免疫亲和净化‑液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法与流程

本发明涉及一种贝类中腹泻性贝类毒素的检测方法，特别涉及一种免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法。

背景技术：

大田软海绵酸(Okadaic Acid，OA)及其衍生物鳍藻毒素(Dinophysistoxins，DTXs)是一类亲脂性聚醚类化合物(图1)，主要由有毒赤潮藻类鳍藻属和原甲藻属的部分藻类产生。当有毒微藻被双壳贝类滤食后，OA和DTXs毒素会在贝体内累积，导致贝类食用者中毒，出现腹泻、恶心、呕吐及下腹疼痛等症状，是腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfish poisons，DSP)中分布最广、危害最大的一类组分。除能引起腹泻外，OA和DTXs毒素还能损伤肠黏膜，是肿瘤促进因子，具有遗传毒性。欧盟对贝类组织中腹泻性贝毒的安全限量为160μg/kg，我国出入境检验检疫行业标准则规定任何腹泻性贝毒含量不得大于160μg/kg样品。我国东海海域是赤潮多发生区域，通过对长江口及邻近海域有毒藻类和赤潮毒素调查发现，该区域常年存在能产生腹泻性贝毒的具尾鳍藻和倒卵形鳍藻。考虑到该类毒素对人体健康的潜在危害，有必要加强贝类中腹泻性贝毒。

目前，用于腹泻性贝类毒素检测的方法主要有小鼠生物法、酶联免疫法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用等方法。小鼠生物法是调查检测腹泻性贝毒发展最早、应用最广泛的分析方法，但仅能指出毒性的大小，无法确定毒素的组成和含量，可比性较差。酶联免疫法反应迅速、成本低，但其准确度较差，易受交叉反应的影响而出现假阴性或假阳性。液相色谱法技术是有效的非生物检测法，但缺乏准确的定性能力，且需要复杂的前处理和繁琐的衍生步骤。液质联用技术结合了液相色谱优越的分离能力与质谱高灵敏度的定性定量功能，但现有文献多采用固相萃取技术净化样品，但回收率低、基质干扰仍较严重，导致方法应用率不高，无法有效监测腹泻性贝类毒素。免疫亲和柱(IAC)是一种基于抗原抗体反应的新型层析柱，利用特异性生物大分子抗体对另一类生物大分子特异识别和可逆结合特性制作而成，具有高度的选择专一性和良好的吸附净化性能。作为新型高效的前处理净化技术，免疫亲和净化技术正在不断的改进发展，但目前尚未有免疫亲和-液质联用检测技术应用于贝类中腹泻性贝类毒素同时检测的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法，基质干扰小、净化效果强、灵敏度高，适合贝类中腹泻性贝类毒素的分析测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种免疫亲和净化-液相色谱串联质谱测定贝类中腹泻性贝类毒素的方法，包括如下步骤：

(1)样品前处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL80％甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min，7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中；再往剩余残渣中加入10mL80％甲醇水溶液，重复提取一次，合并提取液；移取5mL合并的提取液至另一50mL离心管中，加入20mL PBS缓冲液进行稀释，待净化；

(2)免疫亲和柱净化：取出免疫亲和柱，待其恢复至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液，上样结束后，用6mL 20％甲醇水溶液淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用3mL含有2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用1mL初始流动相定容溶解，经0.22μm滤膜过滤后得净化液供液相色谱-质谱分析；

(3)液相色谱-质谱分析：净化液经液相色谱-串联质谱仪测定获得腹泻性贝类毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中腹泻性贝类毒素的含量。

本发明针对贝类中腹泻性贝类毒素的测定，开发了特定的样品前处理方法，并设计了免疫亲和柱净化参数、优化液相色谱-质谱分析参数。因此，本发明的方法基质干扰小、净化效果强、灵敏度高，适合贝类中腹泻性贝类毒素的分析测定

作为优选，步骤(1)中PBS缓冲液的配制方法为：分别称取二水合磷酸二氢钠2.18g，十二水合磷酸氢二钠12.90g，氯化钠8.50g，用水溶解并定容至1000mL。

作为优选，步骤(3)中色谱柱：ACQUITY^TM UPLC BEH C₁₈柱，规格：2.1mm×100mm，1.7μm；进样体积10μL；样品室温度4℃；柱温30℃；流速0.3mL/min；流动相A为2mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～3.0min，70％～25％A；3.0～3.5min，25％～70％A；3.5～5.0min，70％A。作为优选，步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源，负离子扫描；检测方式：多反应监测模式；毛细管电压：3.2kV；离子源温度：115℃；脱溶剂气温度：370℃；锥孔气流量：60L/h；脱溶剂气流量：700L/h；锥孔电压50V，分析物母离子803.3-817.3m/z，子离子255.0、113.0m/z。

作为优选，步骤(3)中标准曲线的制作方法为：配制浓度为1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L和100.0μg/L的标准工作溶液，以峰面积对应的浓度绘制标准曲线。

本发明的有益效果是：基质干扰小、净化效果强、灵敏度高，适合贝类中腹泻性贝类毒素的分析测定。

附图说明

图1是大田软海绵酸(Okadaic Acid，OA)及其衍生物鳍藻毒素(Dinophysistoxins，DTXs)的结构图。

图2是三种腹泻性贝类毒素的质谱图。

图3是不同洗脱梯度下的色谱图。

图4不同提取剂对分析物的提取率。

图5上样液中不同PBS体积比对回收率的影响。

图6洗脱液体积和pH对回收率的影响。

图7 5.0μg/kg加标贻贝样品经净化后的MRM图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

1材料与方法

1.1材料与试剂

实验所用贝类样品为养殖和海捕的贻贝、毛蚶、泥蚶、花蛤、文蛤、缢蛏、牡蛎、扇贝，并按标准规范要求处理的检测样品。

OA、DTX1、DTX2标准品加拿大海洋生物科学研究所；甲酸、乙酸铵(均为色谱纯)美国Sigma公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯)德国Merck公司；乙酸、氨水、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠、二水合磷酸二氢钠(均为分析纯)上海国药集团有限公司；实验用水均为Millipore-Q系统制备的超纯水。

1.2仪器与设备

ACQUITY^TM UPLC-Quattro Premier XE液相串联质谱仪(配有电喷雾离子源)美国Waters公司；SPE-24固相萃取装置美国supelco公司；N-EVAP-11634氮气吹干仪美国Organomation公司；MS3 Digital漩涡混合器德国IKA公司；超声波清洗器上海科导超声仪器有限公司；Centrifuge5810高速离心机德国Eppendorf公司；腹泻性贝毒免疫亲和柱(柱容量3mL)江苏美正生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

(1)2％氨水甲醇溶液：准确移取2mL氨水，用甲醇定容至100mL。

(2)磷酸盐缓冲液(PBS)：分别称取二水合磷酸二氢钠2.18g，十二水合磷酸氢二钠12.90g，氯化钠8.50g，用水溶解并定容至1000mL。

(3)1μg/mL贝毒混合标准溶液：准确移取适量的OA、DTX1、DTX2标准品溶液，用甲醇稀释定容至50mL，-12℃避光保存，保存期限为3个月；使用时逐级用甲醇稀释至100μg/L。

1.3.2样品前处理及免疫亲和柱净化

准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL80％甲醇水溶液，涡旋振荡2min，超声提取10min，7000r/min离心5min，将上清液移至另一50mL离心管中；再往剩余残渣中加入10mL 80％甲醇水溶液，重复提取一次，合并提取液。移取5mL合并的提取液至另一50mL离心管中，加入20ml PBS溶液进行稀释，待净化。

取出免疫亲和柱，待其恢复至室温后去掉亲和柱堵头，放出柱内保存液后，上样品液。上样结束后，用6mL 20％甲醇水溶液淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用3mL含有2％氨水的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于50℃氮气吹干，用1mL初始流动相(70％A，30％B)定容溶解，经0.22μm滤膜过滤后供液相色谱-质谱分析。

1.3.3高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY^TMUPLC BEH C₁₈柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；进样体积10μL；样品室温度4℃；柱温30℃；流速0.3mL/min；流动相A为2mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～3.0min，70％～25％A；3.0～3.5min，25％～70％A；3.5～5.0min，70％A。

1.3.4质谱条件

电喷雾离子源，负离子扫描(Electrospray ionization，ESI^-)；检测方式：多反应监测模式(Multiple Reaction Monitor，MRM)；毛细管电压：3.2kV；离子源温度：115℃；脱溶剂气温度：370℃；锥孔气流量：60L/h；脱溶剂气流量：700L/h；锥孔电压、碰撞能量、分析物母离子及子离子等质谱多反应监测实验条件如表1所示。

表1分析物的质谱多反应监测实验条件

“^*”为定量离子(Quantitative ion)。

2结果与分析

2.1质谱和色谱条件优化

分别在电喷雾正负离子扫描模式下采用蠕动泵5μL/min流动注射OA、DTX1和DTX2标准溶液，发现3种分析物在负离子模式下的响应值高，质谱信号强。因此选择负离子模式对分析物的质谱参数进行优化。经过一级质谱扫描分析，发现3种分析物各对应的分子离子峰[M-H]-丰度最高，故确定OA、DTX1、DTX2的母离子依次为m/z 803.3、m/z 817.3和m/z 803.3。通过二级碰撞诱导分析收集分析物子离子信息，选取丰度最强的两个离子碎片峰作为分析物的子离子，并对碰撞电压等参数进一步优化，各分析物的离子碎片信息如图2所示。

由于OA与DTX2是同分异构体，且在质谱上的离子特征信息相似，无法在质谱维度上精确鉴别区分，因此需选择优化合适的液相条件，使这两种分析物在色谱上实现有效分离。实验选择ACQUITY^TM UPLC BEH C₁₈系列色谱柱，考虑到同分异构体的结构相似性，需增强色谱差速迁移的效果，故选择100mm规格的C₁₈柱作为实验色谱柱。实验以2mmol/L乙酸铵溶液为水相，乙腈为有机相，通过调节有机相的比例(由高到低)，考察不同流动相梯度下的色谱分离效果，比较结果如图3所示。由图3可知，随着有机相比例的降低，OA和DTX2能得到有效的分离，但保留时间会推迟，延长了分析时间；且高比例的水相增加色谱峰宽，影响色谱峰形，不利于定量分析。最终选择在0～3.0min时间段，乙腈比例由30％到75％，不仅能有效分离OA、DTX2和DTX1，又能保证色谱峰形尖锐对称。

2.2提取剂的选择

实验分别选取甲醇、80％甲醇、乙酸乙酯和作为提取剂，提取添加水平为20μg/kg的贻贝样品，通过测定比较不同提取剂中分析物的浓度，筛选出合适的提取剂，实验结果如图4所示。由图4可知，乙酸乙酯的提取效率低；乙腈对OA、DTX1提取效率较高，但对DTX2的提取效率较低；80％甲醇和甲醇的提取率相近，但少量的水能使样品基质分散，提高提取效率，且能减少杂质量，因此选择80％甲醇作为提取剂。

2.3免疫亲和柱优化

贝类除了含有脂肪、蛋白质、色素等杂质外，通常还含有分泌粘液，导致液液萃取过程中经常出现乳化的现象；固相萃取虽能去除杂质，但同时也吸附一部分目标物，造成回收率低的状况。本实验采用具有选择专一性的免疫亲和柱作为净化手段，由于是初次应用于贝类毒素检测领域，需对免疫亲和柱进行优化，以使其吸附净化能力最大化。

2.3.1上样液的选择

免疫亲和作用通常受温度、pH和溶液体系等因素影响，为保证免疫亲和柱的高效性和专一性，需筛选出合适的条件。实验在测试免疫亲和柱性能阶段，发现免疫亲和柱必须要回到室温(通常20～25℃)，才能性能最大化，同时降低差异性，提高平行性。磷酸盐缓冲溶液(PBS)具有盐平衡、适宜pH缓冲作用，能有效保证生物活性物质的结构和特性，是良好的溶解保护试剂。因此实验选择PBS溶液稀释样品提取液，不仅能提供适宜的pH，同时又能有效保证抗体的活性。实验设计不同体积的PBS与添加水平为10μg/kg样品提取液混合，通过比较不同体积比下腹泻性贝毒的回收率，选择适合免疫亲和作用的最佳溶液体系，结果如图5。由图5可知，当PBS体积占比达到80％时，回收率达到峰值并趋于稳定；且考虑到过多的稀释体积增大了实验误差，因此选择PBS以4∶1的体积比稀释提取液，作为免疫亲和柱的上样液。

2.3.2淋洗液的选择

实验根据上样液的溶剂体系，并用纯水替代PBS溶液，选择20％甲醇水溶液作为淋洗液，不仅能去除柱床内的盐，且能淋洗一部分脂溶性杂质，降低样品基质带来的干扰，有利于分析物洗脱。由于层析柱淋洗通常需要2个柱体积，实验最终采用6mL20％甲醇水溶液淋洗免疫亲和柱。

2.3.3洗脱液的选择

分析物在柱床内免疫结合后，需要改变抗原抗体的反应平衡，通常优先选择改变洗脱液的酸碱度，达到收集抗体基质上抗原的目的。实验以甲醇为基准洗脱液，通过添加不同体积的乙酸和氨水，调节洗脱液的pH；同时采用不同洗脱体积进行洗脱收集，并以回收率为指标，筛选出合适的pH和洗脱体积，结果如图6所示。由图6可知，2％氨水甲醇回收率最好，且洗脱体积在2mL时达到峰值，但出于对实际样品浓度的考虑，最终选择3mL2％氨水甲醇作为洗脱液。免疫亲和柱净化后，目标峰对称尖锐，且目标峰附近无杂峰，响应强度高，如图7所示。

2.4线性关系和定量限

在已优化的实验条件下，用初始流动相稀释DSP标准溶液配制浓度为1.0、5.0、10、20、50和100μg/L标准工作溶液，以峰面积对应的浓度绘制标准曲线。结果表明，3种分析物在1.0～100μg/L浓度范围内线性相关系数均大于0.996，满足仪器分析的需要；方法的理论检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算，最终确定3种分析物的检出限和定量限均为0.3μg/kg和1.0μg/kg。

3.5回收率及精密度

以2.00g阴性的贻贝样品为空白基质，添加水平为1.50、5.00、20.0μg/kg的DSP标准溶液，每个添加浓度分别测定6次，计算各分析物对应的回收率和精密度，实验结果见表2。由2可知，3种分析物的平均回收率为82.7％～94.3％；相对标准偏差为0.70％～7.61％。

表2 DSP的平均回收率和相对标准偏差(n＝6)

2.6样品分析

为考察方法的适用性和实用性，采用本方法对养殖和海捕贻贝、毛蚶、泥蚶、花蛤、文蛤、缢蛏、牡蛎、扇贝8个品种共计60份贝类进行分析检测。其中仅有1个赤潮期的贻贝样品有检出，其余均为检出，验证了腹泻性贝类毒素多产生爆发于赤潮期，而常规期间的贝类相对安全。分析结果表明，本方法回收率高，精密度和灵敏度均能满足腹泻性贝类毒素的检测需要。

3结论

本研究利用免疫亲和富集解离技术，使具有反应原性的被测物与抗体特异性结合，将分析物富集到固相载体上，通过色谱差速迁移技术和抗原抗体的可逆结合特性祛除非目标分析物，实现抗原抗体复合物的可逆解离，从而保证贝类样品的高效基质净化。实验同时结合超高效液相-串联质谱仪的强分离性和高灵敏度，提高了样品回收率，极大降低检出限和定量限，使之达到0.3μg/kg和1.0μg/kg，实现贝类中腹泻性贝毒的痕量分析。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。