其磁场形式从混合培养物中鉴定并分离低浓度的单独微生物(即，细菌、酵母、真菌、病毒)。例如，酵母和细菌细胞有不同的特征性磁性分布或概况。如图18所示，在使用系统时，通道的中部主要包含细菌细胞，而通道的底部主要包含酵母细胞。

实施例14：使用磁性概况区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种

还考虑可使用磁性概况和细胞分布来区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌有不同的表面性质。例如，革兰氏阳性细菌细胞壁由厚肽聚糖层(20-80nm)和磷壁酸组成。革兰氏阴性细菌细胞壁要复杂得多，由外膜(7-8nm)和薄肽聚糖层(1-3nm)组成。另外，由于存在外膜以及脂多糖(LPS)，革兰氏阴性菌有较高的脂质和脂蛋白含量。因此，由于细胞壁的不同组成，革兰氏阴性和革兰氏阳性菌有不同密度，并且可使用磁性悬浮原理实时检测并监测这些差异。

实施例15：检测病毒感染细胞

参考图19，提供了健康和丙肝病毒(HCV)感染的肝细胞的显微图像和相应磁性概况。感染的细胞与健康细胞在密度和磁性概况上明显有区别。该数据清楚表明肝细胞的磁性分离概况可在其被丙肝病毒(HCV)感染时有显著变化，如最下图所示。

实施例16：早期糖尿病检测

最后，也可使用该平台来观察其他类型的细胞变化。在图20中，提供了无糖尿病和糖尿病小鼠(I型糖尿病)的血红细胞的磁性概况。I型糖尿病小鼠的血红细胞的细胞密度概况显示与来自健康细胞的血红细胞不同。因此，该装置提供了通过监测悬浮高度变化对糖尿病进行早期诊断的新方式。

在上述实施例中，使用了以下抗体和试剂：Hoecsht 33342(H1399，俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR))；汉克斯平衡盐溶液(14025-092)，细胞掩蔽深红质膜染色(C10046)，细胞追踪绿，CMFDA(C-7025)，NPE-笼蔽ATP(A-1048，纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies,Grand Island,NY))；(17-5442-03)，(17-0891-01，宾夕法尼亚州匹兹堡的GE医疗公司(GE Healthcare,Pittsburgh,PA))；4％w/v柠檬酸盐(S5770)，葡聚糖T500(31392)，还原性谷胱甘肽乙酯(GSH-ME，G1404)，偏亚硫酸氢钠(S9000)，氯化钠(S5886，密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,MI))；(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA,1201，英国布里斯托的Tocris公司(Tocris,Bristol,United Kingdom))；VitroTubes^TM方形毛细管微孔，硼硅酸盐玻璃(8100，新泽西州格拉斯山的Vitrocom公司(Vitrocom,Mountain Glass,NJ))；钆基(Gd+)顺磁性介质(新泽西州普林斯顿市的博莱科诊断公司(Bracco Diagnostics,Princeton,NJ))；Critoseal^TM(宾夕法尼亚州匹兹堡的费舍尔科学有限公司(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA))。

在上述的示例中，为了将样品加载到毛细管中，将毛细管简单浸入样品瓶中，并且样品由于毛细作用力充入毛细管中。对于各实验，使用了新的毛细管。另外，除非另外说明，细胞在200μL的40mM钆溶液中重悬并且通过表面拉伸作用加载到1.0x1.0mm方形毛细管(壁厚度0.2mm)中将Critoseal^TM插入毛细管的任意末端以防止细胞在分析期间漂移。然后将毛细管加载到磁体之间的槽中并且使用Olympus BX62显微镜上的QImaging Emc²EMCCD相机或Zeiss Axioscope显微镜上的Qimaging EXi CCD相机来对细胞进行成像。为了得到高分辨图像，侧边成水平的荧光显微镜完全水平放置，并且使用无镜磁性悬浮装置。使用Slidebook 5.5.(3i，科罗拉多州丹佛(Denver,CO))、ImageProPlus 7(Media Cybernetics，马里兰州罗克维尔(Rockville,MD))和iVison 4.7(Biovision，宾夕法尼亚州埃克斯顿(Exton PA))来分析图像。

通过这些实施例，已经证明了微流体磁性悬浮平台的多用性，其允许实时分离和活化细胞，以及监测并定量各种形态属性，特定细胞活性和激动剂响应。本文所示的策略允许检验细胞对由笼蔽化合物(例如，ATP)导入的生物活性介导物的时空响应。该细胞的优势包括，但不限于(i)简单工作流，(ii)没有复杂的微米/纳米制造组件，(iii)可用于能高温高压处理的复用模块的一次性使用设计，(iv)对动态细胞:细胞交流，如抗原呈递细胞:T细胞和血小板:单核细胞相互作用的多维度、实时准生理研究。

磁性悬浮装置提供了多种生物技术应用，以及用于研究并监测多种基础细胞行为的平台。其提供了细胞生物学研究的独特能力，其中细胞密度影响并且可反映各种过程，如细胞周期、吞噬作用、凋亡和分化。该系统也对于细胞的磁化率敏感，并且因此可用于分析RBC(例如，储存的血液和镰状细胞)内的血红蛋白降解。监测多种细胞活性的能力对于药物发现、毒性测试和单细胞测试而言也可能是显著的。对悬浮细胞的实时监测，之后进行蛋白质和核酸分析，将潜在打开对仅在低重力条件下存在的独特信号转导机制研究的途径。

该平台允许基于校正重力和反向作用磁力之间的平衡测量细胞密度(例如，RBC，白细胞)并分离细胞。该设计的简明性、小尺寸和灵活性使得该系统也与用于远程医疗的移动装置相容并用于弱资源设置中来筛选并诊断感染疟疾的血红细胞和镰状细胞。该策略并不需要抗体、先进显微仪器或技术来进行可靠的诊断，也不需要显微专家。该策略在对多种正常和病理条件中细胞亚群的鉴定、分离和深度组学数据分析方面前景巨大。

已通过一个或多个优选的实施方式描述了本发明，但应理解除了明确描述的那些方案之外，许多等同方案、替代方案、变化方案和修改方案是可能实现的并在本发明范围内。