保健品中维生素与天然抗氧化剂的超高效液相色谱‑四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法与流程

本发明属于食品安全检测技术领域，特别涉及一种保健品中维生素与天然抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法。

背景技术：

在美国绿茶被用作膳食补充剂，由于其含有丰富的生物活性物质，包括咖啡因、氨基酸、维生素等，从而达到促进人体健康的效果。绿茶提取物，如维生素与天然抗氧化剂等，经常被用于预防和治疗营养不良、消瘦，以及降低胆固醇水平，也可保护皮肤免受阳光的伤害。绿茶提取物通常以片剂或胶囊的形式作为营养保健品来出售。目前，营养保健品已成为日常饮食的一部分，以弥补因生活方式导致的营养不良，降低疾病的发病率，从而提高人类的预期寿命。然而，只有合理的食用绿茶提取物保健品才会起到促进人体健康的作用，过多食用则会对人体造成一定的伤害。因此，监管部门要求对保健品中维生素与天然抗氧化剂进行定量分析，来精确标注保健食品中维生素与天然抗氧化剂的含量。

目前用于保健品中外源性风险物质的高通量、快速检测方法较少，前处理操作复杂，材料与设备成本高，且仅限于几种或一类化合物的快速检测。维生素与天然抗氧化剂具有不同的结构和化学性质，同时检测分析这两种物质比较困难。因此，开发保健品中外源性风险物质的高通量、快速筛查分析方法已成发展趋势。

技术实现要素：

本发明针对上述现状，提供了一种保健品中维生素与天然抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，该方法的主要优势为分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高等，可应用于复杂基质的分析。

本发明是通过下述的技术方案来实现的：

一种保健品中维生素与天然抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，包括以下步骤：

1)利用QuEChERS方法对保健品的被测物样品进行提取和净化，得到被测物样品的测试溶液；

2)运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪对被测物样品进行筛查，采用电喷雾离子源和Full MS/dd-MS²，Full MS/vDIA，Full MS/AIF三种扫描模式，得到被测物样品完整的一级与二级质谱图；

3)通过软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出被测物样品中维生素与天然抗氧化剂化合物信息；

4)将维生素与天然抗氧化剂标准谱库中的化合物信息与被测物样品的维生素与天然抗氧化剂化合物信息进行比对，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定结构与定量食品中维生素与天然抗氧化剂的组成。

作为本发明的进一步改进，所述的保健品为绿茶提取物保健品。

作为本发明的进一步改进，步骤1)具体为：称取绿茶提取物片剂或胶囊于离心管中，加入45℃±5℃的水，涡旋充分混匀使试样完全分散，放入流动水中冷却；再加入体积分数1％的乙酸-乙腈/水混合溶液，涡旋混合；加入无水硫酸镁、陶瓷均质石、无水乙酸钠，涡旋、振荡提取；最后将离心管离心后，取滤液于进样小瓶中，加入甲酸铵水溶液及甲醇。

作为本发明的进一步改进，步骤2)具体为：通过超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱的全扫描模式获得一级质谱图，提取离子流图进行定量，通过可变的数据非依赖采集vDIA模式扫描得到二级质谱图。

作为本发明的进一步改进，步骤3)具体为：通过分析二级质谱图得到的碎裂片段数据，初步判断该物质归属类别，继而对该保留时间色谱峰的其他片段信息进行分析，包括质荷比、片段丰度比与同位素丰度比，从而推断出该物质结构和元素组成。

作为本发明的进一步改进，步骤4)中的维生素与天然抗氧化剂标准谱库是按照以下步骤建立的：

1)分别配制维生素与天然抗氧化剂标准品的标准溶液；

2)运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪对维生素与天然抗氧化剂标准品的标准溶液进行筛查，采用电喷雾离子源和Full MS/dd-MS²，Full MS/vDIA，Full MS/AIF扫描模式，得到标准溶液完整的一级与二级质谱图；

3)通过软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出标准溶液的信息，建立标准谱库。

作为本发明的进一步改进，超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪的色谱条件为：

色谱柱：Accucore C-18aQ预柱，10mm×2.1mm，1.9μm，Hypersil Gold aQ C-18柱，100mm×2.1mm，1.9μm；柱温：35-40℃；流动相：A为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵甲醇溶液；

梯度洗脱程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A，13-15min，100％A；流速为300μL/min；进样量5-10μL；碰撞气：高纯氩气；

电喷雾离子化离子源：单一正模式或负模式；鞘气流速：18-19L/min；鞘气压力：275Kpa；辅助气流速：3-4L/min；毛细管电压：负离子模式3000V，正离子模式3500V；离子源温度：230-250℃；毛细管温度：320-330℃。

作为本发明的进一步改进，超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪的质谱条件为：

采用Full MS/vDIA扫描模式：一级质谱扫描分辨率为70000FWHM；自动增益控制目标值设定为一百万；最大注入时间250ms；容许的质量误差范围为5ppm；动态背景扣除10.0s；

二级质谱扫描参数：扫描时间：0-15min；分辨率：17500FWHM；自动增益控制的目标值定为五十万；最大注入时间120ms；112.80116-487.97169为第一个vDIA，隔离窗口范围设为25.0Da，Loop Count16；550.50011-850.63654为第二个vDIA，动态背景扣除10.0s，隔离窗口范围设为100.0Da，Loop Count16；碰撞能量分别为17.5eV；35.0eV；52.5eV。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

本发明先通过QuEChERS方法对绿茶提取物保健品样品进行提取和净化，然后采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱法检测绿茶提取物保健品中维生素与天然抗氧化剂，最后通过标准谱库进行比对，最终判定化合物结构与定量绿茶提取物保健品中维生素与天然抗氧化剂的组成。本发明的筛选方法，可以一次性定量、定性检测多种物质(52种维生素与天然抗氧化剂)，并且具有操作简单，精度高、分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高等优势，可应用于复杂基质的分析。尤其是，Q-Orbitrap(超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪)的分辨率高，在确保痕量化合物灵敏度下，分辨率可达7万；质量精度高，可以使用外标法，无需内标，长时间的质量精度不下降；灵敏度高，检测离子回旋共振的频率，并不需要额外的检测器；动态范围宽，达五个数量级；具有快速正负切换扫描模式，极大节省分析时间，提高分析通量；稳定性高，只需一周校正一次；定量能力高，可以和三重四极杆相比较；质量范围广，可进行多肽分析；另外，Q-Orbitrap仪器操作简便，运行成本低，可应用于复杂基质的分析。结果表明：52种维生素与天然抗氧化剂在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，高(4×CCβ)、中(2×CCβ)、低(1×CCβ)三个添加水平下，基质的加标回收率达到85％-113％，重复实验6次，其相对标准偏差为0.3％-6.4％。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.05μg/kg-1.91μg/kg与0.08μg/kg-3.18μg/kg。

利用优化后的QuEChERS方法对绿茶提取物保健品样品进行提取和净化，简单快捷，效率高，可以有效的排除其中杂质对后续检测的干扰。

【附图说明】

图1为本发明的pH与萃取溶液体积对回收率影响响应面图；

图2为同分异构体熊果酸(Ursolic acid)与齐墩果酸(Oleanic acid)全扫描与二级碎裂片段比对图(加标浓度50mg kg^-1)。

【具体实施方式】

本发明提供了一种绿茶提取物保健品中维生素与天然抗氧化剂的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱筛查方法，该方法所用到的设备包括超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱仪。包括以下步骤：

首先，利用已优化的QuEChERS方法对样品进行提取和净化；

其次，运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱(Q-Orbitrap)进行筛查，采用电喷雾离子源(ESI)和全扫描/数据依赖采集(Full MS/dd-MS²)，全扫描/可变的数据非依赖采集(Full MS/vDIA)，全扫描/全离子碎裂采集(Full MS/AIF)三种扫描模式，得到完整的一级与二级质谱图。

再次，运用Exact Finder 2.5软件对获得的一级与二级质谱图进行处理，提取出化合物信息。

最后，将已建立维生素与天然抗氧化剂谱库中的信息与被测物的信息进行比对，包括提取流色谱的保留时间，分子离子峰与其碎裂离子峰丰度比，分子离子峰与碎裂离子峰的精确质量数，分子离子峰与同位素离子峰丰度比，确证绿茶提取物保健品中维生素与天然抗氧化剂的组成。

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细阐述，但本发明不限于该实施例。为了使公众对本发明有彻底的了解，在以下本发明优选实施例中详细说明具体的细节。

1.色谱质谱分析条件

主要仪器：美国Thermo Fisher Scientific公司的超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱，配有电喷雾离子源。

(1)色谱条件

色谱柱：Accucore C-18aQ预柱(10mm×2.1mm，1.9μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)，Hypersil Gold aQ C-18柱(100mm×2.1mm，1.9μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)；柱温：35-40℃；流动相：A为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸与4mmol/L甲酸铵甲醇溶液。梯度洗脱程序：0min，100％A；1min，100％A；7min，0％A；12min，0％A；13min，100％A；13-15min，100％A；流速为300μL/min；进样量5-10μL；碰撞气：高纯氩气(纯度≥99.999％)。电喷雾离子化(ESI)离子源：单一正模式或负模式；鞘气流速：18-19L/min；鞘气压力：275Kpa；辅助气流速：3-4L/min；毛细管电压：负离子模式3000V，正离子模式3500V；离子源温度：230-250℃；毛细管温度：320-330℃。

(2)质谱条件

采用Full MS/vDIA扫描模式。一级质谱扫描分辨率为70000FWHM；自动增益控制目标值设定为一百万；最大注入时间250ms；容许的质量误差范围为5ppm；动态背景扣除10.0s。

二级质谱扫描参数：扫描时间：0-15min；分辨率：17500FWHM；自动增益控制的目标值定为五十万；最大注入时间120ms；112.80116-487.97169为第一个vDIA，隔离窗口范围设为25.0Da，Loop Count16；550.50011-850.63654为第二个vDIA，动态背景扣除10.0s，隔离窗口范围设为100.0Da，Loop Count16。碰撞能量分别为17.5eV；35.0eV；52.5eV。

表1列出了52种标准数据库部分内容。

表1 52种维生素与天然抗氧化剂的超高效液相色谱/四级杆-轨道离子阱质谱参数

2.溶液配制

(1)标准溶液的配制

分别称取适量的维生素与天然抗氧化剂标准品10mg(精确至0.1mg)，置于10mL于容量瓶内，依据标准物质在不同溶剂(甲醇、乙腈和甲苯)中溶解度与测定需要，选用合适的溶剂溶解，定容至10mL，配制成单一化合物标准储备液，于-20℃避光保存。移取单一化合物标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(1:1，v/v)稀释并定容至刻度，配制相应浓度的标准物质混合工作溶液。混标工作液于棕色密闭瓶-20℃避光保存。

(2)基质匹配溶液的配制

移取12份各5mL绿茶提取物保健品空白样品(实验前测定)提取液于10mL容量瓶中，运用真空氮气吹干仪吹至近干，分别加入1000μg/L的维生素与天然抗氧化剂标准品混合溶液10μL、20μL、40μL、80μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1000μL、2000μL、4000μL、5000μL于容量瓶中，各加入甲醇5mL，用8mmol/L甲酸铵水溶液稀释并定容至刻度，配制成1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L相应的基质匹配标准溶液。基质匹配标准溶液应现用现配。

3.样品的前处理

称取绿茶提取物片剂或胶囊1.0g(精确到0.01g)于10mL具塞聚苯丙烯离心管中，加入5mL 45℃±5℃的水，涡旋充分混匀使试样完全分散，放入流动水中冷却。加入10mL 1％(v/v)乙酸-乙腈/水(84:16，v/v)混合溶液，涡旋混合60s。加入1.0g无水硫酸镁、陶瓷均质石、0.3g无水乙酸钠，涡旋30s，振荡提取1min。将离心管置于离心机，温度设定为4℃，以2264r/min离心5min，取200μL滤液于2mL进样小瓶中，加入500μL 8mmol/L甲酸铵水溶液及300μL甲醇。运用超高效液相色谱-四级杆-轨道离子阱质谱进行测定。

共有136种不同的绿茶保健食品被分析检测，这些产品从不同的零售商业点获得，并按照上述方法进行分析。

4.分析结果

(1)方法的建立

运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱进行样品筛查，采用电喷雾离子源和Full MS/dd-MS²，Full MS/vDIA，Full MS/AIF扫描模式，通过超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱的全扫描模式获得一级质谱图，提取离子流图进行定量，通过可变的数据非依赖采集vDIA模式扫描得到二级质谱图。二级扫描在全扫描的基础上得到了更具针对性的碎裂片段数据，即可初步判断该物质归属类别，继而对该保留时间色谱峰的其他片段信息进行分析，包括质荷比、片段丰度比与同位素丰度比，从而推断出该物质和元素组成。将该物质推断的片段断裂途径与已建立的维生素与天然抗氧化剂标准信息谱库中归属类的其他化合物断裂途径比对，判断该化合物的分子式与结构式，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定与定量绿茶提取物保健品中维生素与天然抗氧化剂的组成。

(2)方法学验证

a方法的标准曲线、线性范围及相关系数

配制52种维生素与天然抗氧化剂系列混合标准物质溶液，浓度为0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、4μg/kg、8μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、500μg/kg。结果表明，检测方法中52种维生素与天然抗氧化剂在其相应的浓度范围内，相关系数(r²)均大于0.99，呈良好的线性关系。

b方法的定量下限、加标回收率与精密度

本发明对已建立的方法运用欧盟标准2002/657/EC与SANCO/12571/2013进行方法学参数考察：CCα的测定采用校准曲线法，CCα等于能观察到响应时纵坐标轴上的浓度值加对应的重现性标准偏差的2.33倍。CCβ为CCα的值加CCα取值时重现性标准偏差的1.64倍。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.05μg/kg-1.91μg/kg与0.08μg/kg-3.18μg/kg。

精密度通过统计6次平行实验回收率结果的相对标准偏差得到，将待测物提取净化后，运用四级杆-轨道离子阱质谱检测，计算52种维生素与天然抗氧化剂的平均回收率及相对标准偏差。回收率及相对标准偏差结果分别为85％-113％和0.3％-6.4％，所建立的方法准确性和精密度良好。下述表2列出了绿茶提取物保健品中维生素与天然抗氧化剂的方法学参数。

表2 绿茶提取物保健品中维生素与天然抗氧化剂的线性范围、确定限、检测容量、相关系数、平均回收率及精密度(n＝6)

(3)结果

本发明对检测方法进行了优化和验证，实验对象为136种取自不同市场的绿茶提取物保健品。本发明对52种维生素与天然抗氧化剂进行了筛查分析，结果表明，维生素，抗坏血酸大量存在，而其他的维生素，如维生素A和维A酸没有被检测出；在天然抗氧化剂中，(-)-表没食子儿茶素儿茶、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素的含量高于咖啡酸和绿原酸；保健品产品含有成分的数量和标签上标明的相似(硫胺素低于申报的标签上标明的数量；样品中的维生素B均比提供的标签值高)；且所有被分析样品中均含有咖啡酸。

本发明的筛查方法还可以应用于其他保健品中维生素与天然抗氧化剂的筛查。

图1交互作用图直观的反映了QuEChERS前处理各因素对响应值(回收率)的影响效果，前处理条件的最佳参数为：加入10mL 1％(v/v)乙酸-乙腈/水(84:16，v/v)混合溶液，乙酸钠使用量为0.30g，由回归方程预测化合物回收率的理论值可达99.33％。采用上述优化出的前处理条件进行6次实验，测得回收率平均值为99.28％，偏差较小，表明采用响应面分析法优化得到的QuEChERS前处理条件参数准确可靠。图2可以看出，齐墩果酸(Oleanic acid)与熊果酸(Ursolic acid)保留时间分别为8.37min与8.39min，分子离子质荷比均为457.36762。碎裂片段相同，但丰度比不同，可以通过质荷比为203.17937与297.25735两个碎裂片段的响应强度相对与丰度比进行区别与确证。

本发明在实验中采用一针进样方式完成筛查过程中的筛选、确证、定量以满足高通量、快速分析的监控要求。筛选过程中，峰面积阈值设定为可变的数据非依赖采集扫描模式对分子离子峰碎裂阈值的响应强度8.3×10⁴，信噪比设定为国家标准中保健品中相关外源性物质质谱法测定的定量限规定值10，勾选已建立的保健品中维生素与天然抗氧化剂标准数据库，保留时间提取窗口设定为保留时间±3倍保留时间漂移标准偏差。提取色谱峰质荷比允许最大质量偏差设定为3ppm。当运用设定的保留时间与质荷比质量偏差提取窗口提取到响应强度大于等于8.3×10⁴色谱峰时，样品初步判断为阳性样品，进行下一步确证工作，若在上述条件下没有提取到色谱峰，初步判断样品为阴性。将初步判断为阴性的样品进行特征断裂片段的提取与分析，对未知目标物质进行筛查分析，进而得出结论。确证工作主要通过同位素离子峰信息与二级碎裂片段丰度比两个方面进行，并解决了同分异构体色谱共流出的确证难点，将具有M+1特征的¹³C，与具有M+2特征的³⁴S、⁸¹Br、³⁷Cl的同位素离子峰丰度比应用于确证步骤。

目前对于保健品中维生素与天然抗氧化剂高通量快速筛查技术的研究仍为空白。用于保健品中维生素与天然抗氧化剂残留的高通量、快速检测方法较少，前处理操作复杂，材料与设备成本高，仅限于几种或一类化合物的快速检测，多残留快速分析时往往根据化合物的结构特点将化合物分组后检测。近年来，QuEChERS广谱提取方法的应用和通过仪器联用使得保健品中外源性风险物质筛查分析技术迅速发展。本文针对上述现状，运用高分辨质谱四级杆静电场轨道离子阱质谱，并结合化学计量学对QuEChERS前处理条件优化与定量数据分析，针对与人们生活息息相关的保健品，建立了外源性风险物质色谱质谱联用高通量、快速筛查分析方法。

以保健品复杂基质为模型，建立了外源性风险物质已知目标物质筛查分析方法。以系统的方法学参数考察方案-欧盟标准2002/657/EC与SANCO/12571/2013，对运用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道离子阱质谱，建立的保健品中维生素与天然抗氧化剂的筛查分析方法进行考核，所有库内潜在目标化合物在线性范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，高、中、低三个添加水平下，回收率达到85％-113％，重复实验6次，其相对标准偏差为0.3％-6.4％。确定限(CCα)和检测容量(CCβ)分别为0.05μg/kg-1.91μg/kg与0.08μg/kg-3.18μg/kg，优于中国、日本、美国和欧盟等国家和有关国际组织规定的限量要求，灵敏度与精确度较国标方法提高5倍以上。

以上仅为本发明的较佳实施例，并非仅限于本发明的实施范围，凡依本发明专利范围的内容所做的等效变化和修饰，都应为本发明的技术范畴。