一种同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法与流程

本发明属于中药成分分析技术领域，具体涉及一种利用高效液相色谱法同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法。

背景技术：

大青叶为十字花科(Cruciferae)菘蓝属(Isatis)两年生草本植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥叶，是常见的大宗药材之一，主要分布于陕西、甘肃、河北、江苏等地。大青叶的有效成分主要包括核苷、生物碱、有机酸等，核苷类成分，具有活血化瘀之功效，4(3H)-喹唑酮、色胺酮、靛玉红等是抗病毒的有效成分，松柏苷和槲皮素具有抗氧化活性，靛蓝主要作为色素染料。《中华人民共和国药典·一部》(2015版)仅对大青叶中靛玉红的含量进行了考察，并未对其所含有的其他有效成分进行描述和评价，对于科学评价大青叶药材品质具有一定的局限性。大青叶含有多种有效成分，若能通过简单、快速、高效的方法同时测定多种有效成分，如胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝、靛玉红等的含量，将有助于全面、准确地评价大青叶药材质量，为其规范化栽培和生产提供合理依据。

已有研究人员分别对大青叶中黄酮类物质、核苷类物质、脂肪酸类物质的含量进行了测定，但同时测定大青叶中核苷类和生物碱类物质，包括胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝、靛玉红等11种有效成分的含量测定尚无文献报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种同时测定大青叶中11种有效成分含量的方法，进而比较不同产区大青叶在化学成分组成及含量上存在的异同，为大青叶药材的品质鉴定及质量控制提供参考。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、制备11种有效成分的对照品溶液，所述的11种有效成分为胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红。

2、利用高效液相色谱法对步骤1中的对照品溶液进行分析，色谱条件为：采用C₁₈色谱柱，以水和甲醇为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为：0～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；以峰面积值为纵坐标、对照品含量为横坐标，绘制各对照品的峰面积值随含量变化的标准曲线。

3、制备大青叶供试品溶液。

4、按照步骤2的色谱条件对大青叶供试品溶液进行分析，通过标准曲线法计算大青叶供试品溶液中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的含量。

上述步骤3中，优选制备大青叶供试品溶液的方法为：将大青叶经50℃烘干后粉碎过40目筛，所得药材粉末与体积分数为65％的甲醇水溶液按料液比为1g:30mL混合，30℃超声提取30min，离心分离，上清液过0.22μm微孔滤膜，即得大青叶供试品溶液。

上述方法中，进一步优选C₁₈色谱柱为ThermoC₁₈色谱柱，检测柱温为25～35℃，检测波长为254～270nm，流动相的流速为1.0mL/min。

本方法以甲醇-水为流动相，应用梯度洗脱的方法，建立了同时测定大青叶中11种有效成分的方法，该方法操作简单、准确、重现性和稳定性良好，11种有效成分均能获得有效分离，可为全面评价和控制大青叶药材质量提供有效参考。

附图说明

图1是11种对照品的色谱图，其中1是胞苷、2是尿苷、3是腺嘌呤、4是鸟苷、5是腺苷、6是松柏苷、7是4(3H)-喹唑酮、8是槲皮素、9是色胺酮、10是靛蓝、11是靛玉红。

图2是10个产区的大青叶供试品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

本实施例采用高效液相色谱法同时测定10个不同产地的大青叶中的11种有效成分的含量，其11种有效成分为胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红；大青叶于2015年7月收集自陕西渭南、陕西商洛、陕西西安、河南辉县、河北安国、安徽亳州、甘肃甘谷、江苏无锡、湖南长沙、山东菏泽10个产区，具体测试方法如下：

1、制备11种有效成分的对照品溶液

精密称取胞苷(西玛实验室，批号：0715)、尿苷(中国药品生物制品检定所，批号：887-200202)、腺嘌呤(西玛实验室，批号：07S15)、鸟苷(西玛实验室，批号：09S14)、腺苷(中国药品生物制品检定所，110879-200202)、松柏苷(西玛实验室，批号：05W16)、4(3H)-喹唑酮(西玛实验室，批号：01A16)、槲皮素(中国药品生物制品检定所，100081-200907)对照品各5.0mg，分别置于5mL容量瓶中，以色谱甲醇溶解并定容；精密称取色胺酮(西玛实验室，批号：07S15)、靛蓝(中国药品生物制品检定所，批号：MUST-13031101)、靛玉红(中国药品生物制品检定所，批号：110717-200204)对照品各2.0mg，分别置于5mL容量瓶中，以少量二甲基亚砜助溶，并以色谱甲醇定容。将上述溶液分别稀释100、100、50、50、25、100、100、100、20、20、20倍，0.22μm微孔滤膜过滤，即得0.01mg/mL胞苷、0.01mg/mL尿苷、0.02mg/mL腺嘌呤、0.02mg/mL鸟苷、0.04mg/mL腺苷、0.01mg/mL松柏苷、0.01mg/mL 4(3H)-喹唑酮、0.01mg/mL槲皮素、0.02mg/mL色胺酮、0.02mg/mL靛蓝和0.02mg/mL靛玉红对照品溶液。

2、利用高效液相色谱仪(Agilent公司，型号：1260)对步骤1中的11种对照品溶液分别进行分析，色谱条件为：采用Thermo C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以水和甲醇(色谱纯)为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长260nm，洗脱程序为：0～6min，5％甲醇；6～20min，5％～14％甲醇；20～30min，14％～25％甲醇；30～65min，25％～50％甲醇；65～75min，50％～75％甲醇；75～85min，75％～95％甲醇；11种对照品溶液均分别以1μL、5μL、10μL、15μL、20μL体积进样，以峰面积值为纵坐标、样品含量为横坐标，绘制各对照品的峰面积值随含量变化的标准曲线，得到表1所示的线性回归方程。

表1线性关系试验结果(n＝3)

同时以甲醇为溶剂，配制11种有效成分的混合液，混合液中胞苷的浓度为0.025mμg/mL、尿苷的浓度为0.0163mg/mL、腺嘌呤的浓度为0.0163mg/mL、鸟苷的浓度为0.025mg/mL、腺苷的浓度为0.015mg/mL、松柏苷的浓度为0.0156mg/mL、4(3H)-喹唑酮的浓度为0.0125mg/mL、槲皮素的浓度为0.0025mg/mL、色胺酮的浓度为0.01mg/mL、靛蓝的浓度为0.1875mg/mL、靛玉红的浓度为0.044mg/mL。按照上述测试条件，进样量为10μL，得到图1所示的11种对照品的色谱图。由图1可见，混合样中11中有效成分均得到有效分离。

3、制备大青叶供试品溶液

分别将不同产区的大青叶在50℃下烘干后，用手提式粉碎机(温岭市林大机械有限公司，型号：DFT-50)粉碎并过40目筛，然后精密称取所得大青叶粉末0.5g，置于50mL离心管中，再加入15mL体积分数为65％的甲醇水溶液，称重，用超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB25-12DTD)，在30℃下超声提取(功率400W)30min，取出再称重，用体积分数为65％的甲醇水溶液补足减失质量，提取完后用超低温高速冷冻离心机(Thermo公司，型号：Sorvall ST 16R)在5000r/min下离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，所得滤液作为大青叶供试品溶液。

4、按照步骤2的色谱条件对步骤3的大青叶供试品溶液进行分析，进样量为10μL，测定各成分峰面积值，然后通过步骤2所得线性回归方程计算大青叶供试品溶液中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的含量，结果见图2及表2。

表2不同产区大青叶中11种有效成分的含量测定结果(mg/g，n＝3，)

注：表中“—”表示未检出。

由图2及表2可知，不同产区大青叶中11种有效成分的含量存在差异。总体而言，湖南长沙大青叶中的胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮含量均高于其他产区；陕西渭南和河北安国的大青叶中未检测到松柏苷，而陕西西安和河北安国的大青叶中靛蓝含量较高；河南辉县大青叶中色胺酮含量远高于其他产区，但其他目标物含量均低于各物质平均含量；此外，河北安国、河南辉县和江苏无锡的药材中未检测到4(3H)-喹唑酮。可见，环境因素对于药用植物次生代谢产物的合成积累存在影响，一定程度上影响了药材品质。因此，应该重点加强大青叶药材的规范化生产，注重优良大青叶品种的筛选和培育，进一步提高药材品质。

为了证明本发明方法的可行性，发明人进行了大量的实验室研究试验，具体试验情况如下：

1、精密度试验

精密吸取大青叶供试品溶液按照实施例1中的色谱条件连续进样6次，每次进样量为10μL，测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的峰面积值，经计算其RSD值范围为1.26％～2.81％(见表3)，结果表明该方法精密度良好。

2、重复性试验

精密吸取与试验1相同的大青叶供试品溶液按照实施例1中的色谱条件连续进样6次，每次进样量为10μL，测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的峰面积值，经计算其RSD值范围为0.63％～2.96％(见表3)，结果表明该方法重复性良好。

3、稳定性试验

精密吸取与试验1相同的大青叶供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样10μL，测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的峰面积值，经计算其RSD值范围为0.1％～2.88％(见表3)，结果表明11种有效成分的大青叶供试品溶液在24h内稳定性良好。

表3精密度、稳定性和重复性试验结果(n＝6)

4、加样回收率试验

准确称量已知11中有效成分含量的大青叶粉末3份，分别加入11种对照品，按照实施例1的方法制备大青叶供试品溶液，测定胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟苷、腺苷、松柏苷、4(3H)-喹唑酮、槲皮素、色胺酮、靛蓝和靛玉红的峰面积值，根据表1中的线性回归方程计算大青叶供试品溶液中各成分的含量，并计算加标回收率，结果见表4。

表4 11种有效成分的回收率试验结果(n＝6)

由表4可见，各成分的的加标回收率范围为95.67％～100.95％，RSD值范围为0.26％～3.36％，表明该方法稳定可靠。