用于测量FVIII的反应性的方法与流程
本发明涉及在有具有在功能上替换凝固因子VIII(FVIII)的活性的物质存在下用于测量FVIII的反应性的方法(例如，用于测量FVIII活性或FVIII抑制剂滴度的方法)。本发明也涉及在有具有在功能上替换FVIII的活性的物质存在下用于测量FVIII的反应性的试剂盒等。
背景技术：
血友病是由FVIII或凝固因子IX(FIX)的先天性缺陷或功能障碍造成的出血性疾病。前者被称作血友病A，后者被称作血友病B。这两个基因都位于X染色体上；且由于它们是X-染色体-连锁的隐性遗传的遗传异常，发生该疾病的那些人中的99％或更多是男性。已知的是，流行率是10,000个男性出生中的大约1个，且血友病A和血友病B之间的比率是大约5∶1。
血友病患者中的主要出血部位包括关节内、肌肉内、皮下、口内、颅内、消化道、鼻内等。在它们中，重复的关节内出血可以发展成伴有关节障碍和行走困难的血友病性关节病，其最终可能需要关节置换。因此，它是降低血友病患者的生活质量(QOL)的一个主要因素。
血友病的严重程度与血液中的FVIII活性或FIX活性非常相关。具有小于1％的凝固因子活性的患者被归类为严重的，具有1％或更多至小于5％的活性的患者被归类为中等的，且具有5％或更多且小于40％的活性的患者被归类为轻度的。具有严重征状的患者(占血友病患者的大约一半)一个月几次地表现出出血征状(如果他们不接受以后描述的预防性替代疗法)，并且该频率与中等症状的患者和轻度症状的患者的频率相比明显更高。
除了血友病和获得性血友病以外，已知由von Willebrand因子(vWF)的功能异常或缺乏造成的血管性血友病(von Willebrand′s disease)是一种有关的出血异常。vWF不仅是血小板在血管壁的损伤部位处发生向内皮下组织的正常粘附所必需的，而且它也是与FVIII形成复合物并将血液中的FVIII保持在正常水平所必需的。在血管性血友病患者中，这些功能下降，从而导致止血功能障碍。
为了预防和/或治疗血友病患者中的出血，主要使用从血浆纯化的血液凝固因子或通过基因工程技术产生的那些。在严重的血友病患者中，认为通过FVIII或FIX替代疗法将血液中的FVIII活性或FIX活性维持在1％或更多对于预防出血征状的出现而言是有效的(非专利文献1和2)。另一方面，在血友病患者、特别是严重的血友病患者中，可能产生针对FVIII或FIX的抗体，其被称作抑制剂。当产生这样的抑制剂时，凝固因子制剂的效应被抑制剂阻断。所以，进行使用大量凝固因子制剂的中和治疗，或使用复杂浓缩物或活化的凝固因子VII制剂(FVIIa制剂)的旁路治疗。
血友病A中FVIII活性的测量主要通过基于激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的一阶段凝固测定(非专利文献3)和产色测定(它是使用纯化的凝固因子重构的系统)(非专利文献4)进行。
血友病A中FVIII抑制剂滴度的测量主要通过Bethesda测定或Nijmegen Bethesda测定(非专利文献5和6)进行。
近年来，发现了这样的双特异性抗体：其结合FIX和/或活化的凝固因子IX(FIXa)和凝固因子X(FX)和/或活化的血液凝固因子X(FXa)，并替代FVIII的辅因子功能，或更具体地，促进FIXa的FX活化的功能(非专利文献7和8；专利文献1、2和3)。所述双特异性抗体在功能上替代FVIII以改善由FVIII缺乏或功能异常引起的凝固反应的下降。例如，关于凝血酶产生和APTT(其为凝固反应的指示剂)，所述双特异性抗体会缩短从血友病A患者来源出的血浆的APTT(不论FVIII抑制剂的存在)，并增加凝血酶的产生。所述双特异性抗体的APTT-缩短效应与FVIII相比是显著的。这是因为，血浆中的FVIII仅在被活化的因子X(FXa)或凝血酶活化以后才显示出辅因子活性，而上述双特异性抗体不需要这样的活化过程，且由于该原因，更快速地表现出辅因子功能。
此外，得到了针对FIXa Fab和针对双特异性抗体的FX Fab的抗体，并且确定了来自动物试验的血浆样品中的双特异性抗体的浓度(非专利文献9)。
所述双特异性抗体替代FVIII的辅因子功能，因而影响测量FVIII本身的反应性的测定系统。例如，当通过基于APTT的一阶段凝固测定测量血浆FVIII活性以诊断血友病A的严重程度或监测施用FVIII制剂的患者中的FVIII制剂的药理学活性时，在有所述双特异性抗体存在下促进所述双特异性抗体的凝固时间缩短的作用会强烈地干扰，这会极大地损害测量的准确度。此外，当通过基于APTT的Bethesda测定确定血浆FVIII抑制剂滴度时，在有所述双特异性抗体存在下促进所述双特异性抗体的凝固时间缩短的作用会强烈地干扰，这会极大地损害测量的准确度。也就是说，在施用双特异性抗体的患者中，不可准确地测量FVIII活性和FVIII抑制剂滴度。因此，甚至在有双特异性抗体存在下能够测量FVIII活性和FVIII抑制剂滴度的方法是期望的。
引文列表
[非专利文献]
非专利文献1：N Engl J Med.2007；357(6)：535-44
非专利文献2：Thromb Res.2011；127(增刊1)：S14-7
非专利文献3：Thromb Diath Haemorrh.1962年5月15日；7：215-28
非专利文献4：Haemostasis.198919：196-204。
非专利文献5：Thromb Diath Haemorrh.1975；34(3)：869-72
非专利文献6：Thromb Haemost.1995Feb；73(2)：247-51。
非专利文献7：Nat Med.2012；18(10)：1570-74
非专利文献8：PLoS One.2013；8(2)：e57479。
非专利文献9：J Thromb Haemost.2014；12(2)：206-13支持信息
[专利文献]
专利文献1：WO2005/035756
专利文献2：WO2006/109592
专利文献3：WO2012/067176
[
技术实现要素：
]
[本发明要解决的问题]
本发明涉及在有具有在功能上替换FVIII的活性的物质存在下用于测量FVIII的反应性的方法，例如，用于测量FVIII活性或FVIII抑制剂滴度的方法。此外，本发明的一个目的是，提供在有具有在功能上替换FVIII的活性的物质存在下用于测量FVIII的反应性(诸如FVIII活性和FVIII抑制剂滴度)的试剂盒等。
[解决问题的手段]
为了解决上述问题，本发明的发明人产生了中和双特异性抗体的活性的物质，并且通过靶向测量FVIII的反应性的试验物品，检索了甚至在有双特异性抗体存在下确保准确度的测量条件。所以，本发明的发明人发现，通过使用适当浓度(例如，可以充分中和双特异性抗体时的浓度)的针对双特异性抗体的中和抗体，通过基于APTT的一阶段凝固测定可以准确地评价血友病A患者的血浆中的FVIII活性，并且还发现，通过基于APTT的Bethesda测定可以准确地评价携带FVIII抑制剂的血友病A患者的血浆中的FVIII抑制剂滴度。此外，本发明的发明人成功地发现了用在所述测量中的试剂盒，其含有针对具有FVIII-替换活性的双特异性抗体的中和抗体。本发明是基于这些发现并提供了以下：
[1]一种用于测量凝固因子VIII的反应性的方法，其中所述方法包括使(1)与(2)接触的步骤：
(1)血液来源的样品，其含有具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质，
(2)一种或多种物质，其中和所述具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质；
[2][1]的方法，其中所述具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质是结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX且结合凝固因子X和/或活化的血液凝固因子X的双特异性抗体；
[3][1]或[2]的方法，其中所述双特异性抗体是下述抗体中的任一种，其中第一多肽与第三多肽结合且第二多肽与第四多肽结合：
一种双特异性抗体，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：10的共有L链(Q499-z121/J327-z119/L404-k)；或者
一种双特异性抗体，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：38的共有L链(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)；
[4][1]至[3]中的任一项的方法，其中所述中和物质是一种或多种选自中和所述具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质的肽、多肽、有机化合物、适体和抗体的物质；
[5][2]至[4]中的任一项的方法，其中所述中和物质是一种或多种选自以下的抗体：一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子X的抗原结合位点；和一种双特异性抗体，其结合包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的抗原结合位点的Fab和包含结合凝固因子X和/或活化的凝固因子X的抗原结合位点的Fab；
[6][1]至[5]中的任一项的方法，其中所述中和物质是一种或多种选自以下抗体组合的组合：
(a)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；
(b)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；
(c)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；和
(d)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；
[7][1]至[6]中的任一项的方法，其中所述用于测量凝固因子VIII的反应性的方法是一种用于测量凝固因子VIII活性的方法或一种用于测量凝固因子VIII抑制剂滴度的方法；
[8]用于用在[1]至[7]中的任一项的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种选自以下的抗体：一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子X的抗原结合位点；和一种双特异性抗体，其结合包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的抗原结合位点的Fab和包含结合凝固因子X和/或活化的凝固因子X的抗原结合位点的Fab；
[9][8]的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种选自以下抗体组合的组合：
(a)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；
(b)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；
(c)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；和
(d)一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子X的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab包含结合活化的凝固因子IX的抗原结合位点；
[10]一种用于诊断患者的疾病严重程度的方法，所述患者被施用具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质，其中所述方法使用[1]至[7]中的任一项的方法；
[11]一种用于诊断患者中的抑制剂滴度的方法，所述患者被施用具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质，其中所述方法使用[1]至[7]中的任一项的方法；
[12]一种用于监测患者中的FVIII制剂的药理学活性的方法，所述患者被施用FVIII制剂和具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质，其中所述方法使用[1]至[7]中的任一项的方法；
[13][10]至[12]中的任一项的方法，其中所述患者是选自以下的患者：血友病A患者，获得性血友病A患者，血管性血友病(von Willebrand disease)患者和患有其中出现针对血液凝固因子VIII和/或活化的血液凝固因子VIII的抑制剂的血友病A的患者；
[14][8]或[9]的试剂盒，其中所述试剂盒是用于诊断患者的疾病严重程度，所述患者被施用具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质；
[15][8]或[9]的试剂盒，其中所述试剂盒是用于诊断患者中的抑制剂滴度，所述患者被施用具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质；
[16][8]或[9]的试剂盒，其中所述试剂盒是用于监测患者中的FVIII制剂的药理学活性，所述患者被施用FVIII制剂和具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质；和
[17][14]至[16]中的任一项的试剂盒，其中所述患者是选自以下的患者：血友病A患者，获得性血友病A患者，血管性血友病患者和患有其中出现针对血液凝固因子VIII和/或活化的血液凝固因子VIII的抑制剂的血友病A的患者。
[本发明的效果]
本发明提供了可以测量FVIII活性和FVIII抑制剂滴度的方法，不受具有FVIII-替换活性的物质的活性影响。具有FVIII-替换活性的物质包括结合FIX和/或FIXa和FX和/或FXa的双特异性抗体。
附图说明
图1显示了使用rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG在抗-FIXa/FX双特异性抗体的中和下执行的一阶段凝固测定的结果。当用缓冲液稀释FVIII-缺陷型血浆(其含有10U/dL或100U/dL重组FVIII，补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910)时(#3和#7)，证实了FVIII活性高于校正曲线的范围。另一方面，当用含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的缓冲液稀释FVIII-缺陷型血浆(其含有10U/dL或100U/dL重组FVIII，补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910)时(#4和#8)，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1和#5)。当用仅含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的缓冲液稀释含有10U/dL或100U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时(#2和#6)，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1和#5)。
图2显示了在用AQ1和AJ541或AQ1和AJ522中和抗-FIXa/FX双特异性抗体下执行的一阶段凝固测定的结果。当用缓冲液稀释FVIII-缺陷型血浆(其含有10U/dL重组FVIII，补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910)时(#4)，证实了FVIII活性高于校正曲线的范围。另一方面，当用含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ1和AJ541的缓冲液(#5)或含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ1和AJ522的缓冲液(#6)稀释FVIII-缺陷型血浆(其含有10U/dL重组FVIII，补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910)时，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1)。当用仅含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ1和AJ541的缓冲液(#2)或仅含有两类抗体AQ1和AJ522的缓冲液(#3)稀释含有10U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1)。
图3显示了在用AQ512和AJ114或AQ512和AJ521中和抗-FIXa/FX双特异性抗体下执行的一阶段凝固测定的结果。当用缓冲液稀释FVIII-缺陷型血浆(其含有10U/dL重组FVIII，补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体hBS23)时(#4)，证实了FVIII活性高于校正曲线的范围。另一方面，当用含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ512和AJ114的缓冲液(#5)或含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ512和AJ521的缓冲液(#6)稀释FVIII-缺陷型血浆(其含有10U/dL重组FVIII，补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体hBS23)时，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1)。当用仅含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ512和AJ114的缓冲液(#2)或仅含有两类抗体AQ512和AJ521的缓冲液(#3)稀释含有10U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1)。
图4显示了使用rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG在抗-FIXa/FX双特异性抗体的中和下执行的Bethesda测定的结果。仅含有抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910的FVIII抑制剂血浆(#3)表现出与校正曲线的FVIII的100％或更高等同的活性。另一方面，含有抗-FIXa/FX双特异性抗体和针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的FVIII抑制剂血浆(#4)表现出与不含添加剂的抑制剂血浆(#1)类似的FVIII抑制剂滴度。仅含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的FVIII抑制剂血浆(#2)表现出与#1的结果类似的结果。
具体实施方式
用于测量本发明的FVIII活性的方法包括使下面描述的(1)和(2)接触的步骤。否则，根据通常用于测量FVIII活性的方法可以进行所述方法。还将在实施例中解释细节。
(1)血液来源的样品，其含有具有在功能上替换FVIII的活性的物质
(2)一种物质，其中和所述具有在功能上替换FVIII的活性的物质
用于测量FVIII活性的方法
可以使用常用的且本领域技术人员已知的FVIII活性测量方法，例如，人们可以使用一阶段凝固测定(Casillas等人，(1971)Coagulation 4：107-11)，其使用因子VIII-缺陷型血浆(Sysmex，Kobe，日本)，这是基于凝固时间(aPTT测量)。例如，通过下述方法进行一阶段凝固测定。混合三种溶液：50μL10倍稀释的试验血浆，50μL FVIII-缺陷型血浆，和50μL APTT试剂；并将其在37℃温育5分钟，随后加入50μL钙溶液以开始凝固反应，然后测量达到凝固的时间。此外，替代试验血浆，测量系列稀释的正常血浆样品(在10倍稀释的正常血浆中的FVIII活性被指定为100％)，并通过在水平轴上绘制FVIII活性和在垂直轴上绘制凝固时间来产生校正曲线。使用校正曲线将试验血浆的凝固时间转化成FVIII活性，并计算试验血浆中的FVIII活性。在本文中，除非另外说明，短语“FVIII活性的测量”用作可能包括“活化的凝固因子VIII(FVIIIa)活性的测量”的短语。
除了一阶段凝固测定以外，凝血酶产生测定(TGA)、使用旋转thromboelastometry的测量方法、FVIII产色测定、凝固波形分析、凝血酶和活化的因子X产生测定等可以用作用于测量FVIII活性的方法。用于测量本发明的FVIII抑制剂滴度的方法包括使下述的(1)和(2)接触的步骤。否则，根据用于测量FVIII抑制剂滴度的常用方法可以进行所述方法。还将在实施例中解释细节。
(1)血液来源的样品，其含有具有在功能上替换FVIII的活性的物质
(2)一种物质，其中和所述具有在功能上替换FVIII的活性的物质
用于测量FVIII抑制剂滴度的方法
可以使用常用的且本领域技术人员已知的FVIII抑制剂滴度测量方法，例如，人们可以使用Bethesda测定(Kasper等人，(1975)Thrombos Diath Haemorrh 34：869-872)、ELISA方法和Nijmegen Bethesda测定(Nijmegen改进测定)(Verbruggen等人，(1995)Thromb Haemost 73：247-251)。例如，通过下述方法进行Bethesda测定。将通过混合等量的正常血浆和试验血浆而产生的溶液在37℃温育2小时，然后通过基于激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的一阶段凝固测定来测量正常血浆中的残余因子VIII活性。抑制正常血浆中的50％因子VIII活性的作用被指定为1Bethesda(1BU)，且因此以Bethesda的单位计算FVIII抑制剂滴度。当试验血浆中的FVIII抑制剂滴度较高且残余FVIII活性没有位于25％至75％的范围内时，使用用缓冲液适当地稀释的试验血浆重新计算Bethesda单位，并随后，将所述值乘以稀释比以计算试验血浆中的FVIII抑制剂滴度。
FVIII
FVIII是参与血液凝固的一系列分子之一，其表现出辅因子活性(当它被凝血酶或FXa活化时)并促进由FIXa实现的FX活化反应。
FVIII抑制剂
FVIII抑制剂是针对外来FVIII的同种抗体，且出现在20％至30％的血友病A患者中。最初正常的个体可能产生针对后来FVIII的自身抗体。通常，大多数FVIII抑制剂同种抗体和自身抗体作为抗-FVIII中和抗体起作用并降低或消除FVIII活性。
替换FVIII的活性
本发明的具有在功能上替换FVIII的活性的物质可以改述为具有FVIII-样活性的物质。在本发明中，短语“在功能上替换FVIII”是指，促进由FIXa实现的FX活化(促进由FIXa实现的FXa产生)。更具体地，在本发明中，短语“在功能上替换FVIII”是指识别FIX和/或FIXa、和FX和/或FXa，并促进FIXa对FX的活化(促进由FIXa实现的FXa产生)。使用例如包含FIXa、FX、合成底物S-2222(FXa的合成底物)和磷脂的测量系统，可以评价促进FXa产生的活性。这样的测量系统显示出在血友病A病例中疾病的严重程度和临床征状之间的关联(Rosen S，Andersson M，Blomba..ck M等人.Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity.Thromb Haemost 1985；54：811-23)。
本发明的具有在功能上替换FVIII的活性的物质的一个优选实施方案包括，例如，结合FIX和/或FIXa且结合FX和/或FXa的双特异性抗体。这样的抗体可以根据在例如WO2005/035756、WO2006/109592和WO2012/067176中描述的方法得到。本发明的双特异性抗体包括在这些文件中描述的抗体。
一种优选的双特异性抗体包括，例如，ACE910(Q499-z121/J327-z119/L404-k)(一种双特异性抗体，其中由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的H链和SEQ ID NO：10的L链发生结合，且由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链和SEQ ID NO：10的L链发生结合)和hBS23(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)(一种双特异性抗体，其中由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成的H链和SEQ ID NO：38的L链发生结合，且由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的H链和SEQ ID NO：38的L链发生结合)，它们是在专利文献(WO2012/067176)中描述的双特异性抗体。
中和
在本发明中中和所述具有在功能上替换FVIII的活性的物质的物质中的“中和”表示，例如，完全地或部分地抑制具有在功能上替换FVIII的活性的物质的在功能上替换FVIII的活性。例如，当具有在功能上替换FVIII的活性的物质是抗体时，在功能上替换FVIII的活性的完全或部分抑制可以通过完全地或部分地抑制抗体与抗原的结合来实现，但是不限于此。
中和物质
在本发明中在中和具有在功能上替换FVIII的活性的物质中的物质中的中和物质的术语“物质”表示，例如，结合具有在功能上替换FVIII的活性的物质的肽、多肽、有机化合物、适体、抗体等。
多个中和物质可以联合使用，且例如，可以联合使用抗体和适体。
多肽
本发明中的多肽通常表示具有大约10个氨基酸或更长的长度的蛋白和肽。通常，它们是生物学上来源出的多肽，但是没有特别限制于这样的多肽，且可以是例如包含人工设计的序列的多肽。此外，它们可以是任何天然多肽或合成多肽、重组多肽等。另外，在本发明的多肽中还包括上述多肽的片段。
有机化合物
在本发明中的有机化合物是，例如，低分子量化合物，优选地具有1000或更低的分子量。
适体
术语“适体”表示特异性地结合靶分子诸如多肽的核酸分子。例如，本发明的适体可以是能够特异性地结合具有FVIII-替换活性的物质的RNA适体。在本领域中充分确立了适体的产生和治疗用途。例如，通过使用SELEX方法(参见美国专利号5475096、5580737、5567588、5707796、5763177、6699843等)可以得到适体。
抗体
当具有在功能上替换FVIII的活性的物质是结合FIX和/或FIXa且结合FX和/或FXa的双特异性抗体时，结合具有在功能上替换FVIII的活性的物质的抗体的例子包括选自以下的抗体：结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIX的抗原结合位点；结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIXa的抗原结合位点；结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FX的抗原结合位点；结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FXa的抗原结合位点；和双特异性抗体，其结合含有结合FIX和/或FIXa的抗原结合位点的Fab且结合含有结合FX和/或FXa的抗原结合位点的Fab。上述抗体可以单独使用或多种联合使用。例如，可能使用多种抗体，所述抗体结合含有结合一类抗原的抗原结合位点的Fab，例如，结合含有结合FIX的抗原结合位点的Fab的多类抗体。例如，当具有在功能上替换FVIII的活性的物质是结合FIX和/或FIXa且结合FX和/或FXa的双特异性抗体时，可以使用下述抗体组合：
(a)一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FX的抗原结合位点；
(b)一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIXa的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FX的抗原结合位点；
(c)一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIXa的抗原结合位点；和
(d)一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIX的抗原结合位点；一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FX的抗原结合位点；和一种结合Fab的抗体，所述Fab含有结合FIXa的抗原结合位点。
结合含有结合FIX和/或FIXa的抗原结合位点的Fab的抗体的例子包括AQ8、AQ1和AQ512抗体。通过GENETYX 9版(GENETYX CORPORATION)分析可变区的核苷酸序列和由此预测的氨基酸序列。
AQ8的H链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
氨基酸序列：SEQ ID NO：1；和
核苷酸序列：SEQ ID NO：5。
AQ8的L链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
氨基酸序列：SEQ ID NO：2；和
核苷酸序列：SEQ ID NO：6。
AQ8的H-链CDR 1-3的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：12；
CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：13；
CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：14；
CDR1核苷酸序列：SEQ ID NO：15；
CDR2核苷酸序列：SEQ ID NO：16；和
CDR3核苷酸序列：SEQ ID NO：17。
AQ8的L-链CDR 1-3的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：18；
CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：19；
CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：20；
CDR1核苷酸序列：SEQ ID NO：21；
CDR2核苷酸序列：SEQ ID NO：22；和
CDR3核苷酸序列：SEQ ID NO：23。
结合含有结合FX和/或FXa的抗原结合位点的Fab的抗体的例子包括AJ540、AJ541、AJ522、AJ114和AJ521抗体。通过GENETYX Ver.9(GENETYX CORPORATION)分析可变区的核苷酸序列和由此预测的氨基酸序列。
AJ540的H链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
氨基酸序列：SEQ ID NO：3；和
核苷酸序列：SEQ ID NO：7。
AJ540的L链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
氨基酸序列：SEQ ID NO：4；和
核苷酸序列：SEQ ID NO：8。
AJ540的H-链CDR 1-3的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：24；
CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：25；
CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：26；
CDR1核苷酸序列：SEQ ID NO：27；
CDR2核苷酸序列：SEQ ID NO：28；和
CDR3核苷酸序列：SEQ ID NO：29。
AJ540的L-链CDR 1-3的氨基酸序列和核苷酸序列由下述SEQ ID NO指示：
CDR1氨基酸序列：SEQ ID NO：30；
CDR2氨基酸序列：SEQ ID NO：31；
CDR3氨基酸序列：SEQ ID NO：32；
CDR1核苷酸序列：SEQ ID NO：33；
CDR2核苷酸序列：SEQ ID NO：34；和
CDR3核苷酸序列：SEQ ID NO：35。
术语“抗体”以最宽的含义使用，且可以是单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体来源物、和修饰的抗体产物(Miller K等人.J Immunol.2003，170(9)，4854-61)，只要它们表现出期望的生物活性。所述抗体可以是小鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或从另一个物种来源出的那些，或它们可以是人工合成的抗体。本文公开的抗体可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。所述免疫球蛋白可以源自任何物种(例如，人、小鼠或兔)。术语“抗体”、“免疫性球蛋白”和“免疫球蛋白”在广义上互换使用。
术语“抗体来源物”包括抗体的一部分，优选抗体可变区，或至少抗体的抗原结合区域。抗体来源物包括，例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、直链抗体和单链抗体(scFv)、sc(Fv)2、Fab3、结构域抗体(dAb)(WO2004/058821、WO2003/002609)、双体、三体、四体、微体和从抗体来源物形成的多特异性抗体，但是不限于此。在这里，“Fab”从单个轻链和单个重链的CH1结构域和可变区构成。此外，“Fv”是最小抗体来源物，且包括完全抗原识别区域和抗原结合区域。所述抗体来源物可以是，例如，IgG抗体和Fc之间的融合体。例如，人们可以参考美国专利号5641870说明书中的实施例2；Zapata G等人.Protein Eng.1995，8(10)，1057-1062；Olafsen T等人.Protein Eng.Design&Sel.2004，17(4)：315-323；Holliger P等人.Nat.Biotechnol.2005，23(9)：1126-36；Fischer N等人.Pathobiology.2007，74(1)：3-14；Shen J等人.J Immunol Methods.2007，318，65-74；和Wu等人.Nat Biotechnol.2007，25(11)，1290-7。
修饰的抗体产物的例子可以包括与各种分子诸如聚乙二醇(PEG)连接的抗体。本发明的抗体包括这样的修饰的抗体产物。在本发明的修饰的抗体产物中要连接的物质没有限制。为了产生这样的修饰的抗体产物，可以对得到的抗体做出化学修饰。这样的方法在本领域中已经确立。
“双特异性的”抗体表示具有识别不同表位的可变区的抗体，其中所述区域是在相同抗体分子内。双特异性抗体可以是识别两种或更多种不同抗原的抗体，或者识别相同抗原上的两种或更多种不同表位的抗体。双特异性抗体可以不仅包括完整抗体，而且包括抗体来源物。本发明的抗体还包括双特异性抗体。在本文中，同义地使用抗-FIXa/FX双特异性抗体和结合FIXa和FX的双特异性抗体。
用于产生遗传工程改造的抗体的方法
使用基因工程技术产生的重组抗体可以用作抗体。可以如下得到重组抗体：从杂交瘤或抗体产生细胞(诸如产生抗体的敏化淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA，将它们插入载体中，然后将它们引入宿主(宿主细胞)中以产生抗体。
所述抗体包括人抗体、小鼠抗体和大鼠抗体，且它们的起源没有限制。它们也可以是遗传修饰的抗体诸如嵌合抗体和人源化抗体。
用于得到人抗体的方法是已知的。例如，可以用目标抗原免疫携带人抗体基因的整个组成部分的转基因动物以得到人目标抗体(参见国际公开WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096和WO 96/33735)。
使用已知方法可以产生遗传修饰的抗体。具体地，例如，嵌合抗体包含免疫的动物抗体的H链和L链可变区，和人抗体的H链和L链恒定区。可以如下得到嵌合抗体：将编码源自免疫动物的抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，将其插入表达载体中，然后将它引入宿主中以产生抗体。
人源化抗体是经修饰的抗体，其也被称作重新形成的(reshaped)人抗体。通过将源自免疫动物的抗体的CDR转移至人抗体的互补性决定区来构建人源化抗体。用于这类目的的常规基因重组技术是已知的(参见欧洲专利申请公开号EP 239400；国际公开号WO 96/02576；Sato K等人，Cancer Research 1993，53：851-856；国际公开号WO 99/51743)。
双特异性抗体是对两种不同抗原具有特异性的抗体。
尽管双特异性抗体不限于IgG类的那些，例如，IgG-型双特异性抗体可以从杂合的杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))分泌，所述杂交瘤通过融合两类产生IgG抗体的杂交瘤而产生(Milstein C.等人，Nature 1983，305：537-540)。它们还可以如下分泌：将构成两类目标IgG的L链和H链基因(共四类基因)引入细胞中以共表达所述基因。
在该情况下，通过将合适的氨基酸置换引入至H链的CH3区域，可以优先分泌具有H链的异质组合的IgG(Ridgway JB等人.Protein Engineering 1996，9：617-621；Merchant AM等人.Nature Biotechnology 1998，16：677-681；WO 2006/106905；Davis JH等人.Protein Eng Des Sel.2010，4：195-202)。
关于L链，由于L链可变区的多样性低于H链可变区的多样性，人们可以预见到得到共有L链，其可以赋予对两个H链的结合能力。本发明的抗体可以是包含共有L链的抗体。通过将共有L链和两个H链的基因引入细胞中，可以有效地表达双特异性的IgG。
表位
抗体(其为中和本发明的具有在功能上替换FVIII的活性的物质的物质的一个实施方案)包括结合特定表位的抗体，所述特定表位与上述的抗体所结合的表位重叠，且优选结合相同表位的抗体。
抗体是否识别与另一种抗体所识别的表位相同的表位或者与其重叠的表位，可以通过针对所述表位的两种抗体之间的竞争来确认。使用措施诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光能量转移方法(FRET)和荧光测量微体积测定技术(FMAT(注册商标))，通过竞争性结合测定，可以评价抗体之间的竞争。与抗原结合的抗体的量间接地与候选竞争抗体(试验抗体)的结合能力相关联，所述候选竞争抗体竞争性地结合相同的或重叠的表位。换而言之，随着针对相同或重叠表位的试验抗体的量或亲和力增加，与抗原结合的抗体的量减少，且与抗原结合的试验抗体的量增加。具体地，将适当地标记的抗体和试验抗体同时加给抗原，然后使用所述标记检测结合的抗体。通过预先标记所述抗体，可以容易地确定与抗原结合的抗体的量。该标记没有特别限制，且根据使用的测定技术选择标记方法。标记方法的具体例子包括荧光标记、放射性标记和酶标记。
在本文中，“结合重叠表位的抗体”或“结合相同表位的抗体”表示这样的试验抗体：其在特定浓度可以使标记抗体的结合量减少至少50％，所述浓度是未标记抗体的结合使标记抗体的结合量减少50％时的未标记抗体浓度(IC50)的通常100倍，优选80倍，更优选50倍，甚至更优选30倍，且更优选10倍。通过本领域技术人员已知的方法，可以分析所述抗体识别的表位，例如，它可以通过蛋白质印迹法等来执行。
抗体产生方法
通过本领域技术人员已知的方法可以产生本发明的抗体。具体地，将编码目标抗体的DNA插入表达载体中。插入表达载体，使得所述表达将在表达调节区(诸如增强子和启动子)的控制下发生。接着，使用该表达载体来表达抗体，转化宿主细胞。在该步骤中可以使用宿主和表达载体的适当组合。
载体的例子包括M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript和pCR-Script。除了这些载体以外，例如，pGEM-T、pDIRECT或pT7也可以用于cDNA亚克隆和切除的目的。
具体地，对于使用用于产生抗体目的的载体，表达载体是有用的。例如，当宿主是大肠杆菌诸如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue时，表达载体必须具有允许在大肠杆菌中的有效表达的启动子，例如，lacZ启动子(Ward等人，Nature(1989)341，544-546；和FASEB J(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better等人，Science(1988)240，1041-1043)或T7启动子。这样的载体的例子包括上述的载体以及pGEX-5X-1(由Pharmacia制造)、“QIA表达系统”(由QIAGEN制造)、pEGFP和pET(在该情况下，宿主优选地是表达T7RNA聚合酶的BL21)。
所述载体可以含有用于多肽分泌的信号序列。在大肠杆菌的周质中产生的情况下，pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169，4397)可以用作用于多肽分泌的信号序列。使用例如氯化钙方法或电穿孔方法，可以将载体转移至宿主细胞。
除了大肠杆菌表达载体以外，用于产生本发明的抗体的载体的例子包括哺乳动物来源的表达载体(例如，pcDNA3(由Invitrogen Corp.制造)、pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，p5322)、pEF和pCDM8)、昆虫细胞来源的表达载体(例如，“Bac-至-BAC杆状病毒表达系统”(由GIBCO BRL制造)和pBacPAK8)、植物来源的表达载体(例如，pMH1和pMH2)、动物病毒来源的表达载体(例如，pHSV、pMV和pAdexLcw)、逆转录病毒来源的表达载体(例如，pZIPneo)、酵母来源的表达载体(例如，“毕赤酵母表达试剂盒”(由Invitrogen Corp.制造)、pNV11和SP-Q01)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的表达载体(例如，pPL608和pKTH50)。
为了在动物细胞(诸如CHO细胞、COS细胞或NIH3T3细胞)中表达的目的，所述载体必须具有细胞内表达所需的启动子，例如，SV40启动子(Mulligan等人，Nature(1979)277，108)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res(1990)18，5322)、CAG启动子(Gene(1991)108，193)或CMV启动子，且更优选地，具有用于筛选转化的细胞的基因(例如，药物抗性基因，其可以通过药物(新霉素、G418等)作为标志物起作用)。具有这样的性能的载体的例子包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
意图稳定地表达基因和增加细胞内基因拷贝的数目的一种示例性方法包括，用具有充当其补体的DHFR基因的载体(例如，pCHOI)转染核酸合成途径缺陷型CHO细胞，并在基因扩增中使用甲氨蝶呤(MTX)。意图短暂地表达基因的一种示例性方法包括，使用COS细胞(其在它们的染色体上具有表达SV40T抗原的基因)，以用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)转化所述细胞。还可以使用从多形瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等来源出的复制起点。用于增加宿主细胞系统中的基因拷贝数目的表达载体可以另外含有选择标志物诸如氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因或二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。通过上述方法得到的本发明的抗体可以从宿主细胞内或从细胞外(培养基等)分离，并纯化至实际上纯的和均匀的抗体。通过常规地用于分离和纯化抗体的方法可以分离和纯化抗体，且方法的类型没有限制。例如，通过适当地选择和组合柱色谱法、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、透析、重结晶等，可以分离和纯化抗体。
所述色谱法包括，例如，亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法和吸附色谱法(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996)。使用液相色谱法，例如，HPLC和FPLC，可以进行上述的色谱方法。用于亲和色谱法的柱包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A的柱包括，例如，Hyper D、POROS和Sepharose FF(GE Amersham Biosciences)。本发明包括使用这些纯化方法高度纯化的抗体。
可以将得到的抗体纯化至同质性。使用通常用于蛋白分离和纯化的分离和纯化方法，可以执行所述抗体的分离和纯化。例如，通过适当地选择和组合柱色谱法诸如亲和色谱法、过滤、超滤、盐析、透析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦等，但不限于此，可以分离和纯化抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。用于亲和色谱法的柱包括，例如，蛋白A柱和蛋白G柱。
用于得到样品的方法
在本发明中，血液来源的样品优选地是从试验受试者收集的血液来源的样品。这样的血液来源的样品可以得自施用了具有FVIII-替换活性的物质的试验受试者。试验受试者包括，例如，在身体中的任何部位处具有出血征状的患者(出血性疾病患者)。主要出血部位是关节内、肌肉内、皮下、口内、颅内、消化道、鼻内等，但是不限于此。出血性疾病患者优选地是具有由FVIII活性和/或FVIIIa活性的减少或缺乏造成的出血性疾病的患者。具有由FVIII活性和/或FVIIIa活性的减少或缺乏造成的出血性疾病的患者是具有出血征状的患者，且例子包括具有FVIII活性和FVIIIa活性中的任一种或两种的在先或在后减少或缺乏的患者。FVIII和FVIIIa的活性的减少是指，与健康个体的活性相比，这些活性在患者中优选地小于40％(例如，小于40％、小于30％、小于20％或小于10％)，更优选地小于10％(例如，小于10％、小于9％、小于8％、小于7％或小于6％)，甚至更优选地小于5％(例如，小于5％、小于4％、小于3％或小于2％)，且特别优选地小于1％，不限于此。
更具体地，这样的疾病的例子包括选自血友病(血友病A和血友病B)、获得性血友病和由von Willebrand因子(vWF)的功能异常或缺乏造成的血管性血友病的疾病，但是不限于此。血液来源的样品包括血清、血浆或全血。在本发明中，血浆样品的使用是优选的。用于从试验受试者得到血液来源的样品的方法是本领域技术人员众所周知的。
试剂盒
不同类型的试剂诸如用于测量本发明的FVIII的反应性的方法所需的缓冲剂可以预先包装并作为试剂盒提供。除了缓冲剂以外，本发明的试剂盒还可以包括从人(其血液中的FVIII活性和FIX活性是正常的)分离的血浆样品，具有FVIII-替换活性的物质，和可以在FVIII活性测量中使用的任何物品，或可以在FVIII抑制剂滴度测量中使用的任何物品。此外，根据它们的使用模式可以将在试剂盒中包括的不同类型的试剂制成粉末或液体形式。此外，可以将它们储存在适当的容器中并在适当时机使用。
例如，通过使用本发明的方法可以诊断施用了具有在功能上替换FVIII的活性的物质的患者的疾病严重程度。使用本发明的方法可以测量FVIII的反应性，且基于测量结果可以诊断/评估患者的疾病严重程度和/或抑制剂滴度。通过本领域技术人员已知的方法可以执行诊断和评估方法。
例如，通过使用本发明的方法可以监测施用了FVIII制剂和具有在功能上替换FVIII的活性的物质的患者中的FVIII制剂的药理学活性。通过本领域技术人员已知的方法可以进行监测。
本发明的试剂盒可以用作用于诊断患者的疾病严重程度的试剂盒，所述患者被施用具有在功能上替换FVIII的活性的物质。使用本发明的试剂盒可以测量FVIII的反应性，且基于测量结果可以诊断/评估患者的疾病严重程度。通过本领域技术人员已知的方法可以执行诊断和评估方法。
本发明的试剂盒可以用作，例如，用于监测施用了FVIII制剂和具有在功能上替换FVIII的活性的物质的患者中的FVIII制剂的药理学活性的试剂盒。通过本领域技术人员已知的方法可以进行监测。
例如，人们可以使用用于治疗患者的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)施用第一剂具有在功能上替换FVIII的活性的物质；
(b)监测所述患者中的FVIII的反应性；
(c)基于观察到的FVIII的反应性确定第二剂具有在功能上替换FVIII的活性的物质；和
(d)给所述患者施用第二剂具有在功能上替换FVIII的活性的物质。
此外，人们可以使用，例如，用于治疗患者的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在第一个施用间隔以后施用具有在功能上替换FVIII的活性的物质；
(b)监测所述患者中FVIII的反应性；
(c)基于观察到的FVIII的反应性，确定具有在功能上替换FVIII的活性的物质的第二个施用间隔；和
(d)在第二个施用间隔以后给所述患者施用具有在功能上替换FVIII的活性的物质。
人们还可以使用，例如，用于治疗患者的方法，所述方法包括：监测FVIII的反应性，和根据FVIII的反应性改变所述具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质的施用剂量和/或施用间隔。
所述具有在功能上替换FVIII的活性的物质优选地是结合FIX和/或FIXa且结合FX和/或FXa的双特异性抗体。它更优选地是下述的抗体，其为双特异性抗体，其中第一多肽与第三多肽结合且第二多肽与第四多肽结合。
双特异性抗体，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：10的共有L链(Q499-z121/J327-z119/L404-k)，或者
双特异性抗体，其中所述第一多肽是由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成的H链，所述第二多肽是由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的H链，且所述第三多肽和所述第四多肽是SEQ ID NO：38的共有L链(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)。
对于前述双特异性抗体，所述剂量是，例如，0.001mg/kg至100mg/kg。它优选地是大约0.001mg/kg、大约0.003mg/kg、大约0.005mg/kg、大约0.01mg/kg、大约0.03mg/kg、大约0.05mg/kg、大约0.1mg/kg、大约0.3mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg、大约3mg/kg、大约5mg/kg、大约10mg/kg、大约20mg/kg、大约30mg/kg、大约40mg/kg、大约50mg/kg、大约60mg/kg、大约70mg/kg、大约80mg/kg、大约90mg/kg和大约100mg/kg。在监测步骤之前和之后的剂量可以相同或不同。在前述双特异性抗体的情况下，施用间隔是，例如，至少1天或更久。所述间隔优选地是1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或1年。在监测步骤之前和之后的剂量间隔可以相同或不同。
本发明的方法或试剂盒的靶患者是，例如，血友病A患者，获得性血友病A患者，血管性血友病患者和出现了针对FVIII和/或FVIIIa的抑制剂的血友病A患者。
如本文中使用的，由表述“包含...”表示的实施方案包括由表述“基本上由...组成”表示的实施方案和由表述“由...组成”表示的实施方案。
在本文中明确地引用的所有专利和参考文件以它们的整体通过引用并入本说明书中。
实施例将进一步举例说明本发明，但是不应解释为限于此。
[实施例]
在下文中，实施例将具体地描述本发明，但是不应解释为限于此。
[实施例1]针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的抗体的产生和可变区的序列确定
尝试产生针对ACE910的抗体(Q499-z121/J327-z119/L404-k)(双特异性抗体，其中由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的H链与SEQ ID NO：10的L链结合，且由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的H链与SEQ ID NO：10的L链结合)，其为在专利文献3(WO 2012/067176)中描述的双特异性抗体。使用基因重组技术和胃蛋白酶消化来产生由抗-FIXa侧和抗-FX侧的各个Fab组成的F(ab′)2。
用抗-FIXa-F(ab′)2或抗-FX-F(ab′)2免疫小鼠和大鼠。按照一般方法对得自从小鼠或大鼠取出的脾或得自大鼠淋巴结的细胞进行与小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合以产生杂交瘤。通过ELISA评价杂交瘤的培养物上清液，所述ELISA检测ACE910与抗-FIXa-臂或抗-FX-臂的结合，并最终选择了小鼠抗体AQ8和AQ1以及大鼠抗体AQ512(其仅结合抗-FIXa-臂，但是不结合ACE910的抗-FX-臂)和大鼠抗体AJ540、AJ114、AJ521、AJ522和AJ541(其仅结合抗-FX-臂，但是不结合ACE910的抗-FIXa-臂)。另外，分析了AQ8抗体或AJ540抗体的可变区的核苷酸序列。使用GENETYXVer.9(GENETYX CORPORATION)分析了AQ8和AJ540的可变区的核苷酸序列和由此预测的氨基酸序列。
[实施例2]重组小鼠抗体AQ8和重组大鼠-兔嵌合抗体AJ540的表达载体的产生.
如下制备重组小鼠抗体AQ8：将在实施例1中得到的AQ8抗体的可变区序列与已知的小鼠IgG2b恒定区序列(重链：EMBL登记号J00461；轻链：EMBL登记号V00807)组合以产生全长抗体基因，然后将它插入表达载体中。类似地，通过将已知的兔IgG(重链：EMBL登记号L29172，轻链：EMBL登记号X00231)与AJ540抗体的可变区组合，产生重组大鼠-兔嵌合抗体AJ540。将产生的表达克隆质粒引入HEK293细胞中，执行大规模培养以及使用蛋白A和凝胶过滤的纯化，并产生重组小鼠抗体AQ8(rAQ8-mIgG2b)和重组大鼠-兔嵌合抗体AJ540(rAJ540-rbtIgG)。
[实施例3]使用rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG在抗-FIXa/FX双特异性抗体的中和下进行的一阶段凝固测定
向含有10U/dL或100U/dL重组FVIII(Kogenate FS，Bayer Yakuhin，Ltd.)的FVIII-缺陷型血浆(George King)中，加入0μg/mL或300μg/mL的抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910。此外，将每种制备的血浆样品分成以下两组以制备测量样品溶液：一组使用咪唑缓冲液(Kyowa Medex)进行10倍稀释；且一组使用补充了各300μg/mL的rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG的咪唑缓冲液进行10倍稀释。加入充分地中和ACE910所需的rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG的量。下面显示了所述组合的细节。
[表1]
此外，为了产生用于将凝固时间转化成FVIII活性的校正曲线，通过使用咪唑缓冲液执行10倍、20倍、40倍、80倍和160倍稀释(将各种校正曲线溶液的FVIII活性指定为93％、46.5％、23.3％、11.6％和5.81％)，制备标准血浆的溶液Coagtrol N(Sysmex)。混合50微升测量样品溶液或校正曲线溶液、50μL因子VIII-缺陷型人血浆(Sysmex)和50μL Thrombocheck APTT-SLA(Sysmex)，并在37℃温育5分钟。温育以后，加入50μL 0.02mol/L氯化钙溶液(Sysmex)以开始凝固，并使用自动化的血液凝固分析仪KC4Delta(Stago)测量凝固时间。
根据在校正曲线溶液的每种FVIII活性处的凝固时间，将测量样品的凝固时间转化成FVIII活性。
结果
结果显示在图1中。当用缓冲液稀释补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体的、含有10U/dL或100U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时(#3，#7)，证实了FVIII活性高于校正曲线的范围，且不可准确地测量。另一方面，当用含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的缓冲液稀释补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体的、含有10U/dL或100U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时(#4，#8)，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1，#5)。因此，这表明，针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的抗体完全中和了双特异性抗体的活性以实现血浆中的FVIII活性的准确测量，甚至在有双特异性抗体存在下。当用仅含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的缓冲液稀释含有10U/dL或100U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时(#2，#6)，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的那些活性(#1，#5)；因此，发现针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的抗体具有对所述双特异性抗体特异性的中和作用。
[实施例4]使用AQ1和AJ541或AQ1和AJ522在抗-FIXa/FX双特异性抗体的中和下进行的一阶段凝固测定
向含有10U/dL重组FVIII(Kogenate FS，Bayer Yakuhin，Ltd.)的FVIII-缺陷型血浆(George King)中，加入0μg/mL或10μg/mL的抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910。此外，将每种制备的血浆分成三组以制备测量样品溶液：一组使用咪唑缓冲液(Kyowa Medex)进行10倍稀释；一组使用补充了各100μg/mL的AQ1和AJ541的咪唑缓冲液进行10倍稀释；且一组使用补充了各100μg/mL的AQ1和AJ522的咪唑缓冲液进行10倍稀释。加入充分中和ACE910所需的AQ1、AJ541和AJ522的量。下面显示了所述组合的细节。
[表2]
此外，为了产生用于将凝固时间转化成FVIII活性的校正曲线，通过使用咪唑缓冲液执行10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍稀释(将各种校正曲线溶液的FVIII活性指定为102％、51.0％、25.5％、12.8％、6.38％、3.19％和1.59％)，制备标准血浆的溶液Coagtrol N(Sysmex)。混合50微升测量样品溶液或校正曲线溶液、50μL因子VIII-缺陷型人血浆(Sysmex)和50μL Thrombocheck APTT-SLA(Sysmex)，并在37℃温育5分钟。温育以后，加入50μL 0.02mol/L氯化钙溶液(Sysmex)以开始凝固，并使用自动化的血液凝固分析仪KC4Delta(Stago)测量凝固时间。
根据在校正曲线溶液的每种FVIII活性处的凝固时间，将测量样品的凝固时间转化成FVIII活性。
结果
结果显示在图2中。当用缓冲液稀释补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910的、含有10U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时(#4)，证实了FVIII活性高于校正曲线的范围，且不可准确地测量。另一方面，当用含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ1和AJ541的缓冲液(#5)或含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ1和AJ522的缓冲液(#6)稀释补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910的、含有10U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的活性(#1)。因此，这表明，不仅rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG，而且其它抗体组合，作为针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的抗体也会有效地完全中和双特异性抗体ACE910的活性。
[实施例5]使用AQ512和AJ114或AQ512和AJ521在抗-FIXa/FX双特异性抗体的中和下进行一阶段凝固测定
向含有10U/dL重组FVIII(Kogenate FS，Bayer Yakuhin，Ltd.)的FVIII-缺陷型血浆(George King)中，加入0μg/mL或10μg/mL的抗-FIXa/FX双特异性抗体hBS23。此外，将每种制备的血浆分成三组以制备测量样品溶液：一组使用咪唑缓冲液(Kyowa Medex)进行10倍稀释；一组使用补充了各100μg/mL的AQ512和AJ114的咪唑缓冲液进行10倍稀释；且一组使用补充了各100μg/mL的AQ512和AJ521的咪唑缓冲液进行10倍稀释。加入充分中和hBS23所需的AQ512、AJ114和AJ521的量。下面显示了所述组合的细节。
[表3]
此外，为了产生用于将凝固时间转化成FVIII活性的校正曲线，通过使用咪唑缓冲液执行10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍稀释(将各种校正曲线溶液的FVIII活性指定为102％、51.0％、25.5％、12.8％、6.38％、3.19％和1.59％)，制备标准血浆的溶液Coagtrol N(Sysmex)。混合50微升测量样品溶液或校正曲线溶液、50μL因子VIII-缺陷型人血浆(Sysmex)和50μL Thrombocheck APTT-SLA(Sysmex)，并在37℃温育5分钟。温育以后，加入50μL 0.02mol/L氯化钙溶液(Sysmex)以开始凝固，并使用自动化的血液凝固分析仪KC4Delta(Stago)测量凝固时间。
根据在校正曲线溶液的每种FVIII活性处的凝固时间，将测量样品的凝固时间转化成FVIII活性。
结果
结果显示在图3中。当用缓冲液稀释补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体hBS23的、含有10U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时(#4)，证实了FVIII活性高于校正曲线的范围，且不可准确地测量。另一方面，当用含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ512和AJ114的缓冲液(#5)或含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体AQ512和AJ521的缓冲液(#6)稀释补充了抗-FIXa/FX双特异性抗体hBS23的、含有10U/dL重组FVIII的FVIII-缺陷型血浆时，证实了FVIII活性类似于没有添加抗-FIXa/FX双特异性抗体的组的活性(#1)。这些表明，即使使用hBS23(不同于ACE910的双特异性抗体)，可以准确地测量血浆中的FVIII活性，尽管存在双特异性抗体(通过完全中和它的活性)，且因此本发明的方案对于具有FVIII-替换活性的各种双特异性抗体是有效的。
[实施例6]使用rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG在抗-FIXa/FX双特异性抗体的中和下进行的Bethesda测定
向因子VIII-缺陷型人血浆(含有FVIII抑制剂)(George King Bio-Medical)，加入0μg/mL或300μg/mL的抗-FIXa/FX双特异性抗体ACE910。此外，使用含有0.25％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)的咪唑缓冲液(Kyowa Medex)(在下文中被称作BSA-咪唑)对每种制备的血浆样品进行25倍稀释或30倍稀释。向Coagtrol N(Sysmex)(其为标准血浆)中，rAQ8-mIgG2b和rAJ540-rbtIgG没有加入，或者它们各自在300μg/mL加入。
在下述组合(共8类)中以等量混合两类制备的血浆样品，然后在37℃温育2小时。
[表4]
温育以后，将混合的溶液用BSA-咪唑进一步稀释10倍以制备测量样品溶液。此外，为了制备用于将凝固时间转化成FVIII活性值的校正曲线，通过在20倍、40倍、80倍、160倍和320倍稀释度用BSA-咪唑稀释Coagtrol N(各种校正曲线溶液的FVIII活性指定为100％、50％、25％、12.5％和6.25％)，制备溶液。
混合50微升测量样品溶液或校正曲线溶液、50μL因子VIII-缺陷型人血浆(Sysmex)和50μL Thrombocheck APTT-SLA(Sysmex)，并在37℃温育3分钟。温育以后，加入50μL 0.02mol/L氯化钙溶液(Sysmex)以开始凝固，并使用自动化的血液凝固分析仪KC4Delta(Stago)测量凝固时间。
根据在校正曲线溶液的每种FVIII活性处的凝固时间，将测量样品的凝固时间转化成FVIII活性。此外，当残余FVIII活性是50％时，将其指定为1Bethesda，并在计算测量样品的Bethesda值以后，将通过将所述值乘以25或30而计算的平均值确定为每种原始样品溶液中的抑制剂滴度。
结果
结果显示在图4中。仅含有抗-FIXa/FX双特异性抗体的FVIII抑制剂血浆(#3)表现出为校正曲线的FVIII的100％或更多的活性；因此，不可确定FVIII抑制剂滴度。
另一方面，含有抗-FIXa/FX双特异性抗体和针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的FVIII抑制剂血浆(#4)表现出与不含添加剂的抑制剂血浆(#1)类似的FVIII抑制剂滴度。因此，这表明，针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的抗体完全中和双特异性抗体的活性以实现血浆中的FVIII抑制剂滴度的准确测量，甚至在有双特异性抗体存在下。仅含有针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的两类抗体的FVIII抑制剂血浆(#2)表现出与#1的结果类似的结果；因此，发现针对抗-FIXa/FX双特异性抗体的抗体具有对双特异性抗体特异性的中和作用。
工业适用性
本发明提供了在有具有在功能上替换FVIII的活性的双特异性抗体存在下用于测量FVIII的反应性的方法，例如，用于测量FVIII活性或FVIII抑制剂滴度的方法。通过使用双特异性抗体，本发明的方法的应用能够在出血性疾病(诸如血友病)的治疗中准确地测量患者中FVIII的反应性。
序列表
<110> 公立大学法人奈良县立医科大学
中外制药株式会社
<120> 用于测量FVIII的反应性的方法
<130> C1-A1406P
<150> JP 2014-196974
<151> 2014-09-26
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8 VH
<400> 1
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8 VL
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Phe Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Ser Leu Lys Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asn Ser Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Arg Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540 VH
<400> 3
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Asn Val Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540 VL
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Ser Ile Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Asn Gln Asn Val Asp Phe Asn
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Met Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8 VH的核酸序列
<400> 5
gaagtgaacc tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ccggaggcag catgtctctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcacc gactactaca tgagctgggt ccgccagccc 120
cctggcaagg ctctggaatg gctggctctg atcagaaaca aggccaacgg ctacaccacc 180
gagtacagcg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacaacag ccagagcatc 240
ctgtacctgc agatgaacgc cctgcgggcc gaggactccg ccacctacta ctgcgccaga 300
gacagctact acagctacga cggctacgcc atggactact ggggccaggg caccagcgtg 360
accgtgtcta gc 372
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8 VL的核酸序列
<400> 6
gacatccaga tgacccagag ccctgcctcc ctggccgcct ctgtgggcga gacaatcacc 60
atcacctgtc aggccagcga gaacatctac ttcagcctgg cctggtatca gcagaagcag 120
ggcaagagcc cccagctgct gatctacaac accgacagcc tgaaggacgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcacccag tacagcatga agatcaacag catgcagccc 240
gaggacaccg ctacctactt ttgccggcag agctacgact tcccctggac cttcggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540 VH的核酸序列
<400> 7
cagatccagc tggtgcagag cggccctgag ctgaagaaac ccggcgagag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgcca tgcactgggt gaaacaggtg 120
cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcaa gcccacctac 180
gccgacgact tcaagggcag attcgtgttc agcctggaag ccagcgccag caccgccaac 240
ctgcagatca gcaacctgaa gaacgaggac accgccaacg tgttctgcgc cagagagggc 300
ggaggctact actggtactt cgacttctgg ggccctggca caatggtgac agtgtccagc 360
<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540 VL的核酸序列
<400> 8
gacatcgtga tgacccagag ccccaccagc atgagcatca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atgaactgca aggccaacca gaacgtggac ttcaacgtgg actggtatca gcagaaaacc 120
ggccagtccc ccaagctgct gatctacaag gccagcaacc ggtacacagg cgtgcccgac 180
agattcacag gcagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcaa catgcaggcc 240
gaggacctgg ccgtgtacta ctgcatgcag agcaacagct tccccctgac cttcggctcc 300
ggcaccaacc tggaaatcaa g 321
<210> 9
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8重链CDR1
<400> 12
Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8重链CDR2
<400> 13
Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8重链CDR3
<400> 14
Asp Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8重链CDR1的核酸序列
<400> 15
gactactaca tgagc 15
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8重链CDR2的核酸序列
<400> 16
ctgatcagaa acaaggccaa cggctacacc accgagtaca gcgccagcgt gaagggc 57
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8重链CDR3的核酸序列
<400> 17
gacagctact acagctacga cggctacgcc atggactac 39
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8轻链CDR1
<400> 18
Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8轻链CDR2
<400> 19
Asn Thr Asp Ser Leu Lys Asp
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8轻链CDR3
<400> 20
Arg Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8轻链CDR1的核酸序列
<400> 21
caggccagcg agaacatcta cttcagcctg gcc 33
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8轻链CDR2的核酸序列
<400> 22
aacaccgaca gcctgaagga c 21
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AQ8轻链CDR3的核酸序列
<400> 23
cggcagagct acgacttccc ctggacc 27
<210> 24
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540重链CDR1
<400> 24
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540重链CDR2
<400> 25
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540重链CDR3
<400> 26
Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540重链CDR1的核酸序列
<400> 27
gactacgcca tgcac 15
<210> 28
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540重链CDR2的核酸序列
<400> 28
tggatcaaca cctacaccgg caagcccacc tacgccgacg acttcaaggg c 51
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540重链CDR3的核酸序列
<400> 29
gagggcggag gctactactg gtacttcgac ttc 33
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540轻链CDR1
<400> 30
Lys Ala Asn Gln Asn Val Asp Phe Asn Val Asp
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540轻链CDR2
<400> 31
Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540轻链CDR3
<400> 32
Met Gln Ser Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540轻链CDR1的核酸序列
<400> 33
aaggccaacc agaacgtgga cttcaacgtg gac 33
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540轻链CDR2的核酸序列
<400> 34
aaggccagca accggtacac a 21
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> AJ540轻链CDR3的核酸序列
<400> 35
atgcagagca acagcttccc cctgacc 27
<210> 36
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人工序列
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Arg Ala Gly His Asn Tyr Gly Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
<210> 37
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人工序列
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr His Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440
<210> 38
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人工序列
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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