本发明涉及虎金颗粒剂提取工艺的研究方法，具体地说是以虎金颗粒剂提取工艺的研究方法。
背景技术：
目前公知的虎金颗粒由虎杖、郁金等组成，经多年的临床疗效观察及动物实验研究证明，本方具有良好的抗脂肪肝及抗肝纤维化作用。
技术实现要素：
研究对象：仪器、药材与试剂；仪器，德国sartorius电子天平；德国dionexp680a高效液相色谱仪(hplc)；德国dionexasi-１００自动进样器；德国dionexpda-100二极管阵列检测器；美国agilente8453紫外可见分光光度计；艾科浦arus-4-35g-2型台式超纯化水机。药材与试剂；药材购于致信药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定；大黄素(emodin)(批号：0756-200211)、1，8二羟基蒽醌(批号：0829-9702)、无水葡萄糖(批号：0833-9501)均购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，水为超纯水；其余试剂为分析纯。实验方法与结果：醇提工艺考察方法，以大黄素及总蒽醌含量为指标，按ｌ9（34）正交表进行实验，总大黄素含量测定方法，色谱条件，色谱柱：chromasilc18,5μm,46mm×250mm；流动相：甲醇-0.16mol/l磷酸溶液(85：15）；柱温：25℃；流速：10ml/min。标准曲线制备，0.204g/l的大黄素对照品溶液按1、4、8、12、16μl注入高效液相仪中，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标，求得回归方程为y=52954x-01452，r=10，大黄素在0.204～3.26μg范围内与峰面积呈线性相关。样品制备及测定；定容至250ml，吸取25ml置于蒸发皿中，水浴蒸干；残渣用25mol/l硫酸25ml溶解后，按文献方法处理，定容至50ml；吸取10ml氯仿液于蒸发皿中挥干溶剂，用甲醇定容至10ml，过滤后作为供试液；按8～15μl注入高效液相仪中，按外标二点法求得总大黄素含量。总蒽醌含量(ta)测定；最大吸收波长的确定，取适量标准品溶液、样品溶液及缺虎杖的阴性样品溶液，于400～800nm范围扫描，标准品溶液、样品溶液均在520nm处有最大吸收，阴性样品溶液在该处吸收度极低，无其他成分的干扰，故选定520nm为最大吸收波长。标准曲线的制备；0.108g/l的1，8二羟基蒽醌对照品溶液，按文献方法处理，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，求得回归方程为y=4483x-0.03000,r=0.9995。对照品在4320～2160g/l范围内与吸光度呈线性相关。样品制备及测定方法；定容至50ml，吸取5ml氯仿液于分液漏斗中，按文献方法处理，定容至50ml作为供试液，于520nm处测其吸光度。正交试验结果；经直观分析和方差分析可知，对该工艺影响的因素由大至小依次是ａ＞ｃ＞ｄ＞ｂ，ａ、ｃ差异有显著性(ｐ＜0.05），b、d差异无显著性。结合生产实际情况，选定最佳提取工艺是ａ３ｂ２ｃ３ｄ２，即用245ml体积分数为70%的乙醇，提取2h，提2次。验证实验；按最佳工艺，用250倍处方量药材进行3次验证，大黄素含量分别是7987mg、8356mg、7868mg，rsd为316%；总蒽醌含量分别是10295mg、98084mg、9542mg，rsd为387%，含量均高于正交9次实验，且相对误差均小于5%，该条件下指标成分含量较稳定，因此该工艺是合理可行的。灵芝提取工艺的考察，以总多糖含量为指标按ｌ9（34）正交表进行实验，总多糖(tp)含量测定方法；最大吸收波长的确定，取适量显色后的对照品溶液、样品溶液，于400-800nm范围扫描，两者均在490nm处有最大吸收，故选定最大吸收波长为490nm。标准曲线制备，0.492g/l的葡萄糖对照品溶液按文献，方法显色，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，求得回归方程为y=70056x-0.1405，r=0.9996，葡萄糖在0.01968～0.1181g/l范围内与吸光度呈线性相关。样品的制备及测定；提取水煎液，定容至250ml；吸取10ml于蒸发皿中水浴蒸干，用2ml蒸馏水溶解，加入18ml无水乙醇，使含醇量达90%，以3000r/min离心5min，弃上清液，沉淀后用蒸馏水溶解定容至25ml，吸取1ml样品液，按文献方法处理后，检测其吸光度，求出总多糖含量。总多糖(tp)含量测定结果；结果分析，经直观分析和方差分析可知：因素c、d差异有显著性(p＜0.05)，因素a、b差异无显著性。结合生产实际情况，选定最佳提取条件为ａ１ｂ１ｃ３ｄ３，即不用浸泡，用80ml水煎煮15h，煮3次。验证试验，按最佳工艺，用250倍处方量药材进行3次验证，总多糖含量分别是31015mg、32440mg、30379mg，rsd为337%，含量均高于正交9次实验，且相对误差值小于5%，该条件提取的灵芝多糖含量较稳定，因此，该提取工艺是合理可行的。
发明目的：虎金颗粒由虎杖、郁金等组成，经多年的临床疗效观察及动物实验研究证明，本方具有良好的抗脂肪肝及抗肝纤维化作用。通过正交试验设计，对其提取工艺进行了实验研究，确定影响提取工艺的显著性因素。研究表明，虎杖中的蒽醌类、郁金中的姜黄素等有效成分在乙醇中有较高溶解度，故这几味药材均采用乙醇提取；灵芝多糖具水溶性，故灵芝单独水提。
技术方案：以大黄素及总蒽醌含量为指标，按ｌ9（34）正交表进行实验，色谱柱：chromasilc18,5μm,46mm×250mm；甲醇-0.16mol/l磷酸溶液(85：15）；柱温：25℃；流速：10ml/min。标准曲线制备，0.204g/l的大黄素对照品溶液按1、4、8、12、16μl注入高效液相仪中，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标，求得回归方程为y=52954x-01452，r=10，大黄素在0.204～3.26μg范围内与峰面积呈线性相关。样品定容至250ml，吸取25ml置于蒸发皿中，水浴蒸干残渣用25mol/l硫酸25ml溶解后，定容至50ml；吸取10ml氯仿液于蒸发皿中挥干溶剂，用甲醇定容至10ml，过滤后作为供试液；按8～15μl注入高效液相仪中，按外标二点法求得总大黄素含量。取适量标准品溶液、样品溶液及缺虎杖的阴性样品溶液，于400～800nm范围扫描，标准品溶液、样品溶液均在520nm处有最大吸收，阴性样品溶液在该处吸收度极低，选定520nm为最大吸收波长。标准曲线的制备；0.108g/l的1，8二羟基蒽醌对照品溶液，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，求得回归方程为y=4483x-0.03000,r=0.9995。对照品在4320～2160g/l范围内与吸光度呈线性相关。样品制备及测定方法；定容至50ml，吸取5ml氯仿液于分液漏斗中，定容至50ml作为供试液，于520nm处测其吸光度。正交试验结果；经直观分析和方差分析可知，对该工艺影响的因素由大至小依次是ａ＞ｃ＞ｄ＞ｂ，ａ、ｃ差异有显著性(ｐ＜0.05），b、d差异无显著性。结合生产实际情况，选定最佳提取工艺是ａ３ｂ２ｃ３ｄ２，即用245ml体积分数为70%的乙醇，提取2h，提2次。
发明有益效果：醇提最佳工艺为：245ml体积分数为70%乙醇提取2h，共2次；水提最佳工艺为：80ml水，不用浸泡，提取15h，共3次。
最佳实施方式：运用检测分析法。
创新之处：本项新型发明专利涉及虎金颗粒剂提取工艺的研究方法，大黄素除了有保肝利胆退黄的作用外，还有抗肝纤维化的作用其化学性质稳定，有比较成熟的含量测定方法，本实验采用hplc法测定其含量，较之薄层扫描法、毛细管电泳法结果更为准确、可靠。虎杖中既有游离型又有结合型大黄素，在生物体内，结合型苷类会被水解成苷元，因此，以水解后总大黄素含量作为评价工艺的指标比单用游离型或结合型更为合理。虎杖的主要活性化学成分除了大黄素外，还有大黄酚、大黄酸等其他蒽醌类成分，这些成分均有抗菌、抗炎、保肝等生理活性，在520nm处无其他成分的干扰，运用分光光度法测定总蒽醌含量，简便而准确，因此选择蒽醌为另一检测指标是合理可行的。单一成分作为质控指标存在局限性，以多指标评价和控制提取工艺的质量，更为全面、科学。