一种酶型时间温度指示体系的制作方法

本发明涉及一种酶型时间温度指示体系，属于食品技术领域。

背景技术：

食品在流通过程中经历了原材料采集、加工、物流、储藏、货架出售等阶段。在这些过程中，食品所处的温度、湿度等均可以对其品质造成影响。其中，对于易腐败食品，对其温度的监控尤其重要。这是因为，温度在食品流通过程中较难控制，如果温度高于设定温度一定时间，则容易造成易腐败食品变质，而传统食品包装上的有效期此时已经失去了其指示食品有效货架期的作用，不能对售卖者或消费者进行警示，从而容易引起食品安全问题，对消费者的生命安全造成隐患。

为了严格、有效监控食品在流通过程中温度变化的过程，时间温度指示器(TTI)应运而生。其可以对食品所处外界环境中的温度给出连续性的响应，并且，此响应是不可逆的。时间温度指示器是智能包装的一种，它可以方便消费者准确识别食品的安全性，有效完成冷链温度的实时监控，避免食品出现不必要的浪费，提高食品在流通过程中各环节的可追溯性。目前，TTI的类型主要有扩散型、化学型、微生物型、电子型和酶型TTI等。其中，酶型TTI是指反应物(如脂类底物等)通过酶促反应产生的反应产物会导致指示剂发生颜色变化，从而在食品流通过程中可以监控时间温度变化历程的TTI。温度越高，反应速率越快，产生的颜色变化越明显。

我国关于酶型TTI的研究较多，主要是因为它们的原理类似，采用不同的酶和底物就可以制备出一系列不同颜色变化的TTI。2009年，宁鹏[1]等人利用碱性脂肪酶与三乙酸甘油酯的水解反应，以酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液作为指示剂，通过反应体系颜色变化反映时间-温度的累积变化。田秋实等[2]研究了一种基于蛋白酶反应为基础的酶变型TTI，通过溶液pH的改变导致颜色发生明显变化，应用于监测淡水鱼糜制品在不同冷藏温度条件下的品质变化和货架期预测。2013年，郑光临[3]等人通过糖化酶对麦芽糊精的酶促反应，以碘液为指示剂，研发了一种适用于冷鲜肉等产品的TTI。2014年，冯钦[4]等人研究了淀粉酶型TTI及酶经固定化后的体系稳定性，确定了体系配方及最佳酶固定化条件。

在实际应用中，上述酶型时间温度指示器会存在以下问题：(1)绝大多数酶型时间温度指示器都需要加入额外指示剂，一是以体系中酶催化反应导致pH值降低为基础，再加入pH指示器产生颜色变化，如2009年，宁鹏[1]等人利用碱性脂肪酶与三乙酸甘油酯的水解反应导致体系pH值降低，以酚红-酚酞-百里酚酞混合溶液作为指示剂，通过反应体系颜色变化反映时间-温度的累积变化。2005年，浙江大学吴秋明[5]研制出一种脲酶型TTI，反应体系由磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、苯酚红指示剂及尿素底物组成。随着PH值的升高，该TTI能够呈现出从初始黄色到终点红色的变色过程。上述两种典型时间温度指示器体系都是加入了pH指示剂。另外一部分是以碘液为指示剂，根据底物与碘液产生颜色变化来指示，如2013年，郑光临[2]等人通过糖化酶对麦芽糊精的酶促反应，以碘液为指示剂，研发了一种适用于冷鲜肉等产品的TTI。他们的共同点均是加入指示剂导致体系更复杂，增加。且一些指示剂有毒性，不安全不适合运用在食品指示器中(2)由于均为单酶催化体系，反应的稳定性较差，体系颜色变化不明显；如2013年，葛蕾[6]基于酶促褐变原理的时间温度指示系统研究，以酪氨酸酶的酶促褐变为基础开发一种新型的时间温度指示系统。体系由无色变成褐色的过程可以指示时间温度的积累。由单酶催化底物产生颜色变化，体系简单，但是颜色变化不明显。如附图1整个过程颜色变化不明显。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种酶型时间温度指示器体系。本发明通过产生颜色变化，达到指示冷鲜食品经历的时间-温度的目的。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种酶型时间温度指示器体系，所述酶型时间温度指示器体系由两种酶和两种底物两部分组成；

(1)所述的两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度分别为1～5μg/ml和0.05～0.2μg/ml，两种酶按照1:1～5:1的体积比加入体系中；

(2)所述的两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)，两种底物的浓度分别为0.1～0.4mg/ml以及0.05～0.2mg/ml，两种底物按照2:1～8:1的体积比加入体系中；

(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖(GLU)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOX)；

(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。

在上述方案中优选的是，在所述两种酶和所述两种底物加入体系反应之前，所有配制出的溶液保存温度均低于其反应温度。

在上述任一方案中优选的是，步骤(1)所述两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度范围分别为3.5μg/ml和0.15μg/ml，两种酶按照2:1的体积比加入体系中。

在上述任一方案中优选的是，步骤(2)所述两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，两者加入的浓度分别为0.3mg/ml和0.15mg/ml，两种底物按照5:1的体积比加入体系中。

在上述任一方案中优选的是，反应的温度为0～40℃。

在上述任一方案中优选的是，反应的温度为0℃、4℃、20℃、30℃或40℃。

在上述任一方案中优选的是，所有配制出的溶液保存0℃以下。

在上述任一方案中优选的是，葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺的体积关系是(1:1～5:1):(2:1～8:1)。

本发明利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生葡萄糖酸和H₂O₂，然后在HRP的催化作用下，生成的H₂O₂氧化生成TMB生成一种有色的偶氮类化合物。从而产生颜色变化，达到指示冷鲜食品经历的时间-温度历史的目的。

根据步骤(1)，确定了最佳酶浓度和双酶量的体积比，调整酶的浓度及两个酶的加入量后测体系吸光度，根据吸光度反映出酶活，进而控制反应的速度以及颜色变化快慢，优化可以呈现出一组最佳颜色的体系。

根据步骤(2)，确定了最佳的底物浓度，调整底物的浓度可以控制反应的速度，同时随着底物量的增加，颜色越深越持久，所以可以通过底物量的调整，控制反应的速度和颜色的持久度。(参考实施例中的图4：由图可知，反应相同时间，在一定范围内，底物TMB浓度越大，颜色越持久)

根据步骤(3)，先加入两个底物，然后加入氧化酶辣根过氧化物酶，最后再加入葡萄糖，因为在没有葡萄糖氧化酶的条件下，体系中不会产生H2O2,即也不会进行第二步反应，整个体系不反应，最后加入葡萄糖氧化酶后体系才开始反应，保证了实验得精确性和严谨性。

现有技术常使用碱性脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等作为单一酶催化剂，碘液和pH指示剂作为颜色变化指示剂。与现有技术相比，本发明使用辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶共同作为酶催化剂，以有效指示时间温度变化历程。首先，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，被溶解氧氧化，生成葡萄糖酸和H₂O₂。随着反应的进行，生成的H₂O₂与另一底物TMB，在HRP的催化作用下，最终生成一种有色的偶氮类化合物，通过颜色变化程度，分析实验所处的温度变化历程。与现有技术相比，本发明的其中一种底物H₂O₂用量通过第一步反应控制，逐步生成，避免了初始浓度过大，反应速率太快，颜色变化太快，不能有效显示反应颜色变化过程的缺陷。同时，只需要调整其中一个酶的量或者一个底物的量，便可控制反应的快慢，进而可以控制颜色的变化速度。

本发明的有益效果：本发明的多酶催化体系用于时间温度指示器。辣根过氧化物酶的底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)的确定：TMB是HRP最敏感的呈色剂，一种新型安全的色原试剂，常用作ELISA等免疫检测的显色剂，具有检测灵敏度高，稳定性好等优点，而且使用安全。体系中颜色变化最明显，最适宜控制的双酶和双底物的浓度体积参数的确定。

在本发明的时间-温度指示器体系中，在不同温度条件下酶和底物共同作用就可产生肉眼明显可见的颜色变化(无-淡蓝-绿-棕红-黄)，酶催化反应受温度的影响，在一定的温度范围内，随着温度的升高，反应速率加快，因此在反应的过程中颜色变化程度较大。同时，反应的速度还受酶量和底物量的影响，在一定温度条件下，在一定酶和底物量变化范围内，反应速率随着酶和底物量的增加而增加，因此，反应体系的颜色变化也就越大。且酶催化体系颜色变化不可逆，成本较低。其中的色原性显色底物TMB显色灵敏，安全稳定无毒。完全符合时间温度指示器要求，可以代替传统的食品包装袋上保质期的不智能标签。

本发明的其中一种底物葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下，产生中间产物H2O2，而H2O2作为第二步反应的底物，其用量即可以通过第一步反应来实现控制，逐步生成，进而通过调整反应中葡萄糖氧化酶的用量，来实现反应进度的控制，来呈现出不同颜色变化。避免了初始浓度过大，反应速率太快，颜色变化太快，不能有效显示反应颜色变化过程的缺陷。同时，也只需要调整其中一个酶的量或者一个底物的量，便可控制反应的快慢，进而可以控制颜色的变化速度。

本发明用双酶和双底物体系来呈现出明显的肉眼可见的颜色，不需要添加额外的颜色指示剂，如淀粉指示剂，价格昂贵的碘。如其他利用体系pH值降低来指示颜色的，需要添加额外的pH指示剂。本发明无其他指示剂的加入，减少污染，同时使操作更简便的同时减低成本的。

本发明在反应的过程中，随着反应的进行，可以呈现出蓝色，绿色，棕色，红色，黄色的过程。阶段性变化较明显，便于肉眼可见。

附图说明

图1是现有技术中食品指示器的颜色变化图；

图2是本发明一种酶型时间温度指示器体系的一优选实施例中不同温度下体系颜色变化过程；

图3是本发明一种酶型时间温度指示器体系的一优选实施例中不同温度下不同时间体系反应过程中吸光度值A变化曲线；

图4是图3所示实施例中不同底物量反应40min后体系颜色对比(上图为TMB浓度低，下图为TMB浓度高)；

图5是实施例2中不同时间25℃温度条件下体系吸光度变化曲线(5min、15min、30min、45min、24h)；

图6是实施例2中不同时间25℃温度条件下体系颜色变化(5min、15min、30min、45min、24h)；

图7是实施例3中不同时间5℃温度条件下体系吸光度变化曲线((10min、20min、30min、40min、50min、60min)；

图8是实施例3中不同时间5℃温度条件下体系吸光度颜色变化((10min、20min、30min、40min、50min、60min)。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种酶型时间温度指示器体系,所述酶型时间温度指示器体系由两种酶和两种底物两部分组成；

(1)所述两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度分别为3.5μg/ml和0.15μg/ml；

(2)所述两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，两者加入的浓度分别为0.3mg/ml和0.15mg/ml；

(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖2000μl、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺400μl、辣根过氧化物酶250μl和葡萄糖氧化酶500μl；

(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。

实用性测试：将实施例1得到的时间温度指示器置于不同温度梯度下每隔一段时间观察体系在不同温度下颜色变化(颜色深浅及颜色变化快慢)并测试体系吸光度值A。

图2为该时间-温度指示器反应体系在同一时间不同温度下颜色的变化情况，由图可以看出，同一时间，不同温度条件下，体系有明显的颜色变化，且肉眼明显可见，温度从左到右依次为0℃、4℃、20℃、30℃、40℃，呈现出淡蓝色，绿色，红棕色，红色，黄色的变化过程。

图3为该时间-温度指示器反应体系在不同时间不同温度下吸光度值随时间变化曲线图。从图中可以看到，在稍高温下(40℃)条件下，体系的吸光度值一直比较低，因为双酶在40℃条件下，双酶反应非常迅速，在前10分钟内已经反应达到平衡，因此随时间的变化吸光度值整体比较低。而30℃条件下，在前80分钟时间内，体系吸光值达到最高，之后吸光度值降低。而20℃条件下，体系的吸光度值在反应的前3h过程中达到最高，之后随时间降低。说明在一定范围内，温度越高，反应较快。颜色变化越快。而在稍低温度条件下，吸光度值上升较缓慢，颜色变化缓慢。在低温条件4℃条件下，吸光度值在5h才达到最高。而最低温0℃时，体系在7h才达到吸光值。说明在低温条件下，酶活较低，反应较慢。在整个过程中一直为蓝色。

图4是在最佳的一组酶和底物浓度的基础上，底物量也可以相应调整，进而让颜色变化更持久。图4中上面一组浓度低，下面一组浓度高，通过图4可以看出在相同时间，相同温度下，下面一组蓝色持续时间很久。图4中，上面的低浓度的一组即为实施例1的酶型时间温度指示器体系，下面的高浓度一组与实施例1的不同之处，仅在于将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺浓度调整为0.75mg/ml。

实施例2：

(1)配备缓冲溶液。

精密称取15.605g NaH₂PO₄·2H₂O溶于500ml去离子水中，配制为0.2M的磷酸缓冲甲液。

精密称取35.82g Na₂HPO₄·12H₂O溶于500ml去离子水中，配制为0.2M的磷酸缓乙液。

精密称取2g NaOH溶于100ml去离子水中,配制为0.5M的氢氧化钠溶液，标记待用。

取适量0.2M的磷酸缓冲液母液，滴加0.5M的氢氧化钠溶液直至溶液pH为5，标记待用。

取磷酸甲液84ml与16ml乙液混合，滴加0.5M的氢氧化钠溶液直至溶液pH为7.5，标记待用。

(2)配备葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶原液。

精密称取5mg葡萄糖氧化酶溶于5ml Ph为5的磷酸缓冲溶液中，使其充分溶解成1mg/ml的葡萄糖氧化酶原液，置于冰箱中冷藏，用时相应倍数稀释。

精密称取5mg辣根过氧化物酶溶于5mlPh为7.5的磷酸缓冲溶液中，使其充分溶解成1mg/ml的葡萄糖氧化酶原液，置于冰箱中冷藏，用时相应倍数稀释。

(3)配备底物葡萄糖原液

精密称取25mg葡萄糖氧化酶溶于10ml去离子水中，使其充分溶解成2.5mg/ml的葡萄糖氧化原液，置于冰箱中冷藏备用，用时相应倍数稀释。

(4)配备底物TMB溶液

底物TMB不易保存，需现陪现用。精密称取TMB粉末2mg溶于10ml无水乙醇中，使其充分溶解成0.2mg/ml的反应液。

(5)双酶反应体系的添加

将上述配制好的酶原液葡萄糖氧化酶稀释500倍，辣根过氧化物酶原液稀释800倍，待用。

将上述配制好的底物葡萄糖原液稀释80倍，现陪现用的底物TMB配制为浓度为0.2mg/m，待用。

按照一定的添加顺序，把两种酶和底物按照体积(葡萄糖氧化酶：辣根过氧化物酶：葡萄糖：TMB＝300ul,100ul,1000ul,200ul)加入到反应体系中，放在25℃的恒温水浴中，同时观察体系不同时间下颜色变化过程。

(6)测试反应体系的吸光度值

将步骤(5)反应一段时间后在紫外分光光度计下测其吸光度，见图5。

经观察颜色变化和吸光度测试，由吸光度曲线可知，吸光度逐渐增加，说明反应在逐渐加快，颜色更深，阶段性变化较明显，经历了由无色，蓝色，绿色，棕色，黄色的变化过程(图6)。在高温条件下，吸光度1h后趋于不变，说明在该温度条件下，反应在前1h达到完全。

实施例3：

实施例3与实施例2不同的是在不同温度下反应，在低温下反应5℃下反应。观察体系颜色变化及体系吸光度值变化。其他条件步骤均与实施例1相同。

由吸光度曲线图(图7)及体系颜色变化图(图8)可知，在低温下，体系吸光度值在2h后才达到最大，趋于平稳，说明双酶在低温下反应较慢，说明温度越低，酶反应越慢，酶的反应与温度具有较好的依赖性。且由颜色变化图可知，在1h内体系一直保持蓝色，不会有其他颜色变化。说明颜色也与温度具有较好的依赖关系。

实施例4

一种酶型时间温度指示器体系，制备包括以下步骤：

(1)所述两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度范围分别为1μg/ml和0.05μg/ml，两种酶按照1:1(400μl：400μl)的体积比加入体系中。

(2)所述两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，两者加入的浓度分别为0.1mg/ml和0.05mg/ml，两种底物按照2:1(600μl：300μl)的体积比加入体系中。

(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；

(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。反应的温度为25℃。

实施例5

一种酶型时间温度指示器体系，制备包括以下步骤：

(1)所述两种酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，两种酶的浓度范围分别为5μg/ml和0.1μg/ml，两种酶按照5:1(1000μl：200μl)的体积比加入体系中。

(2)所述两种底物为葡萄糖和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，两者加入的浓度分别为0.4mg/ml和0.2mg/ml，两种底物按照4:1(1200μl：300μl)的体积比加入体系中。

(3)双酶双底物加入体系的顺序依次为：葡萄糖、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；

(4)按照上述浓度比例及加入顺利依次加入在不同温度下反应，反应一段时间后测体系吸光度。反应的温度为25℃。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。