一种测定曲司氯铵含量的方法与流程

本发明属于药品检测领域，涉及一种测定曲司氯铵含量的方法。
背景技术：
：曲司氯铵是一种毒蕈碱受体拮抗剂，通过阻断乙酰胆碱对毒蕈碱受体的作用，进而影响由乙酰胆碱介导神经冲动的器官，包括膀胱。曲司氯铵的副交感神经组织作用降低膀胱中的肌肉紧张。曲司氯铵是治疗伴有急迫性尿失禁、尿急、尿频的膀胱过度活动症(overactivebladder，OAB)的一线用药，与其他抗毒蕈碱受体药物相比具有神经系统副作用小的优势，其结构式如下：目前关于曲司氯铵原料及相关制剂的分析方法的报道不多，其中关于曲司氯铵原料含量的测定方法采用是滴定法分析。滴定法测定含量耗时较长，需要10-20分钟，另外当用于制剂中药物含量测定时，无法排除辅料的干扰，并且当溶液浓度较低时，灵敏度受低浓度时电极电位测量准确度的限制。目前，液相色谱是现代色谱技术中最活跃的分析方法之一。近年来，随着科学技术的进步和工业发展，各领域对液相色谱技术的要求日益提高。首先是随着生产力的不断发展，大批量样品的分析需要在很短的时间内完成，其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求等。因此，研发出一种基于小颗粒填料的液相色谱技术—超高效液相色谱(UltraPerformanceLiquidChromatography，UPLC)并成功地应用于各分析行业。现今还未见使用UPLC来分析曲司氯铵原料以及制剂的含量的相关报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种测定曲司氯铵含量的方法。本发明提供一种测定曲司氯铵含量的方法，所述方法为使用超高效液相色谱法测定曲司氯铵的含量，包括以下步骤：1)分别配制曲司氯铵对照样品溶液和待测样品溶液；2)将步骤1)制备得到的所述对照样品溶液和所述待测样品溶液进行超高效液相色谱检测，得到超高效液相色谱图；3)将所得色谱图利用外标法以峰面积计算，以步骤2)所得到的对照样品溶液的超高效液相色谱图作为对照，计算所述待测样品中曲司氯铵的含量，其中，所述待测样品为含有曲司氯铵的物质。步骤2)中所述检测的条件为：所用色谱柱为反相色谱柱，进一步优选为反相C18或C8色谱柱；流动相为pH值2.0～7.0的由磷酸水溶液和乙腈组成的混合液；其中，所述磷酸水溶液的浓度为0.01mol/L～0.06mol/L，所述磷酸水溶液与乙腈的体积比为(65～85)：(15～35)；所用流动相的流速为0.4ml/min～0.8ml/min；检测波长为210nm～220nm。在本发明的实施例中，所述pH值为2.0、3.0、5.0、7.0，所述pH值优选为3.0～5.0。优选地，所述磷酸水溶液和乙腈的体积比为(65～70)：(30～35)或(70～85)：(15～30)，进一步优选地，所述磷酸水溶液与乙腈的体积份数比为65：35或70：30或85：15。在本发明的实施例中，所述流动相的流速为0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min或0.8ml/min。在本发明的实施例中，所述检测波长具体可为210nm、215nm、220nm；优选地，所述色谱柱的柱温为30～50℃，进一步优选地，所述色谱柱的柱温为30℃、40℃、35℃、50℃。在本发明的实施例中，所述反相色谱柱为WatersUPLCBEHShieldRP18、WatersUPLCBEHC18、WatersXBridgeBEHShieldRP18、AgilentZORBAXRRHDSB-C18或WatersUPLCBEHC8；优选地，所述反相色谱柱中填料的粒径为1.7μm～2.5μm，色谱柱的柱长为50mm～100mm，孔径为2.1mm～4.6mm。在本发明的实施例中，所述方法进样量均为1μl。在本发明的实施例中，所述对照样品溶液的浓度范围为10.10μg/ml～100.98μg/ml。所述曲司氯铵对照样品溶液的出峰位置为0.627min、0.628min或0.627min-0.628min。本发明利用外标法以峰面积计算得到待测样品中曲司氯铵含量的方法，其原理是基于曲司氯铵对照样品溶液的浓度与超高效液相色谱图检测所得谱图中曲司氯铵对应峰的峰面积成线性关系，故在已知曲司氯铵对照样品溶液的浓度、曲司氯铵对应峰的峰面积以及待测样品中相同位置对应峰的峰面积的前提下，即可通过该线性关系计算得到待测样品中曲司氯铵的含量。在本发明的实施例中，所述含曲司氯铵的物质为曲司氯铵原料药及各种曲司氯铵制剂；优选地，所述曲司氯铵制剂为曲司氯铵双释放胶囊、曲司氯铵缓释胶囊、曲司 氯铵片或曲司氯铵缓释片。在本发明的实施例中，所用检测仪为WatersACQUITYUPLCH-ClassBio超高效液相色谱仪。本发明提供的一种测定曲司氯铵含量的方法各个测定条件均得到了优化，具有以下技术效果：1、延长色谱柱使用寿命、准确性高：在液相技术中，色谱柱的使用寿命与使用流动相的pH直接相关，pH越低，对色谱柱的损坏越大，同时由于曲司氯铵对碱敏感，pH较高时容易发生降解，影响其含量测定。因此在本发明方法中，申请人对流动相pH进行了摸索,最后将流动相pH确定为2～7，优选为3.0～5.0，不仅可延长色谱柱的使用寿命，还可避免高pH对曲司氯铵的破坏，并且该方法回收率在98％～102％之间，方法准确性较高。2、成本大大降低：本发明的溶剂使用量仅为0.4～0.8ml流动相，溶剂使用量很少；同时，由色谱图中可以看出本发明方法在1min即可测定一个样品，节约了检测时间。3、分离度高且灵敏度得到大大提高：本发明提供的方法，能将杂质峰与曲司氯铵很好的分离，尤其是主成分与相邻最近的杂质峰的分离度达到4.1以上，避免了由于主峰与杂质峰重合造成面积重视性差而带来的系统误差，系统适用性良好；同时本发明方法的定量限达0.15ng，灵敏度得到大大提高。4、线性达到0.99以上：本发明方法测定曲司氯铵浓度的范围在10.10μg/ml-100.98μg/ml时，浓度与峰面积呈现良好线性关系，相关系数r可达到0.99以上。5、重复性和中间精密度较好：本发明方法的重复性和中间精密度较好，RSD值均小于2％，测得的试验结果偏差小。6、使用范围广：由于曲司氯铵缓释制剂的释放时间长，使用常规方法测定释放度的耗时较长，因释放度测定方法与含量测定方法相同，因此本发明不仅可以准确测定曲司氯铵原料及曲司氯铵各种制剂中的曲司氯铵含量，也可以快速、准确的测定曲司氯铵的释放度，为缓释药物处方工艺的开发及药物释放度监测大大节约了时间。附图说明图1为实施例1中空白溶剂的反相色谱检测谱图。图2为实施例1中空白辅料的反相色谱检测谱图。图3为实施例1中曲司氯铵对照品的反相色谱检测谱图。图4为实施例1中A0.5μg/ml、杂质B2.5μg/ml、曲司氯铵1.5μg/ml的系统适应性溶液的反相色谱检测谱图。图5为曲司氯铵定量限的反相色谱检测谱图。图6为实施例1中三个批号的曲司氯铵双释放胶囊供试品的反相色谱检测谱图。图7为实施例2中曲司氯铵缓释胶囊供试品的反相色谱检测谱图。图8为实施例3中曲司氯铵片供试品的反相色谱检测谱图。图9为实施例4中曲司氯铵原料供试品的反相色谱检测谱图。图10为实施例5中空白溶剂的反相色谱检测谱图。图11为实施例5中空白辅料的反相色谱检测谱图。图12为实施例5中曲司氯铵对照品的反相色谱检测谱图。图13为实施例5中曲司氯铵缓释片供试品的反相色谱检测谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。以下实施例中的试剂，除非特别说明，均为色谱纯，且可从正规渠道商购获得：其中曲司氯铵对照品，购自百灵威；杂质A(二苯乙醇酸)购自百灵威；杂质B(二苯乙醇酸莨菪烷)购自百灵威。实施例1：外标法测定曲司氯铵双释放胶囊中曲司氯铵含量方法学验证一、色谱条件：仪器：WatersACQUITYUPLCH-ClassBio超高效液相色谱仪；色谱柱：WatersUPLCBEHShieldRP18，1.7μm，2.1×50mm；流动相：pH值为3.0的由0.03mol/L磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值为3.0)和乙腈以体积比为65：35混合而得的混合液；流动相的流速：0.6ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量为1μl。二、实验步骤：1、专属性分别取曲司氯铵双释放胶囊的空白溶剂(水)、空白辅料溶液(见CN104739808A，实施例1)、曲司氯铵对照品溶液(50μg/ml)各1μl依次以上述色谱条件检测，以确定空白溶剂与空白辅料的出峰位置。所得结果如图1所示，空白溶剂在0.2～0.4min之间有溶剂峰产生，图2所示，空白辅料未出峰，图3所示，曲司氯铵在0.627min处有吸收峰，空白溶剂和空白辅料在该处均无吸收，不干扰本品的含量测定。2、系统适用性试验精密称取杂质A、杂质B和曲司氯铵对照品，以水为溶剂，分别配制成杂质A0.5μg/ml、杂质B2.5μg/ml、曲司氯铵1.5μg/ml的系统适应性溶液。所得结果如图4所示，杂质B在0.562min出峰，与曲司氯铵分离度达到4.10，杂质A在0.871min出峰，与曲司氯铵分离度达到5.49，杂质均不影响曲司氯铵的含量测定，系统适用性良好。3、进样精密度取50μg/ml的曲司氯铵对照品溶液，精密量取1μl注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次，计算峰面积的RSD值。结果见表1。表1、进样精密度结果结论：RSD为0.26％，进样精密度良好。4、线性关系与范围配制浓度为10.10、30.29、50.49、70.69和100.98μg/ml的曲司氯铵对照品溶液，分别进行色谱测定。以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数。结果见表2。表2、线性试验结果结论：表明进样量为1μl时，曲司氯铵在10.10μg/ml～100.98μg/ml的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好线性关系。5、回收率试验制备曲司氯铵对照品储备液，加入曲司氯铵双释放胶囊处方比例(CN2015100790283，实施例1)的空白辅料，制备浓度为40、50、60μg/ml的溶液，每个浓度平行配制三份，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液1μl，注入液相色谱仪。另取曲司氯铵对照品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml中约含曲司氯铵50μg的溶液，作为对照溶液。按外标法以峰面积计算回收率。结果见表3。表3、回收率试验结果结论：各浓度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之间，平均回收率为100.8％，RSD为0.74％，回收率良好。6、重复性试验对照品溶液的制备：取曲司氯铵对照品12.5mg，精密称定，制备成浓度为50μg/ml的对照品溶液。供试品溶液的制备：取曲司氯铵双释放胶囊20粒，将内容物研细，精密称取适量(约相当于曲司氯铵12.5mg)，制备成浓度为50μg/ml的供试品溶液，平行配制6份。精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量。结果见表4。表4、重复性试验结果结论：RSD为0.81％，重复性良好。7、中间精密度试验在不同的检查日期，采用不同的分析仪器，不同的试验人员，按照步骤6“重复性试验”方法，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，并计算含量的相对标准偏差(RSD)，。结果见表5。表5、中间精密度试验结果结论：RSD为0.81％，结果表明本品测定方法中间精密度良好。8、定量限取曲司氯铵对照品适量，精密称定，加水溶解并逐级稀释，精密量取溶液1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图中主峰峰高约为基线噪音的10倍时即为定量限浓度。经计算，本品的定量限为0.15ng。见图5。另配制6份定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的峰面积的相对标准差小于2.0％。结果见表6。表6、定量限试验结果(n＝6)样品123456均值RSD(％)峰面积4594504654724754624641.95保留时间(min)0.6770.6780.6780.6770.6780.6770.6780.08以上含量测定方法验证结果表明：本方法专属性强、重复性好、准确度高，定量限低。采用该方法对生产的3批中试样品进行含量测定，规格为60mg，批号为：201407002、201407003、201408004。取曲司氯铵双释放胶囊20粒，精密称定，计算平均装量。取内容物，混合均匀，研细，精密称取适量(约相当于曲司氯铵12.5mg)，制备浓度为50μg/ml的溶液，精密量取1μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取曲司氯铵对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含50μg的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。测定结果见表7及图6。表7、中试样品含量测定结果样品批号201407002201407003201408004含量(％)98.399.999.2结论：三批样品含量合格。实施例2：外标法测定曲司氯铵缓释胶囊中曲司氯铵含量一、色谱条件：仪器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色谱仪；色谱柱：WatersUPLCBEHC18，1.7μm，2.1×100mm；流动相：pH值为7.0的由0.03mol/L磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值为7.0)和乙腈以体积比为85：15混合而得的混合液；流动相的流速：0.8ml/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样量为1μl。二、实验步骤：1、回收率制备曲司氯铵对照品储备液，加入曲司氯铵缓释胶囊处方比例(CN103690506B，实施例3)的空白辅料，制备浓度为40、50、60μg/ml的溶液，每个浓度平行配制三份，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液1μl，注入液相色谱仪。另取曲司氯铵对照品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml中约含曲司氯铵50μg的溶液，作为对照溶液。按外标法以峰面积计算回收率。结果见表8。表8回收率试验结果结论：各浓度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之间，平均回收率为99.7％，RSD为0.94％，回收率良好。2、重复性试验对照品溶液的制备：取曲司氯铵对照品12.5mg，精密称定，制备成浓度为50μg/ml的对照品溶液。供试品溶液的制备：取曲司氯铵缓释胶囊20粒，将内容物研细，精密称取适量(约相当于曲司氯铵12.5mg)，制备成浓度为50μg/ml的供试品溶液，平行配制6份。精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量。结果见表9。表9重复性试验结果结论：RSD为0.48％，重复性良好。3、含量测定对照品溶液的制备：取曲司氯铵对照品12.5mg，制备浓度为50μg/ml的对照品溶液。供试品溶液的制备：取曲司氯铵缓释胶囊20粒，将内容物研细，精密称取适量(约相当于曲司氯铵12.5mg)，制备浓度为50μg/ml的供试品溶液。精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，即得。表10中对照与样品均为双样双针，同一样品配制两份，保证平行性，重复检测2次，结果见表10和图7。表10、实施例2曲司氯铵缓释胶囊中曲司氯铵含量结果由表可知，采用该色谱条件测得的曲司氯铵缓释胶囊中曲司氯铵的含量合格。实施例3：外标法测定曲司氯铵片中曲司氯铵含量一、色谱条件：仪器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色谱仪；色谱柱：WatersXBridgeBEHShieldRP18，2.5μm，4.6×75mm；流动相：pH值为2.0的由0.01mol/L磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值为2.0)和乙腈以体积比为65：35混合而得的混合液；流动相的流速：0.4ml/min；柱温：35℃；检测波长：210nm；进样量为1μl。二、实验步骤：1、回收率制备曲司氯铵对照品储备液，加入曲司氯铵片处方比例(CN201510363089.2，实施例2)的空白辅料，制备浓度为40、50、60μg/ml的溶液，每个浓度平行配制三份，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液1μl，注入液相色谱仪。另取曲司氯铵对照品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml中约含曲司氯铵50μg的溶液，作为对照溶液。按外标法以峰面积计算回收率。结果见表11。表11回收率试验结果结论：各浓度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之间，平均回收率为100.2％，RSD为0.83％，回收率良好。2、重复性试验对照品溶液的制备：取曲司氯铵对照品12.5mg，精密称定，制备成浓度为50μg/ml的对照品溶液。供试品溶液的制备：取曲司氯铵片20片，研细，精密称取适量(约相当于曲司氯铵12.5mg)，制备成浓度为50μg/ml的供试品溶液，平行配制6份。精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量。结果见表12。表12重复性试验结果结论：RSD为0.53％，重复性良好。3、线性关系与范围参照实施例1方法配制曲司氯铵对照品溶液分别进行色谱测定，并按照上述方法计算回归方程及相关系数，回归方程为y＝3350x-1139，相关系数r为0.9998。结果表明进样量为1μl时，曲司氯铵在10.00μg/ml～100.88μg/ml的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好线性关系。4、含量测定同实施例2，结果见表13和图8。表13、实施例3曲司氯铵片中曲司氯铵含量结果由表可知，采用该色谱条件测得的曲司氯铵片中曲司氯铵的含量合格。实施例4：外标法测定曲司氯铵原料中曲司氯铵含量一、色谱条件：仪器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色谱仪；色谱柱：AgilentZORBAXRRHDSB-C18，1.8μm，2.1×50mm流动相：pH值为3.0的由0.03mol/L磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值为3.0)和乙腈以体积比为70：30混合而得的混合液；流动相的流速：0.5ml/min；柱温：50℃；检测波长：215nm；进样量为1μl。二、实验步骤：1、重复性试验对照品溶液的制备：取曲司氯铵对照品12.5mg，制备浓度为50μg/ml的对照品溶液。供试品溶液的制备：取曲司氯铵原料12.5mg(购自扬子江药业集团有限公司)，制备浓度为50μg/ml的供试品溶液，平行配制6份。精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，结果见表14。表14、重复性试验结果结论：RSD为0.05％，重复性良好。2、中间精密度试验在不同的检查日期，采用不同的分析仪器，不同的试验人员，按照步骤1的“重复性试验”方法，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，并计算含量的相对标准偏差(RSD)。结果见表15。表15、中间精密度试验结果结论：RSD为0.06％，结果表明本品测定方法中间精密度良好。3、定量限参照实施例1定量限的检测方法，得出本实施例色谱条件下曲司氯铵对照品的定量限为0.149ng。4、含量测定精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，即得。表16中对照与样品均为双样双针，同一样品配制两份，保证平行性，重复检测2次，结果见表16及图9。表16、实施例4曲司氯铵原料含量测定结果由表可知，采用该色谱条件测得的曲司氯铵原料中曲司氯铵的含量合格。实施例5：外标法测定曲司氯铵缓释片中曲司氯铵含量一、色谱条件：仪器：WatersACQUITYH-ClassBio超高效液相色谱仪；色谱柱：WatersUPLCBEHC8，1.7μm，2.1×50mm；流动相：pH值为5.0的由0.06mol/L磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值为5.0)和 乙腈以体积比为70：30混合而得的混合液；流动相的流速：0.5ml/min；柱温：40℃；检测波长：215nm；进样量为1μl。二、实验步骤：1、专属性按照专利CN101596170A的实施例1分别制备曲司氯铵缓释片、空白辅料()，取空白溶剂、空白辅料溶液、曲司氯铵对照品溶液(50μg/ml)各1μl依次以上述色谱条件检测，以确定空白溶剂与空白辅料的出峰位置。图10所示，空白溶剂在0.2～0.4min之间有溶剂峰产生，图11所示，空白辅料在0.2～0.5min之间有辅料峰产生，图12所示，曲司氯铵在0.628min处有吸收峰，空白溶剂和空白辅料在该处均无吸收，不干扰本品的含量测定。2、重复性试验取曲司氯铵对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含50μg的对照溶液；取曲司氯铵缓释片20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于曲司氯铵12.5mg)，制备浓度为50μg/ml的溶液，平行配制6份。精密量取对照品溶液和供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，即得。结果见表17。表17、重复性试验结果结论：RSD为0.71％，重复性良好。3、中间精密度试验在不同的检查日期，采用不同的分析仪器，不同的试验人员，按照上文步骤2“重复性试验”方法，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，并计算含量的相对标准偏差(RSD)。结果见表18。表18、中间精密度试验结果结论：RSD为0.98％，结果表明本品测定方法中间精密度良好。4、回收率试验制备曲司氯铵对照品储备液，加入曲司氯铵缓释片处方比例(CN101596170A，实施例1)的空白辅料，制备浓度为40、50、60μg/ml的溶液，每个浓度平行配制三份，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液1μl，注入液相色谱仪。另取曲司氯铵对照品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml中约含曲司氯铵50μg的溶液，作为对照溶液。按外标法以峰面积计算，结果见表19。表19、回收率试验结果结论：各浓度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之间，平均回收率为100.0％，RSD为0.46％，回收率良好。5、含量测定取曲司氯铵缓释片20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于曲司氯铵12.5mg)，制备浓度为50μg/ml的溶液，精密量取1μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取曲司氯铵对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含50μg的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。表20中对照与样品均为双样双针，同一样品配制两份，保证平行性，重复检测2次，测定结果见表20及图13。表20、实施例5曲司氯铵缓释片中曲司氯铵的含量测定结果由表可知，采用该色谱条件测得的曲司氯铵缓释片中曲司氯铵的含量合格。当前第1页1 2 3