本发明涉及生物试剂，具体涉及检测试剂盒，尤其涉及一种灵敏度高、特异性强的胶乳免疫比浊法测定人体血清甲氨蝶呤含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)是一种叶酸还原酶抑制剂，为抗叶酸类抗肿瘤药物，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制作用阻碍肿瘤细胞dna的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖。其抗肿瘤机理是：甲氨蝶呤与叶酸结构即为相似，都属于蝶啶衍生物，故mtx能够结合到二氢叶酸还原酶的活性位置上，阻断四氢叶酸的形成。其选择性地作用于s期(dna合成期)，属于细胞周期特异性药物。临床上在急性白血病(尤其是急性淋巴细胞性白血病)、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎等方面的治疗效果较好。对头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌及盆腔肿瘤均有一定疗效，也可与其他药物联合治疗burkitts淋巴瘤，晚期淋巴肉瘤(ⅲ和ⅳ期，peter氏阶段系统)和晚期蕈样真菌病。
因甲氨蝶呤安全范围窄，服药后人体代谢和排泄的个体化差异大，低于其有效血药浓度则无法抑制肿瘤生长，高于其有效血药浓度会引起胃肠道反应、肝硬化、肾脏损害等副作用。该药的细胞毒性较大，不良反应较多，应密切监测患者血药浓度，做到个体化给药。因此，对服用甲氨蝶呤的患者进行血药浓度监测，减少不良反应及指导临床个体化安全用药具有重要意义。
目前，测定甲氨蝶呤的方法主要有高效液相色谱法(hplc)、荧光偏振免疫分析法(fpia)等。hplc法操作繁琐，主要用于实验室分析，fpia法需要配备昂贵的专用仪器，成本较高。因而，这些方法在临床应用上都具有一定的局限性。虽然已有可应用于生化分析仪的甲氨蝶呤测定试剂盒上市，但远不能满足临床需求。目前市场上仍缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的甲氨蝶呤检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的甲氨蝶呤测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
本发明的甲氨蝶呤胶乳免疫比浊测定试剂可以实现在全自动生化分析仪上对甲氨蝶呤的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低甲氨蝶呤检测成本，有利于临床推广使用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种在全自动生化分析仪上对甲氨蝶呤的快速、灵敏、准确检测的测定试剂及其制备方法。
本发明提供了一种甲氨蝶呤胶乳免疫比浊测定试剂盒。
本发明试剂盒由试剂r1和试剂r2组成。
所述试剂r1和试剂r2的体积比为1:1。
本发明试剂盒所述试剂r1由下列重量百分配比的组分组成：
0.01％～4％的乳化剂、0.01％～4％的甲氨蝶呤共轭物、0.1％～2％氯化钠、0.05％～2％的增敏剂、0.02％的防腐剂、88.00％～99.80％的30～100mmol/l缓冲液。
所述试剂r1为与抗甲氨蝶呤特异性抗体结合的共轭竞争反应液。
所述试剂r1所述乳化剂选自吐温20、吐温80或聚乙二醇辛基苯基醚。
所述增敏剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇20000，优选为聚乙二醇20000。增敏剂主要作用于抗体抗原的反应速率。
所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(pbs)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris)、3-(n-吗啉基)丙磺酸缓冲液(mops)、2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲液(mes)、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液ph值为6～9。
本发明试剂盒所述试剂r2由下列百分配比的组分组成：
0.1％～0.5％结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒、0.1％～1.0％(w/w)牛血清白蛋白、0.02％～2％(w/w)吐温20、0.02％～2％(w/w)稳定剂2、0.02％～2％(w/w)蛋白保护剂2、0.02％(w/w)防腐剂、92.50％～97.70％的20～50mmol/l缓冲液。
所述结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒为：选择不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳微粒与抗甲氨蝶呤抗体形成的复合物；所述不同粒径的纳米胶乳微粒的直径为50～300nm。
所述的抗甲氨蝶呤抗体选自兔抗多克隆抗体、羊抗克隆抗体或鼠抗单克隆抗体。
所述试剂r2的稳定剂和蛋白保护剂，可以提高试剂的稳定性。
所述稳定剂为聚氧乙烯树脂类,选自聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯或月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠盐，蛋白保护剂为海藻糖。
所述试剂r2的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、2-吗啉乙横酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液ph值为6～9。
所述试剂r2的防腐剂选自叠氮化钠、n-甲基-异噻唑酮、n'-亚甲基-双[n'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或proclin300中的一种或多种。其中proclin300为商品名，proclin300为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合溶液。
本发明的原理为：本发明使用r2中的结合有抗体的胶乳微粒偶联物，与r1中的甲氨蝶呤共轭物发生免疫反应后形成聚集，改变体系的浊度，而样本中甲氨蝶呤与r1中的共轭物特异性地竞争r2中的结合有抗体的胶乳微粒偶联物，降低浊度的变化。在一定的波长下，通过测定反应前后浊度的变化，即可测出样本中甲氨蝶呤的含量。
本发明的另一目的是提供了所述测定人体血清甲氨蝶呤含量的试剂盒的制备方法。
该方法包括下列步骤：
ⅰ、制备试剂r1：取1l水，然后依次加入氯化钠、增敏剂、乳化剂、甲氨蝶呤共轭物、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节ph值至6.0～9.0，优选7.4，然后过0.22μm滤膜得到试剂r1；
所述甲氨蝶呤共轭物是用于检测中与甲氨蝶呤竞争抗甲氨蝶呤抗体的共轭物。
试剂r1所述甲氨蝶呤共轭物通过甲氨蝶呤与壳聚糖反应制备，包括下列步骤：
(1)在50mmol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)缓冲液中，1.0g甲氨蝶呤(mtx)与50mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)在偶联剂30mg1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)作用下，室温(20-25℃)下反应30分钟，形成mtx-nhs活化中间脂；
(2)加入5.0g壳聚糖，即按1：10质量比(mtx：壳聚糖)，在室温(20-25℃)下反应2小时，缩合反应形成甲氨蝶呤-壳聚糖的偶联物；
(3)mtx-nhs活化中间脂的灭活，直接加入0.5ml乙醇胺对中间脂体进行灭活，室温反应30分钟；
(4)灭活后的反应液于透析袋中，在20mmol/l的磷酸盐缓冲液中，2-8℃透析12小时，冷冻干燥得到甲氨蝶呤-壳聚糖偶联物的纯品，即为甲氨蝶呤共轭物。
ⅱ、制备试剂r2：
试剂r2甲氨蝶呤特异性抗体通过甲氨蝶呤免疫原免疫动物制备，包括下列步骤：
(1)合成甲氨蝶呤免疫原：使甲氨蝶呤末端的羧基与载体蛋白上的氨基连接，载体为具有免疫原性的蛋白质，优选为血蓝蛋白(klh)、血清蛋白(bsa)或者甲状腺球蛋白；
(2)制备r2所用的抗体原料：用甲氨蝶呤免疫原免疫动物，制备并纯化抗甲氨蝶呤特异性抗体；单克隆抗体用体细胞杂交技术来制备。
试剂r2的制备步骤如下：
(1)聚苯乙烯胶乳微粒的活化：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳微粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(edac)，混合均匀后室温(20℃-25℃)活化30min；
(2)抗甲氨蝶呤抗体与聚苯乙烯胶乳微粒的偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微粒和抗甲氨蝶呤抗体混合后，于室温(20℃-25℃)反应2h进行共价偶联；
(3)结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒复合物的洗涤：将结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒的反应液于切向流过滤系统中进行过滤洗涤，除去游离抗体、小分子杂质；所述洗涤液为50～100mm缓冲液(ph7.0～8.0)，得到洗涤后的结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒；
(4)结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒的封闭与保存：将步骤(5)得到的洗涤后的结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒中加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯和海藻糖，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后得到初反应液；
(6)使用缓冲液对上述的初反应液稀释3-6倍得到最终试剂r2；
ⅲ、组成试剂盒：将上述制备的试剂r1和试剂r2按体积比r1：r2＝1:1分装入瓶组成试剂盒。
本发明的有益效果：
(1)本发明试剂盒的甲氨蝶呤免疫原特异性强，制备的抗甲氨蝶呤特异性抗体特异性强，并与常见的40种药物无交叉反应。
(2)本发明所使用的聚苯乙烯胶乳微粒与抗体偶联复合物，可以大幅度地提高甲氨蝶呤测定试剂的分析灵敏度。同时，本发明试剂对抗体的使用方法不局限于单一抗体，同样适用于多种抗体混合使用的方法，涉及鼠抗甲氨蝶呤单克隆抗体、兔抗甲氨蝶呤多克隆抗体、羊抗甲氨蝶呤多克隆抗体等。
(3)本发明的甲氨蝶呤共轭物，水溶性好且灵敏度高；与偶联抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒的反应灵敏度高，共轭竞争反应的机理可以准确、灵敏地测定血清中甲氨蝶呤的含量。
本发明试剂盒灵敏度高、特异性强和稳定性好，有较好的临床应用前景。本发明试剂盒制备简单，宜于工业化生产，有较大的应用价值。
附图说明
图1为实施例4制备的试剂在日立7100型全自动生化分析仪上的校准曲线，x轴为甲氨蝶呤浓度，y轴为吸光度变化值。
图2为实施例4制备的试剂与德灵试剂在日立7100型全自动生化分析仪上进行的样本比对相关性结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不仅仅局限于以下实施例。
实施例使用原料通过市售得到。
实施例1
klh-甲氨蝶呤免疫原的合成
klh-甲氨蝶呤免疫原，为试剂r2中抗体原料的制备过程中的所用抗原，由血蓝蛋白(klh)与甲氨蝶呤的末端羧基连接而成，该免疫原的具体合成步骤如下：
(1)称取2.13g2-(n-吗啡啉)乙磺酸、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁，溶解于1l去离子水中，调节ph至6.1，制成缓冲溶液a；
(2)称取3mgklh，室温下溶解于3ml上述缓冲溶液a中，制成klh溶液；
(3)称取3mg甲氨蝶呤，溶解于300ul上述缓冲溶液a中，制成甲氨蝶呤溶液；
(4)甲氨蝶呤溶液中加入5mgnhs和1mgedc·hcl，反应30分钟后，将上述klh溶液滴加入甲氨蝶呤溶液中，然后将此混合溶液在2-8℃下搅拌2小时，加入2ml乙醇胺封闭后得到混合溶液；
(5)将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液a进行透析，透析后所得溶液即为甲氨蝶呤免疫原溶液，在甲氨蝶呤免疫原溶液中加入0.1％的nan3，于-20℃下储存。0.1％的nan3是指加入量占最终所得的免疫原溶液的质量百分比，具体的加入量根据透析后所得的免疫原溶液的具体质量而定。
实施例2
抗甲氨蝶呤特异性抗体的制备
抗甲氨蝶呤特异性抗体，为试剂r2中所用的特异性抗体。将上述制得的klh-甲氨蝶呤免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
(1)用pbs将上述合成的klh-甲氨蝶呤免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
(2)3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
(3)对上述实验动物兔取血，分离纯化得到效价为1∶30000-1∶50000的抗甲氨蝶呤特异性抗体。
实施例3
甲氨蝶呤共轭物的制备
(1)称取2.13g2-(n-吗啡啉)乙磺酸、8.5g氯化钠，溶解于1l去离子水中，调节ph至6.1，制成缓冲溶液a
(2)1.0g甲氨蝶呤(mtx)溶于缓冲溶液a中，加入50mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和偶联剂30mg1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)，反应30分钟后形成mtx-nhs活化中间脂；
(2)上述溶液中加入50mg壳聚糖，于室温下反应2小时，甲氨蝶呤与壳聚糖缩合反应形成甲氨蝶呤-壳聚糖的偶联物；
(3)加入0.5ml乙醇胺对中间脂体进行灭活；
(4)反应液于透析袋中透析，在20mmol/l的磷酸盐缓冲液中，2-8℃透析12小时，冷冻干燥，得到甲氨蝶呤-壳聚糖偶联物的纯品，即为甲氨蝶呤共轭物。
实施例4
本发明测定人体血清甲氨蝶呤含量的试剂盒制备
试剂r1的制备：取995g水，然后依次加入2.4g磷酸二氢钠、11.4g磷酸氢二钠、10.0g聚乙二醇20000、50mg甲氨蝶呤共轭物(实施例3制得)、9.0gnacl、0.5g吐温20、5.0g牛血清白蛋白(w/w)和0.2gproclin300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节ph至7.4；用0.22μm滤膜过滤，制成1l的试剂r1。
试剂r2的制备：50mmol/l的mops缓冲液中含0.3％结合有甲氨蝶呤抗体的聚苯乙烯胶乳微粒(w/w)、1％nacl(w/w)、0.05％吐温20(w/w)、1％bsa(w/w)、0.02％proclin300(w/w)。具体步骤如下：
1.分别取4.5ml(100mg/ml)胶乳(直径为200nm)，各用0.1m(mol/l)，ph6.5的mes溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次(每次4.5ml)，分散；
2.加入0.3ml用0.1m，ph6.5的mes溶液新鲜配制的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(edac)(20mg/ml)混合完全，室温(20～24℃)混合30min；
3.用50mm，ph7.0的磷酸缓冲溶液洗涤1次后稀释10倍，得到45ml胶乳溶液备用；
4.取4.5ml兔抗甲氨蝶呤多克隆抗体(8mg/ml)加入到步骤3中已活化的60nm胶乳溶液中；另取1.5ml兔抗甲氨蝶呤多克隆抗体(8mg/ml)加入到步骤3中已活化的200nm胶乳溶液中；分别于室温(25-30℃)反应2h进行共价偶联。
5.将步骤4得到的两种不同粒径的反应液于切向流过滤系统(krosflominikrospiloti(kpmi))中进行过滤洗涤，切向流过滤柱中的滤膜为中空纤维膜(孔径500kd)，洗涤液为50mm，ph7.4的mops缓冲液，除去游离抗体、小分子杂质，以滤过4-6倍的步骤4中制备的反应液质量的洗涤液量为洗涤终点，得到洗涤后的结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒；
5.加入0.9ml10％的聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯和0.45ml10％海藻糖溶液进行封闭，室温25℃-30℃封闭1h；
6.用保存液(1.0％bsa、0.05％吐温20、0.05％海藻糖、0.02％proclin300的50mm，ph7.4mops缓冲液)对步骤5制备得到稀释至胶乳终浓度为0.3％，即为200nm粒径的试剂r2。
校准品的制备：取1l水，然后依次加入缓冲剂、氯化钠、乙二胺四乙酸钠(edta)、牛血清白蛋白(bsa)、甲氨蝶呤、叠氮钠，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节ph值至7.0～8.0，优选7.4，然后过0.22μm滤膜得到校准品溶液。使用市售的德灵试剂盒对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将上述制备的r1试剂、r2试剂按体积比r1：r2＝1:1分装入瓶组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：r1(2×45ml/每瓶)，r2(2×45ml/每瓶)。
实施例5
本发明测定人体血清甲氨蝶呤含量的试剂盒制备
试剂r1的制备：取995g水，然后依次加入2.4g磷酸二氢钠、11.4g磷酸氢二钠、15.0g聚乙二醇20000、50mg甲氨蝶呤共轭物、9.0gnacl、0.8g吐温20、5.0g牛血清白蛋白(w/w)和0.2gproclin300，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节ph至7.2；用0.22μm滤膜过滤，制成1l的试剂r1。
试剂r2的制备：50mmol/l的mops缓冲液中含0.3％结合有甲氨蝶呤抗体的聚苯乙烯胶乳微粒(w/w)、1％nacl(w/w)、0.05％吐温20(w/w)、1％bsa(w/w)、0.02％proclin300(w/w)。其中，小粒径的胶乳微粒偶联鼠抗甲氨蝶呤单克隆抗体，大粒径的胶乳微粒偶联兔抗甲氨蝶呤多克隆抗体。具体步骤如下：
1.取6.0ml(100mg/ml)胶乳(直径为250nm)，用0.1m(mol/l)，ph6.5的mes溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，分散；
2.加入0.4ml用0.1m，ph6.5的mes溶液新鲜配制的edac(20mg/ml)混合完全，室温(20～24℃)混合30min；
3.用50mm，ph7.0的pbs溶液洗涤1次后稀释10倍，得到60ml胶乳溶液备用；
4.取1.0ml鼠抗甲氨蝶呤单克隆抗体(10mg/ml)加入到步骤3中已活化的60nm胶乳溶液中，室温反应2h；
5.将步骤4得到的反应液于切向流过滤系统(krosflominikrospiloti(kpmi))中进行过滤洗涤，切向流过滤柱中的滤膜为中空纤维膜(孔径500kd)，洗涤液为50mm，ph7.4的mops缓冲液，除去游离抗体、小分子杂质，以滤过4-6倍的步骤4中制备的反应液质量的洗涤液量为洗涤终点，得到洗涤后的结合有抗甲氨蝶呤抗体的胶乳微粒；
5.加入1.2ml10％的聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯和0.60ml10％海藻糖溶液进行封闭，室温封闭1h；
6.用保存液(含1.0％bsa、0.05％吐温20、0.05％海藻糖、0.02％proclin300的50mm，ph7.4mops缓冲液)将上述封闭后的反应液稀释至胶乳终浓度为0.3％，即制得200ml的250nm试剂r2。
校准品的制备：取1l水，然后依次加入缓冲剂、氯化钠、乙二胺四乙酸钠(edta)、牛血清白蛋白(bsa)、甲氨蝶呤、叠氮钠，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节ph值至7.0～8.0，优选7.4，然后过0.22μm滤膜得到校准品溶液。使用市售的德灵测定试剂盒对校准品进行赋值。
组成试剂盒：将上述制备的r1试剂、r2试剂，按体积比r1：r2＝1:1组成试剂盒，试剂盒的包装规格为：r1(2×45ml/每瓶)，r2(2×45ml/每瓶)。
实施例6
本发明测定甲氨蝶呤的试剂盒(实施例4制得)的相关性分析分析方法：两点终点法。取试剂r1150ul，加入样本20ul，于37℃5min后加入试剂r2150ul，开始读，反应5min，再次读点，得到吸光度差值(△a)。
计算方法：多点定标，根据吸光度与参考血清的值做出校准曲线，以标准曲线为计算模式，样本含量可根据其吸光度在曲线上计算得出。
线性范围：0.02-10.00umol/l
检测仪器：日立7100型全自动生化分析仪。
检测波长：600nm。
实施例4试剂与德灵诊断产品(上海)有限公司的甲氨蝶呤试剂盒的临床试验结果比较：
实施例4试剂与德灵试剂分别定标之后，本实施例4的试剂定标曲线如图1，检测50例不同浓度的临床样本，检测结果如表1所示：
表1
根据上面测定结果，本试剂与德灵甲氨蝶呤测定试剂盒的临床相关性良好，没有显著差异。
实施例7
药物干扰试验
取体检正常的健康人血液样本(无明显溶血、黄疸、乳糜)制成混合血清(样本来源于上海复旦大学附属中山医院)，精密称取40种常见药物，溶于上述的类似人血清基质的溶液中，制成40组100umol/l的干扰物溶液。分别精密量取高浓度干扰物溶液与混合正常血清，制成40组不同干扰物的混合血清样本(干扰物浓度为10.0umol/l)，每个样本重复测定3次，取其平均值。常见干扰药物及测定结果
表2
测定结果：上述40种常见药物等价于甲氨蝶呤的浓度均小于0.1umol/l，可见，本发明的抗体是抗甲氨蝶呤的特异性抗体。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明内容及附图内容所做的直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。