一种富马酸替诺福韦酯中杂质9‑丙烯基腺嘌呤的测定方法与流程

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种富马酸替诺福韦酯中杂质9-丙烯基腺嘌呤的测定方法。
背景技术：
：富马酸替诺福韦酯是新型核苷酸类逆转录酶抑制剂替诺福韦的前药，临床用于治疗艾滋病和慢性乙型肝炎。富马酸替诺福韦酯在合成和贮存过程中会引入多种杂质，其中9-丙烯基腺嘌呤是由起始原料带入，并在贮存过程中也会生成的杂质，具有严重的遗传毒性作用，who将其限度规定为不超过5ng·ml-1。9-丙烯基腺嘌呤的相对分子质量为175，结构式如下：目前已有文献用外标法对富马酸替诺福韦酯中9-丙烯基腺嘌呤的含量进行了定量分析和质量控制，但未见有用内标法的报道。鉴于9-丙烯基腺嘌呤的限度规定较严格，外标法的准确性又受进样重复性和试验条件稳定性的影响较大，因此有必要开发一种不受仪器操作影响、准确度高的内标法来对9-丙烯基腺嘌呤的含量进行质量控制。本发明开发的方法能对富马酸替诺福韦酯的生产和使用进行更好的质量控制，确保药品质量。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种富马酸替诺福韦酯中杂质9-丙烯基腺嘌呤的测定方法。本发明的富马酸替诺福韦酯中杂质9-丙烯基腺嘌呤的测定方法是采用超高效液相色谱法-电喷雾离子化串联质谱法即uplc-ms/ms法来检测富马酸替诺福韦酯中杂质9-丙烯基腺嘌呤浓度的，本方法采用内标法，盐酸左西替利嗪作为9-丙烯基腺嘌呤测定的内标；液相条件中流动相由甲醇水组成，梯度洗脱。本发明上述所述的富马酸替诺福韦酯中杂质9-丙烯基腺嘌呤的测定方法，其具体包括如下步骤：(1)含内标稀释液的配制：精密称取10mg盐酸左西替利嗪标准品，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，配成盐酸左西替利嗪浓度为0.1mg·ml-1的稀释液母液，取1ml稀释液母液，置另一100ml容量瓶中，甲醇定容混匀，即配成含内标浓度为1μg·ml-1的稀释液工作液。(2)9-丙烯基腺嘌呤采用超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的高通量测定方法：取上述待测液6μl进行lc-ms分析，其中液相条系统条件为流动相：a相为纯水，b相为甲醇，梯度洗脱；0-1min60％b，1-1.5min60％～90％b，1.5～2.2min90％～60％b，2.2-4.0min60％b；色谱柱为thermohypersilgold100*2.1；流速：0.1-0.5ml·min-1；柱温：20-40℃；样品盘温度：4-25℃；进样量：1-7.5μl。进一步优选为流速：0.2ml·min-1；柱温：35℃；样品盘温度：20℃；进样量：6μl；质谱系统条件为：离子源：h-esi；喷射电压：2500-5000v；鞘气：20-50arb；辅助气：5-25arb；尾吹气：0-2arb；离子传输毛细管温度：250-400℃；气化温度：40-300℃。进一步优选为喷射电压：3500v；鞘气：40arb；辅助气：10arb；尾吹气：0arb；离子传输毛细管温度：325℃；气化温度：150℃。(3)9-丙烯基腺嘌呤标准曲线的确定：精密称取9-丙烯基腺嘌呤标准品10mg，置10ml容量瓶中，用含内标稀释液工作液溶解并定容，配成1mg·ml-1浓度的标准品储备液。用含内标稀释液工作液进一步成比例稀释，配制系列浓度为10.0，5.00，2.00，1.00，0.500，0.200，0.100ng·ml-1的标准曲线溶液样品，对各浓度进行分析，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(w＝1/x2)最小二乘法进行回归分析，确定9-丙烯基腺嘌呤标准曲线及其定量限；所述的内标物为盐酸左西替利嗪。(4)富马酸替诺福韦酯样品中9-丙烯基腺嘌呤浓度的测定：精密称取10mg富马酸替诺福韦酯粉末，置10ml容量瓶中，用含内标稀释液溶解并定容。按照步骤(2)中的超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的高通量测定方法以及步骤(3)中所获得的9-丙烯基腺嘌呤标准曲线计算，确定不同批次样品中9-丙烯基腺嘌呤的浓度。本发明的主要目的为通过选择优化测定过程的测定条件及参数，提供一种快速、稳定、准确的内标测定法：通过多次重复试验发现本发明流动相中有甲酸存在时，化合物电离不稳定，因此液相系统不宜有酸存在，因此本发明液相条件中流动相采用甲醇水，梯度洗脱，保证了仪器电离的稳定性。此外，采用c18100mm柱进行分析，单个样品的分析时间仅为4.0min，大大增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量样品的快速分析。母离子/子离子离子对的选择是建立本发明中检测方法的关键。样品直接以恒定流速由微量注射泵流入质谱仪时，正离子模式一级全扫描可见明显的[m+h]+母离子峰，m/z为176.152，二级碎片离子峰度最大的m/z为135.986。改变电压和气化温度的大小可明显影响峰强度；通过优化，确定本方法最优的电离电压为3500v，气化温度为150℃。内标的选择对于检测的灵敏度和特异性至关重要，且内标法的选择在准确度和重复性上都优于外标法。理想的内标应为同位素标记物或结构类似物。在本试验室工作开展中发现，盐酸左西替利嗪的lc-ms/ms检出条件与9-丙烯基腺嘌呤类似，并且预试验发现两者在此条件下出峰时间相近、无相互干扰、峰形均好，因此本方法确定将盐酸左西替利嗪作为9-丙烯基腺嘌呤样品测定的内标。总之，本发明中的测定方法与以往的测定方法相比具有如下技术优势：1.消除了外标法因进样重复性和试验条件稳定性对准确性的影响；2.通过选择优化合适的内标物及测定过程的测定条件和参数使检测方法更加稳定可靠，提供了一种快速、准确的内标测量方法，保证了样品测定结果的准确性和临床用药安全。附图说明图1为空白样品色谱图。图2为9-丙烯基腺嘌呤浓度5ng·ml-1样品色谱图。图3为富马酸替诺福韦酯样品中的9-丙烯基腺嘌呤色谱图。注：通道i为9-丙烯基腺嘌呤色谱峰，通道ii为内标盐酸左西替利嗪色谱峰。具体实施方式为了使本领域技术人员更清楚地了解本发明，申请人对本发明所述富马酸替诺福韦酯中杂质9-丙烯基腺嘌呤的测定方法进一步描述如下，但本领域技术人员应能知晓，所述的进一步阐述和举例并不以任何方式限定本发明的专利保护范围。实施例1本发明检测方法的方法学考察一、标准溶液的配制(1)含内标稀释液的配制：精密称取10mg盐酸左西替利嗪标准品，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，配成盐酸左西替利嗪浓度为0.1mg·ml-1的稀释液母液，取1ml稀释液母液，置另一100ml容量瓶中，甲醇定容混匀，即配成含内标的稀释液工作液。(2)标准系列溶液的配制精密称定9-丙烯基腺嘌呤对照品适量，置于10ml量瓶中，用含内标稀释液溶解并定容至刻度，获得浓度为1.0mg·ml-1的标准储备液。精密量取适量标准储备液，用内标稀释液梯度稀释，配制浓度分别为10.00，5.00，2.00，1.00，0.500，0.200，0.100ng·ml-1的标准系列溶液。(3)标准质控溶液的配制精密称定9-丙烯基腺嘌呤对照品适量，置于10ml量瓶中，用含内标稀释液溶解并定容至刻度，获得浓度为1.0mg·ml-1的标准质控储备液。精密量取适量标准质控储备液，用含内标稀释液梯度稀释，配制浓度分别为5.00，1.00，0.200ng·ml-1的标准质控工作液。(4)样品溶液的配制精密称取10mg富马酸替诺福韦酯粉末，置10ml容量瓶中，用含内标稀释液溶解并定容。即配成富马酸替诺福韦酯浓度为1.0mg·ml-1的样品溶液。各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。二、分析方法的确证1.方法的专属性在所选的条件下，进样空白溶剂，没有明显峰形出现(图1)，将5ng·ml-1浓度的9-丙烯基腺嘌呤溶液进样，得加样色谱图(图2)，取样品溶液，同法进样，得色谱图(图3)。其中9-丙烯基腺嘌呤的保留时间为1.53min，内标盐酸左西替利嗪的保留时间为2.98min；结果表明，空白溶剂和样品溶液中的组分不干扰测定。2.标准曲线和线性范围配制浓度分别为10.0，5.00，2.00，1.00，0.500，0.200，0.100ng·ml-1的标准系列溶液，分别进样测定，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(w＝1/x2)最小二乘法进行回归分析。典型标准曲线为y＝0.000122317+0.000417025*x,r＝0.9997；9-丙烯基腺嘌呤在0.100～10.0ng·ml-1浓度范围内线性关系良好。3.定量限将0.100ng·ml-1的标准溶液用含内标稀释液稀释，进样6μl进行uplc-ms/ms分析。当稀释到0.0100ng·ml-1浓度时，色谱图信噪比s/n为10.5。所以该方法的定量限为0.0100ng·ml-1。4.检测限将0.0100ng·ml-1浓度的标准溶液用含内标稀释液稀释，进样6μl进行uplc–ms/ms分析。当稀释后浓度为0.00500ng·ml-1时，色谱图信噪比s/n为3.2。所以该方法的检测限为0.00500ng·ml-1。5.精密度和准确度按照“标准质控溶液的配制”项下方法，配制低(0.200ng·ml-1)、中(1.00ng·ml-1)、高(5.00ng·ml-1)三个浓度的质量控制(qc)样品，进样测定。每一浓度进行6样本分析，连续测定3天，随行测定标准曲线。根据当日标准曲线计算qc样品的浓度，结果进行方差分析，求得方法的精密度rsd和准确度re。结果9-丙烯基腺嘌呤的日间rsd≤5.7％，日内rsd≤3.2％，re在-4.0％～2.0％之间；内标溶液的日间rsd≤5.0％，日内rsd≤2.7％，6.重复性试验取适量样品(批号：25002-1)，按照“样品溶液的配制”项下方法平行制备5份供试品溶液，每份进样6μl进行uplc-ms/ms分析，记录色谱图，用内标法根据比值计算9-丙烯基腺嘌呤的平均含量为1.05ng·ml-1，rsd为1.8％。表明本方法重复性良好。7.加样回收率按照“样品溶液的配制”项下方法，配制9个同一批号(批号：25002-1)的样品溶液，每个样品溶液取50μl，分成三份。分别加入等体积低(0.200ng·ml-1)、中(1.00ng·ml-1)、高(5.00ng·ml-1)三个浓度的质量控制(qc)溶液，进行uplc-ms/ms分析，计算qc样品的回收率。结果低浓度加样回收率为95.4％，rsd为8.6％，re为-4.6％；中浓度回收率为98.5％，rsd为3.6％，re为-1.5％；高浓度回收率为97.9％，rsd为4.0％，re为-2.1％。8.样品稳定性本专利考察了样品室温放置0h、6h、10h的稳定性，取供试品溶液9份，室温放置0h、6h、10h后，经0.22μm滤膜过滤，每个时间点三样本进行uplc-ms/ms分析，计算相对误差(re％)。结果室温放置6h、12h后均稳定，平均re为-2.3％，rsd为3.0％。9.耐用性为考察测定条件的微小变化对测定结果的影响，本专利考察了在该方法下，换不同批号的色谱柱，不同时间生产的纯化水对结果的影响。结果该方法的测定结果不受色谱柱批号，纯化水生产时间的影响。表明该方法耐用性良好。总结，本方法所建立的uplc-ms/ms法测定富马酸替诺福韦酯中杂质9-丙烯基腺嘌呤的方法准确可靠，其在专属性、精密度、加样回收率、稳定性等方面均符合2015版药典要求。适合进行富马酸替诺福韦酯样品中杂质9-丙烯基腺嘌呤的含量检测。实施例2富马酸替诺福韦酯样品中杂质9-丙烯基腺嘌呤的测定测定富马酸替诺福韦酯样品中杂质9-丙烯基腺嘌呤的方法采用超高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms)的高通量测定方法。分别取三批近期生产的富马酸替诺福韦酯样品和四批留样1年以上的富马酸替诺福韦酯样品，按照“样品溶液的配制”项下方法制备供试品溶液，采用内标法进样分析。具体为：1.实验药品及仪器1.1标准品与试剂9-丙烯基腺嘌呤对照品：山东新时代药业有限公司生产，批号：150904，含量95％，盐酸左西替利嗪对照品：内标，中国药品生物制品检定所，批号：100659-201102，含量98.8％，富马酸替诺福韦酯样品：山东新时代药业有限公司生产，批号分别为：26038-1、26038-2、26038-3；留样一年以上的批号分别为：25002-1、25002-2、25002-3、25002-4。甲醇：hplc级，merk；纯化水：山东新时代药业有限公司生产。1.2仪器分析天平：bt125d，sartorius,germany；uplc-ms/ms仪器组成：watersacquityuplc/thermotsqendurams串联三重四级杆质谱仪；工作站：xcalibur；色谱柱：thermoc18(100mm×2.1mm,5μm)；2.实验方法和结果2.1lc-ms/ms分析条件2.1.1色谱条件：流动相：a相为纯水，b相为甲醇，梯度洗脱；0-1min60％b，1-1.5min60％～90％b，1.5～2.2min90％～60％b，2.2-4.0min60％b；流速：200μl·min-1；柱温：35℃；样品盘温度：20℃；进样体积：6μl。2.1.2质谱条件：9-丙烯基腺嘌呤和盐酸左西替利嗪的离子化采用电喷雾离子源，正离子模式。在srm扫描模式下，9-丙烯基腺嘌呤和盐酸左西替利嗪产生了质子化的母离子[m+h]+。所用的离子对和碰撞反应条件如表1：表1离子对和碰撞反应条件化合物名称母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞能(v)rflens(v)9-丙烯基腺嘌呤176.152135.98621160盐酸左西替利嗪389.039201.05418158离子源：h-esi；喷射电压：3500v；鞘气：40arb；辅助气：10arb；尾吹气：0arb；离子传输毛细管温度：325℃；气化温度：150℃。2.2实验结果：3批新的富马酸替诺福韦酯样品中9-丙烯基腺嘌呤的含量分别为0.521、0.643、0.499ng·ml-1；留样一年后的富马酸替诺福韦酯样品中9-丙烯基腺嘌呤的含量分别为1.02、1.5、0.895、1.32ng·ml-1。均达到2015年who对富马酸替诺福韦酯的质量控制标准(5ng·ml-1)。具体数据见表2：表2富马酸替诺福韦酯样品中9-丙烯基腺嘌呤的含量测定结果由于样品溶液中主成分的浓度较高，为了防止污染质谱，本专利采用柱后切换阀，限定1.9～2.5min切换到废液，0～1.9min和2.5～4min进入离子源。其中0～1.9min为内标盐酸左西替利嗪的出峰时间，2.5～4min为9-丙烯基腺嘌呤的出峰时间。研究结果显示，各批次生产的富马酸替诺福韦酯样品中均含有9-丙烯基腺嘌呤。随着放置时间的延长，外界温度、湿度、光照等因素都可能影响9-丙烯基腺嘌呤的含量变化。本发明采用的方法能快速、准确的测定富马酸替诺福韦酯样品9-丙烯基腺嘌呤的含量，适合进行该样品的质量控制。当前第1页12