一种喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡的制作方法

本实用新型属于胶体金免疫层析快速检测领域，更具体地，本实用新型涉及一种检测喹诺酮类药物的免疫胶体金快速检测试剂卡。

背景技术：

氟喹诺酮类药物是一类人工合成的广谱、高效抗菌药物，如恩诺沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、麻保沙星、双氟沙星、单诺沙星、萘啶酸、培氟沙星等，具有良好的药物动力学特性及治疗效果，且为全化学合成药，价格比疗效相当的抗生素低廉，性能稳定，因而发展迅速，已成为临床治疗细菌感染性疾病的主要化疗药物，广泛应用于兽药临床、养蜂业和水产养殖业。

目前，美国已经禁止在食用动物养殖中使用氟喹诺酮类药物；欧盟兽药残留指令EEC 508/1999中规定恩诺沙星与环丙沙星在动物肌肉中的最大残留量之和为100μg/kg；2002年我国农业部发布第235号公告，规定水产品肌肉组织中氟喹诺酮类药物最大残留限量为：恩诺沙星+环丙沙星100μg/kg、达氟沙星100μg/kg、二氟沙星300μg/kg、沙拉沙星30μg/kg、恶喹酸300μg/kg、氟甲喹500μg/kg。然而，喹诺酮类药物违反添加的情况屡禁不止，目前已成为我国近年来最常见的兽药残留指标之一。

为了确保食品安全，建立快速、灵敏的检测技术成为当务之急。目前，喹诺酮类药物的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)、薄层色谱法、高效毛细管电泳分析法、化学发光法、酶联免疫吸附法、免疫层析法等。微生物法操作繁琐，技术人员的专业水平要求高，灵敏度低；HPLC、LC-MS/MS等理化分析方法由于样品前处理过程复杂费时、设备昂贵、检测成本高等原因而无法适合大规模筛选；ELISA虽然具有快速、灵敏的特点，但是ELISA法中酶的活性易受温度影响，因此试剂需要低温保藏、寿命短，并易造成测定结果重复性较差。

技术实现要素：

为克服现有技术存在的上述缺陷，本实用新型针对检测需求，研制开发了一种检测喹诺酮类药物的免疫胶体金快速检测试剂卡。本实用新型试剂卡可用于环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、单诺沙星、氧氟沙星、伊诺沙星、麻保沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、氟甲喹、噁喹酸、氟罗沙星、二氟沙星、左旋氧氟沙星十五种喹诺酮类药物的检测，检测样本可为水产品、畜禽肉、乳品、蜂蜜、鸡蛋、饲料等。本实用新型试剂卡检测限符合要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测，且检测过程中无需昂贵的仪器设备，也无需使用喹诺酮类药物标准品，有利于保护操作者。

为了实现上述目的，本实用新型的技术方案是：一种喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡，包括上、下塑料卡壳和免疫层析试纸条，所述的免疫层析试纸条包括PVC底衬以及其上从左到右依次粘着的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；其特征在于，所述的样品垫叠放于金标抗体结合垫，所述的金标抗体结合垫叠放于硝酸纤维素膜左侧，所述的吸水垫叠放于硝酸纤维素膜的右侧，所述的硝酸纤维素膜上喷有平行的检测线和控制线，两者相距5mm，其中检测线靠近样品垫一端，控制线靠近吸水垫一端，所述的上塑料卡壳设有观察窗、加样孔和二维码。所述的金标抗体结合垫上喷有胶体金标记的抗喹诺酮类药物单克隆抗体；所述的检测线上包被有喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物，所述的控制线上包被有羊抗鼠IgG；所述的样品垫和金标抗体结合垫均由玻璃纤维制成；所述的二维码通过粘贴或喷印于上塑料卡壳靠近观察窗的空白区域，二维码所承载检测相关信息用于检测结果的自动化定量读取；所述的上塑料卡壳靠近加样孔端有若干线状凸起，用于手持时增加摩擦力。

本实用新型试剂卡的判定法则为：当样品中的喹诺酮类药物含量等于或超过试剂卡检出限时，试剂卡上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性；当样品中喹诺酮类药物含量在试剂卡检出限以下或无残留时，试剂卡上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。

本实用新型试剂卡的各部分组成功能如下：

PVC底衬，用于固定支撑试剂卡其他组成部分。

样品垫，用于吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值。

金标抗体结合垫，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。

硝酸纤维素膜，通过检测线和控制线上的试剂将溶液中的胶体金颗粒截留于线上，从而可以根据检测线和控制线上颜色深浅来反映检测结果。

吸水纸，将反应过程中多余的溶液吸收。

二维码，承载检测相关信息用于检测结果的自动化定量读取。

本实用新型试剂卡具有如下有益效果：

(1)特异性好。本实用新型试剂卡对四环素、氯霉素、青霉素、庆大霉素的交叉反应率均小于1％，具有高度专一性。

(2)灵敏度高。本实用新型试剂卡对水产品及畜禽肉组织中喹诺酮类药物的最低检出限为10.0μg/kg，符合国家限量要求，在对水产品及畜禽肉组织中喹诺酮类药物的快速检测领域中达到了较优水平。各种喹诺酮类药物具体检出限见表1。

表1喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡检出限

(3)操作简单、快速、安全。本实用新型试剂卡将反应所需的大部分原料整合到免疫层析试纸条中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后3-5分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，无需毒素标准样品，普通人员均可操作。

(4)成本低，易推广。本实用新型试剂卡生产工艺简单，流程成熟。生产成本低廉，投资少，收效快。

附图说明

图1为免疫层析试纸条结构示意图，其中1为样品垫，2为金标抗体结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水纸，7为不干胶，8为PVC底衬。

图2为喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡俯视图，其中9为二维码区域，10为观察窗，11为加样孔，12为手持区域，C为控制区，T为检测区。

图3是喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡结果判定阴性示意图；图4是喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡结果判定阳性示意图；图5是喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡结果判定无效示意图，其中C为控制区，T为检测区。

具体实施方式

本实用新型试剂卡的制备包括载体蛋白偶联物的制备，抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记的抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备和喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡的组装。

1.载体蛋白偶联物的制备

称取10mg BSA、30mg EDC·HCl，加500μL水，立刻加20mg/mL CIP·HCl水溶液1mL，混匀；避光4℃，反应12h以上，中间可颠倒混匀；用0.1mol/L NaOH溶液透析3-6h左右；用pH11.5、0.01mol/L PBS液透析、过滤，制得包被抗原CIP-BSA。

同理制得免疫抗原CIP-OVA。

2.抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

取8周龄BALB/c雄性小鼠用CIP-OVA进行5次免疫。初次免疫，每只小鼠免疫剂量为150μg，与等量福式完全佐剂充分乳化进行背部皮下多点注射；此后每间隔两周免疫一次，每次每只免疫剂量100μg与等量福式不完全佐剂混匀后采用相同方式免疫。进行细胞融合前3d，再加强免疫一次，剂量为150μg，腹腔直接注射。

免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)在质量分数为50％聚乙二醇(PEG)作用下进行细胞融合。融合后的细胞置37℃，体积分数为5％的CO₂培养箱中以HAT、HT培养基选择培养。用间接酶联免疫吸附(ELISA)法以5μg/mL CIP-BSA包被酶标板进行阳性筛选。

体内诱生腹水：给腹腔注射液体石蜡0.5mL，10d后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10⁷个细胞，7d后抽取腹水，采用辛酸-硫酸铵法，对腹水进行纯化。

3.胶体金溶液的制备

胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在100mL去离子水中加入1mL 1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL 1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。

4.胶体金标记的抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

取已制备好的100mL胶体金溶液，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg抗喹诺酮类药物单克隆抗体，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG 20000)，搅拌15min。20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4 PBS缓冲液(含0.4mol/L PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2％BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

5.喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡的组装

参照图1，用点膜机把适当浓度的CIP-BSA及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的胶体金标记的抗喹诺酮类药物单克隆抗体包被在金标抗体结合垫上。

检测试剂组成为塑料底衬，在其上按顺序粘上样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。用切割机将贴好的大卡切割成3.84mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂卡，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

6.喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂卡检测实施操作方法

6.1 水产品样本前处理方法

方法一：

取一定的去脂肪(油脂)的肌肉组织，用剪刀切碎；称2g切碎的组织样于5mL离心管中；加入4mL乙腈，剧烈振荡3min后，室温条件下4000r/min，离心5min。移取上清液1mL到5mL离心管中，65℃氮气(或空气)吹干；加入300μL正己烷和300μL复溶液，轻轻吹打液体润洗内壁四周，使沉淀充分溶解。静置分层后，用滴管取下层液体，待检。

方法二：

取一定的去脂肪(油脂)的肌肉组织，用剪刀切碎；称1g切碎的组织样于5mL离心管中；加入3mL去离子水，剧烈振荡3min后，室温条件下4000r/min，离心5min。移取上清液0.1mL到1.5mL离心管中，加入0.9mL复溶液混合均匀后静置，用滴管取下层液体，待检。

6.2 使用方法

从包装袋中取出试剂卡，吸取待检样品溶液100μL滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3-5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂卡水平放置于观察者正面。

6.3 结果判断

观察窗中T线显色比C线深或一样深为阴性，表示样品中喹诺酮类药物含量低于检出限或不含喹诺酮类药物。如图3所示。

观察窗中T线显色比C线浅或T线无显色为阳性，表示样品中喹诺酮类药物含量等于或高于检出限。如图4所示。

观察窗中未出现C线，可能是操作不当或试剂卡已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂卡重新测试。如图5所示。