血清中可溶性Tim‑3蛋白作为诊断慢性肾病的标志物的制作方法与工艺

血清中可溶性Tim-3蛋白作为诊断慢性肾病的标志物技术背景本发明属于生物医学领域，涉及一种可用于诊断慢性肾病的标志物，具体涉及血清中可溶性Tim-3可作为诊断慢性肾病的标志物。

背景技术：
慢性肾脏病(chronickidneydiseases，CKD)是指由各种原因引起的慢性肾脏结构异常和功能障碍，其重要的临床表现便是慢性肾功能不全(CRF)。CKD肾功能不全的病理机制涉及复杂的炎症及免疫反应过程，缺少特异性诊治手段，这也是临床上CKD很难治愈的重要原因。因此了解患者炎症及免疫状态，寻求重要的诊疗靶标，将对CKD的临床诊治产生积极作用。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomainprotein-3,Tim-3)是最初发现的特异性表达于活化的Th1细胞表面的分子，在结构上属于Tim家族。Tim-3分子与其配体半乳凝素-9(Galectin-9，Gal-9)结合后可以发挥抑制功能，维持免疫稳态，是重要的炎症反应调控分子。在随后的研究中，人们发现Tim-3在机体内还存在着一种可溶性形式，即可溶性Tim-3。可溶性Tim-3可通过结合Gal-9竞争性拮抗膜Tim-3的功能，从而上调体内的炎症及免疫反应。因此，可溶性Tim-3也被认为是机体炎症情况的重要反映。研究人员在多种疾病中发现了可溶性Tim-3的异常表达；然而，可溶性Tim-3在慢性肾病中的表达情况目前国内外尚未见报道，其临床意义有待挖掘。因此，本研究通过检测CKD患者血清可溶性Tim-3的水平，分析CKD患者血清可溶性Tim-3水平与肾功能不全的关系，探讨其临床意义。

技术实现要素：
本发明的目的在于提供血清中可溶性Tim-3蛋白在诊断慢性肾病中的新用途。本发明的上述发明点为国内外首次报道，通过检测受试者血清中Tim-3蛋白的含量可以诊断受试者是否患有慢性肾病、可以判断慢性肾病患者处于哪个疾病分期、可以诊断慢性肾病患者肾功能的损伤程度、可以判断慢性肾病患者是否已经复发。使用血清中可溶性Tim-3蛋白来诊断慢性肾病是无创的一种新方法。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了一种检测血清中可溶性Tim-3蛋白含量的试剂在制备慢性肾病诊断产品中的应用。进一步，所述试剂包括利用免疫方法检测血清中可溶性Tim-3蛋白含量的试剂。优选地，所述试剂包括可溶性Tim-3蛋白的特异性抗体，更优选地，所述特异性抗体是单克隆抗体。进一步，所述产品包括能够判断受试者是否具有患有慢性肾病的风险的产品、能够判断受试者是否患有慢性肾病的产品、能够判断慢性肾病患者所处分期的产品，能够诊断慢性肾病患者肾功能损伤程度的产品，能够诊断慢性肾病患者是否复发的产品。进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。本发明的所述试剂盒包括检测血清中可溶性Tim-3蛋白含量的试剂。所述试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶等，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。优选地，检测血清中可溶性Tim-3蛋白含量的试剂包括针对可溶性Tim-3蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂盒包括但不限于酶联免疫法吸附测定(ELISA)试剂盒、时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)试剂盒及化学发光检测试剂盒。本发明的所述芯片附着针对可溶性Tim-3蛋白的特异性抗体。本发明的所述试纸附着针对可溶性Tim-3蛋白的特异性抗体。本发明还提供了一种慢性肾病诊断产品，所述产品包括能够检测血清中可溶性Tim-3含量的试剂。进一步，所述试剂包括可溶性Tim-3蛋白的特异性抗体。另外，所述产品还可包括可溶性Tim-3蛋白标准品。进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。本发明的所述慢性肾病包括肾小球肾炎、慢性肾炎、隐匿性肾炎、肾盂肾炎、过敏性紫癜肾炎、红斑狼疮肾炎、痛风肾、iga肾病、肾病综合征、膜性肾病、肾病综合征、糖尿病肾病、高血压肾病、多囊肾。本发明所述的针对可溶性Tim-3蛋白的特异性抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对Tim-3蛋白特异的抗体。例如，将纯化的人Tim-3蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人Tim-3蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。本发明的抗体包括可以阻抑Tim-3功能的抗体，也可以是不影响人Tim-3蛋白功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人Tim-3蛋白的片断或功能域致免疫而产生，而人Tim-3蛋白产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的Tim-3蛋白结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化Tim-3蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。本发明中“诊断慢性肾病”是指诊断慢性肾病是否发生、诊断发生慢性肾病的风险高低、诊断慢性肾病所处分期、诊断慢性肾病患者肾损伤程度，诊断慢性肾病是否复发。本发明的优点和有益效果：本发明的分子标志物存在于血清中，因此使用该分子标志物诊断疾病的方法是无创的，避免了患者的痛苦。本发明的分子标志物不仅能诊断患者是否患有慢性肾病，而且还能判断患者的分期以及预后，因此集多种诊断功能为一身的本发明的分子标志物在临床上具有广泛的应用前景。附图说明图1显示CKD患者与正常人群的β2-MG水平差异；图2显示CKD患者与正常人群的肾小球滤过率估计值(eGFR)的差异；图3显示CKD患者与正常人群血清中可溶性Tim-3蛋白的水平差异；图4显示CKD患者血清中可溶性Tim-3蛋白水平与CKD分期的关系；图5显示CKD患者血清中可溶性Tim-3蛋白与eGFR的相关性分析；图6显示CKD患者血清中可溶性Tim-3蛋白与β2-MG的相关性分析。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。1、资料与方法研究对象：收集2015年2月至2016年1月CKD1期至CKD5期住院患者66例，其中男29例，女37例，年龄22～84岁，中位年龄58岁；原发病中，慢性肾炎38例，糖尿病肾病12例，高血压肾病10例，多囊肾3例，泌尿系感染1例，其他2例；根据改善全球肾脏病预后组织(KidneyDisease:ImprovingGlobalOutcomes,KDIGO)2013指南标准确诊。患者肾病史均超过一年，资料齐全；排除急性肾损伤、3个月内慢性肾脏病基础上肾功能损伤急性加重、使用激素和/或免疫抑制剂治疗的患者。健康人群作为对照20例，其中男10例，女10例，年龄20～63岁，中位年龄47岁，均来自我院体检中心，且排除CKD、肿瘤及感染等。方法：采集研究对象的基本情况，包括年龄、性别、以及患者的原发病、病史等信息。所有研究对象均于晨起抽取肘静脉全血，用ELISA法检测研究对象血清可溶性Tim-3蛋白的水平(试剂盒购于北京义翘神州生物技术有限公司)，仪器为美国Thermo公司酶标仪；用全自动生化分析仪(HITACH7600)检测血清尿素(Urea)、白蛋白(ALB)、肌酐(Cr)、β2-微球(β2-MG)的值，试剂购于利德曼公司。根据简化MDRD公式及Cockcroft公式计算肾小球滤过率估计值(estimatedglomerularfiltrationrate，eGFR)，取平均值作为eGFR的结果，因血清肌酐的数值为偏态分布资料，故取其对数值使其接近正态分布。统计学分析：使用GraphPadPrism6.0和SAPASS统计软件进行。结果用均数±标准差描述。两个独立样本计量资料比较符合正态分布和方差齐性采用t检验，否则采用非参数检验；多个样本间比较采用方差分析，进一步两两比较采用q检验。SAPSS线性相关分析用于分析血清中可溶性Tim-3蛋白水平与肾功能指标之间的相关性。P<0.05具有统计学差异(*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.0001，说明书中所有统计图的P值标识均如此例)。实施例1健康人群与CKD患者生化指标的比较1、方法：用全自动生化分析仪(HITACH7600)检测血清尿素(Urea)、白蛋白(ALB)、肌酐(Cr)、β2-微球(β2-MG)的值，试剂购于利德曼公司。2、结果：CKD患者Urea、ALB、Cr、β2-MG水平与健康人群相比差异显著，有统计学意义(P<0.0001)，见表1。其中，β2-MG的结果柱状图如图1所示。表1两组间生化指标的比较实施例2健康人群与CKD患者eGFR比较为了检测两组病例的肾功能情况，选取了肾小球滤过率估计值(eGFR)进行研究。单位时间内两肾生成的滤液量称为肾小球滤过率(GFR)。1、方法：MDRD简化方程及Cockcroft公式可用于成人GFR估算，公式如下：公式1：MDRD简化方程【GFR[ml/(min*1.73m2)]＝186×Cr(μmol/L)-1.154×年龄(岁)-0.203×0.742(女性)×1.233(中国)】公式2：Cockcroft公式【CCr[ml/(min*1.73m2)]＝(140-年龄)×体重(Kg)×72-1×Cr(μmol/L)-1×0.85(女性)】2、结果：健康人群与CKD患者之间eGFR有显著差异(****P<0.0001)(图2)。实施例3可溶性Tim-3蛋白在CKD患者血清中的表达情况1、方法为了分析可溶性Tim-3蛋白与肾功能不全的关系，用ELISA法检测研究对象血清中可溶性Tim-3蛋白的水平(试剂盒购于北京义翘神州生物技术有限公司)。2、结果结果如图3所示，CKD患者血清中可溶性Tim-3蛋白水平远远高于健康人群(****P<0.0001)。实施例4CKD患者血清中可溶性Tim-3蛋白水平与CKD分期的关系1、方法：根据eGFR的计算，按肾损伤程度将CKD组分为三组，分别为CKD1～2期组、CKD3～4期组、CKD5期分期标准见表2。表2CKD患者的分期标准2、结果结果如图4所示，CKD患者血清中可溶性Tim-3蛋白随肾功能不全的不断加重，水平总体呈现上升的趋势，并具有显著性差异(*P<0.05，***P<0.001)。实施例5CKD患者血清中可溶性Tim-3蛋白水平与肾功能指标相关性分析1、利用可溶性Tim-3蛋白水平和eGFR水平作线性相关分析，结果如图5所示，可溶性Tim-3蛋白水平与eGFR相关系数r＝-0.666，相关性显著。2、进一步对可溶性Tim-3蛋白、Urea、Cr、β2-MG、eGFR之间的相关性进行研究，发现可溶性Tim-3蛋白不仅与eGFR相关性显著，而且与β2-MG有着显著的相关性(r＝0.724，P<0.0001)(图6)。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。