DNA水凝胶在葡萄糖检测中的应用的制作方法

本发明属于医用诊断技术领域，涉及一种基于DNA水凝胶的葡萄糖检测方法，用于体外肉眼检测血清等生物样品中的葡萄糖。

背景技术：
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葡萄糖是自然界分布最广泛且最重要的一种多羟基醛类单糖，具有多元醇和醛的性质，易溶于水，在水溶液中旋光向右，所以又称为右旋糖。它是活细胞的能量来源和新陈代谢的中间产物，即生物体内主要的供能物质。

正常情况下人体中糖的分解和合成代谢处于动态平衡，保持相对恒定。血清葡萄糖是指血液中葡萄糖的浓度，正常参考值：成人为3.9～6.1mmol/L，足月新生儿为2.8～4.5mmol/L。葡萄糖的测定对于诊断和治疗高血糖症和低血糖症十分重要。

目前检测葡萄糖的方法主要有酶法和非酶法两大类。酶法主要包括葡萄糖氧化酶(GOD)法、葡萄糖己糖激酶(HK)法、葡萄糖脱氢酶(GDH)法。非酶法主要包括：近红外光谱法、脉冲电极法、氧化物电极法、光散射法等。由于灵敏度和选择性不够非酶法不能够直接用于人体血液中葡萄糖的测定，并且这些非酶法都需要借助相应的仪器设备实施，使用起来不便。现在市场上销售的血糖检测仪主要分为电化学法和光反射技术两大类，检测体系复杂、所需仪器昂贵不利于随身携带。相比较于非酶法，酶法利用了酶本身的高效性、专一性，在进行生物样本中检测葡萄糖时，不需要对样品进行预分离的处理，并且很容易将酶固定在试剂盒中便于随身携带。

技术实现要素：
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本发明所解决的技术问题是利用葡萄糖氧化酶(GOD)法通过一种DNAzyme交联型的DNA水凝胶对于微量葡萄糖的肉眼可见检测、对葡萄糖选择性检测、对血清中葡萄糖的检测。

本发明采用以下技术方案检测溶液中的葡萄糖：

(一)葡萄糖肉眼检测限的测定：

将不同浓度的葡萄糖置于100–300μL磷酸盐缓冲液(pH＝6.5–8.0)中，然后向其中分别加入1–20μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，将反应液置于恒温器中，在37℃有氧条件下反应10min。之后在室温下分别加入1–10mg的DNA水凝胶、2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，室温下反应20–90min后观察并记录胶块颜色变化。反应结束后将胶块取出置于60–1000μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH4.4)中，在75℃恒温保持3–30min后取出溶液，并检测652nm处的吸光度值。

(二)对葡萄糖选择性的检测

将相同浓度的葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖溶液置于100–300μL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中，然后向其中分别各加入1–20μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，将反应液置于恒温器中，在37℃有氧条件下反应10–60min。之后在室温下分别加入1–10mg的DNA水凝胶、2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，室温下反应20–90min后观察并记录胶块颜色变化。反应结束后将胶块取出置于60–1000μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)中，在75℃恒温保持3–30min后取出溶液，并检测652nm处的吸光度值。

(三)对血清中葡萄糖的检测

取10–500μL含葡萄糖样品液(包括血清样品和其他血液样品，及汗液，唾液等体液样品)，向其中加入1–20μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，将反应液置于恒温器中，在37℃有氧条件下反应10–60min。之后在室温下分别加入1–10mg的DNA水凝胶、2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，室温下反应20–90min后观察并记录胶块颜色变化。

所述的DNA水凝胶是以具有过氧化酶活性的DNAzyme作为交联剂，聚丙烯酰胺为骨架的新型DNA水凝胶。其结构由含有DNA的聚丙烯酰胺高分子，T-DNAzyme-T，及血红素通过分子间作用力(主要包括氢键,静电引力,疏水性相互作用等)结合形成。其中T-DNAzyme-T的两端或一端的序列可与DNA的序列互补杂交形成氢键。T-DNAzyme-T内部的序列为已报道的可结合血红素分子的具有过氧化酶活性的DNAzyme序列。T-DNAzyme-T与血红素以1:1或2:1或4：1的比例结合。DNA:T-DNAzyme-T可以是2:1或1:1。水凝胶中丙烯酰胺单体的质量百分比为3％～20％。m与n的比为2000:1至10:1。

所述DNA水凝胶的制备参考ZL 201310711003.1。

附图说明

图1为基于DNA水凝胶的葡萄糖的肉眼可见检测。

图2为DNA水凝胶对葡萄糖溶液的选择性。

图3为DNA水凝胶对血清中葡萄糖的检测。

具体实施方式：

实施例1：

DNAzyme交联型的DNA水凝胶的制备：

①DNAzyme的制备：量取2.75μL、5mM的T-4c15s-T置于200μL的离心管中，向其中加入1μL缓冲液B(50mM吗啉乙磺酸(MES)pH 6.5；100mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸盐缓冲液pH 6.5；40mM醋酸钾；1％DMSO；0.05％Triton X-100)，95℃恒温5min，之后缓慢降温60min至室温，将至室温后向其中加入2.3μL、1.5mM的Hemin溶液，25℃恒温30min。T-DNAzyme-T(序列2：5'-TTTTTTTTTTTTTTTTAGGTGGGGAGGAGCGGGGTGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3')。

②DNA杂合聚丙烯酰胺高分子溶液的制备：向离心管中依次加入1.6μL 50％的丙烯酰胺、6.9μL 4mM的Acrydite-DNA、1.2μL 2％的APS、1.2μL 2％的TEMED，立刻抽真空15min得粘稠状的高分子溶液。③将DNAzyme交联剂加入到丙酰胺高分子溶液中，得到DNAzyme交联型的DNA水凝胶。Acrydite-DNA(序列1：AAA AAA AAA AAA AAAA，DNA合成仪将3-氰乙基-二异丙基-6-甲基丙烯酰胺基亚磷酰胺(Acrydite)接入到DNA的5'端)。

实施例2

利用DNA水凝胶对葡萄糖肉眼检测限的测定步骤如下：

1)葡萄糖反应液的制备

葡萄糖反应液的制备：取6个编号分别为1、2、3、4、5、6的离心管，分别加入275μL、287μL、285μL、288.5μL、289.5μL、290μL的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，并分别依次加入15μL 10mM、3μL 10mM、5μL 1mM、1.5μL 1mM、0.5μL 1mM、0μL的葡萄糖溶液。最后向六个离心管中分别加入10μL、1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)。将上述6组葡萄糖反应液置于恒温器中，在37℃有氧条件下反应30min。

2)基于DNA水凝胶的葡萄糖肉眼可见检测：

取6块质量约为2mg的水凝胶，在缓冲液B中浸泡30min后，取出胶块分别放入6个离心管中，然后再分别加入190μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)、10μL 10mM的TMB溶液。最后将上述6组葡萄糖反应液分别加入上述的离心管中，静置1小时后，记录胶块变色情况(如图1a)。将反应完成后的胶块取出置于60μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)中，75℃、5min后取出溶液，并检测652nm处的吸光度值。(如图1b)

从图1中可以看出随着葡萄糖浓度的增加，胶块的颜色不断加深，最低的肉眼检测限可以达到10μM。

实施例3：

利用DNA水凝胶对葡萄糖选择性实验步骤如下:

1)不同糖的反应液的制备：取5个命名分别为空白组、果糖组、蔗糖组、麦芽糖组、葡糖糖组的离心管，并分别向其中加入290μL、275μL、275μL、275μL、275μL的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)，然后分别向果糖组、蔗糖组、麦芽糖组、葡糖糖组依次加入15μL 10mM果糖、15μL 10mM蔗糖、15μL 10mM麦芽糖、15μL 10mM葡糖糖。最后分别加入10μL、1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)。将上述各反应液置于恒温器中，在37℃有氧条件下反应30min。

2)用TMB和DNA水凝胶对300μM不同糖的检测

取6块质量约为2.5mg的水凝胶，浸泡30min，分别放入6个离心管中，然后再分别向6个离心管中加入190μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)、10μL 10mM的TMB溶液，30min后拍照观察。(如图2a)将反应完成后的胶块取出置于60μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)中，75℃、5min后取出溶液，并检测652nm处的紫外吸光度值(如图2b)。

从图2a、2b可以看出DNA水凝胶只对葡萄糖响应，对其他糖基本不响应，具有很高的选择性。

实施例4：

利用DNA水凝胶对胎牛血清中葡萄糖的检测

1)取300μL血清，加入10μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)，并将反应液将反应液置于恒温器中，在37℃有氧条件下反应30min，得到血清氧化液。取两个离心管分别编号1、2，向1中分别加入25μL的血清氧化液、24μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)、1μL、10mM的TMB，向2中分别加入35μL的血清氧化也液、14μL的缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)、1μL、10mM的TMB，反应30min后观察并记录胶块颜色变化(如图3)。

从(图3)测试结果中可以看出在检测液中，血清的含量为50％、75％时胶块变蓝，说明胶块在缓冲液A(0.1M柠檬酸，0.2M磷酸氢二钠，100mM氯化钾，pH 4.4)中能够检测血清中的葡萄糖。本方法能够检测20％–90％(v/v)的血清样品。