本发明涉及一种测定方法，具体是一种纳他霉素含量的测定方法。
背景技术：
纳他霉素(Natamyin)最早发现于1955年，也称匹马菌素(Pimaricin)、游链霉素或海松素，是一种重要的多烯烃大环内酯类抗菌素。其生产途径较多，可以由纳塔尔链霉菌(StreptomycesNatalensisi)、恰塔努加链霉菌(Streptomyceschmanovgensis)和褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)等多种链霉菌发酵产生，是一种天然的多烯烃大环内脂类生物抗菌剂和食品添加剂。在发现初期，纳他霉素主要使用在医药方面，1960年以后才逐渐被纳入食品防腐剂的行列。在1976年、1982年和1996年分别通过FAO/WHO、美国食品与药品管理局(FDA)，中国允许作为食品添加剂使用，目前已有三十多个国家允许使用。虽然作为食品添加剂，纳他霉素具有广适性、高效性、低毒性的特点，可以应用于很多的食品中。然而，目前纳他霉素标准品溶液及其在测定样品中纳他霉素含量中的用途仍有待改进。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种纳他霉素含量的测定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种纳他霉素含量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：(1)活化：分别用8～10ml甲醇、6～8ml水依次活化固相萃取小柱；(2) 食品样品经冷冻干燥；(3)粉碎食品样品并过筛；(4)利用缓冲溶液为溶剂，稀释样品至合适浓度，并使之带正电；(5)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(6)将处理后的样本注入固相萃取小柱；(7)使用淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；(8)使用洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；(9)绘制纳他霉素标准曲线：称取2-3mg纳他霉素，用甲醇定容在5-8ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；(10)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(8)所得溶液通过0.6μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(9)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量。
作为本发明进一步的方案：所述固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱。
作为本发明进一步的方案：所述第(5)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1：1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30s，超声10-25min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。
作为本发明再进一步的方案：所述第(3)步粉碎并过筛是后过1mm筛。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明纳他霉素含量的测定方法能有效测定各种食品中的纳他霉素含量，准确率高。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种纳他霉素含量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：(1)活化：分别用8～10ml甲醇、6～8ml水依次活化固相萃取小柱；(2) 食品样品经冷冻干燥；(3)粉碎食品样品并过筛；(4)利用缓冲溶液为溶剂，稀释样品至合适浓度，并使之带正电；(5)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(6)将处理后的样本注入固相萃取小柱；(7)使用淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；(8)使用洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；(9)绘制纳他霉素标准曲线：称取2-3mg纳他霉素，用甲醇定容在5-8ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；(10)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(8)所得溶液通过0.6μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(9)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量。所述固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱。所述第(5)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1：1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30s，超声10-25min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。所述第(3)步粉碎并过筛是后过1mm筛。
实施例1
本发明纳他霉素含量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：(1)活化：分别用8ml甲醇、6ml水依次活化固相萃取小柱；(2) 食品样品经冷冻干燥；(3)粉碎食品样品并过筛；(4)利用缓冲溶液为溶剂，稀释样品至合适浓度，并使之带正电；(5)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(6)将处理后的样本注入固相萃取小柱；(7)使用淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；(8)使用洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；(9)绘制纳他霉素标准曲线：称取2mg纳他霉素，用甲醇定容在5-8ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；(10)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(8)所得溶液通过0.6μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(9)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量。所述固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱。所述第(5)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1：1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30s，超声20min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。所述第(3)步粉碎并过筛是后过1mm筛。
实施例2
本发明纳他霉素含量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：(1)活化：分别用10ml甲醇、8ml水依次活化固相萃取小柱；(2) 食品样品经冷冻干燥；(3)粉碎食品样品并过筛；(4)利用缓冲溶液为溶剂，稀释样品至合适浓度，并使之带正电；(5)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(6)将处理后的样本注入固相萃取小柱；(7)使用淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；(8)使用洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；(9)绘制纳他霉素标准曲线：称取2mg纳他霉素，用甲醇定容在5-8ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；(10)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(8)所得溶液通过0.6μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(9)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量。所述固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱。所述第(5)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1：1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30s，超声15min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。所述第(3)步粉碎并过筛是后过1mm筛。
实施例3
本发明纳他霉素含量的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：(1)活化：分别用9ml甲醇、7ml水依次活化固相萃取小柱；(2) 食品样品经冷冻干燥；(3)粉碎食品样品并过筛；(4)利用缓冲溶液为溶剂，稀释样品至合适浓度，并使之带正电；(5)加入EDTA-Mcllvaine和乙腈混合提取剂，漩涡混匀并超声处理；(6)将处理后的样本注入固相萃取小柱；(7)使用淋洗溶液进行淋洗，然后真空泵抽干固相萃取小柱；(8)使用洗脱溶液进行洗脱，然后真空泵抽干固相萃取小柱，收集洗脱液，置于棕色的进样小瓶，备用；(9)绘制纳他霉素标准曲线：称取3mg纳他霉素，用甲醇定容在5-8ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存至检测前；然后，用50％甲醇稀释，分别配制5、10、20、50、100μg/L的纳他霉素标准溶液；通过0.45μm聚四氟乙烯过滤膜后分别注入高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，得到纳他霉素标准曲线；(10)计算酒样纳他霉素含量：将步骤(8)所得溶液通过0.6μm聚四氟乙烯过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱HPLC-MS/MS测定，所获得的检验数据通过步骤(9)所得纳他霉素标准曲线计算酒样中纳他霉素含量。所述固相萃取小柱为WAX固相萃取柱小柱。所述第(5)步加入EDTA-Mcllvaine：乙腈=1：1(体积比)的混合提取剂，漩涡混匀30s，超声10min，其中混合提取剂为pH≤3.0，优选pH=2，超声提取时间为15min。所述第(3)步粉碎并过筛是后过1mm筛。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。