筛选线粒体活性激活剂的方法与流程

本发明涉及筛选线粒体活性激活剂的方法(methodforscreeningactivatorofmitochondriaactivity)，更具体地，涉及使用经绞股蓝皂苷处理的细胞来筛选线粒体活性激活剂的方法、包含所述绞股蓝皂苷的用于筛选线粒体活性激活剂的组合物及含有上述组合物的试剂盒。

背景技术：

线粒体是在大部分真核细胞中存在的细胞器。线粒体的主要功能之一为氧化磷酸化，通过该过程来将源于葡萄糖或脂肪酸等燃料物质的能量转换为atp(三磷酸腺苷)，其用于进行各种需要能量的生物合成及促进其他代谢活性。已知线粒体含有与核基因组dna不同的单独的dna，所述线粒体dna为具有约16000碱基对的环形dna。此外，所述线粒体dna与核的dna不同，不具有自我修复机制(repairmechanism)，且没有起到保护dna作用的组蛋白，因此根据细胞外部环境或内部环境而容易变异。大部分所述变异显示抑制线粒体活性的效果，但有些也可以显示促进线粒体活性的效果。

已知当所述线粒体的dna发生变异而导致线粒体活性受到抑制时，线粒体膜电位异常所引起的膨胀、活性氧簇或自由基等所导致的氧化应激所引起的功能异常、遗传因素所引起的功能异常以及用于生成线粒体能量的氧化磷酸化功能缺陷所导致的功能异常会发生，从而可能诱发代谢性疾病、退行性脑病、肝功能异常、肌肉病、免疫疾病等。因此，人们正在开发用于治疗由于线粒体活性受抑制而诱发的疾病的多种制剂(韩国授权专利第1048766号、韩国公开专利第2005-0117313号、韩国公开专利第2013-0064761号、韩国公开专利第2014-0012456号)。

此外，当所述线粒体dna发生变异而促进线粒体活性时，细胞内产生过多的atp而诱发细胞功能异常。由此可诱发的疾病有包括风湿性关节炎在内的多种自身免疫疾病、多种癌症等。针对线粒体活性受抑制而导致的疾病而言，人们从促进线粒体活性的方面来进行多种研究，但是迄今为止还没有开发出适合改善受抑制的线粒体活性的激活剂。理由是虽然发现了很多显示线粒体功能促进活性的候选物质，但实际没有起到促进线粒体功能。从而现在面临开发出一种发掘实际能够促进线粒体功能的激活剂的方法的需要。

技术实现要素：

技术问题

为了解决上述问题，本发明的发明人为了开发出能够发掘促进线粒体功能的激活剂的方法而不懈努力研究，结果开发出以能够在分离细胞中促进线粒体活性的绞股蓝皂苷75为基准物质，筛选以等同或高于所述绞股蓝皂苷75的水平促进线粒体活性的候选物质并将其用作线粒体功能激活剂的方法，由此完成了本发明。

技术方案

本发明的目的在于，提供一种通过将经绞股蓝皂苷处理的细胞用作对照组而筛选线粒体活性激活剂的方法。

本发明的另一目的在于，提供一种含有绞股蓝皂苷的用于筛选线粒体活性激活剂的组合物。

本发明的又一目的在于，提供一种含有上述组合物的用于筛选线粒体活性激活剂的试剂盒。

发明效果

使用根据本发明的筛选线粒体活性激活剂的方法，能够有效发掘实际上促进线粒体活性的制剂，从而能够广泛用于开发针对线粒体活性受抑制而引起的疾病的治疗剂。

附图说明

图1是表示用绞股蓝皂苷、人参皂苷f1、人参皂苷rg3、人参皂苷rb2或人参皂苷rb3处理后的细胞内atp量变化的图谱。

图2是表示用绞股蓝皂苷、人参皂苷f1、人参皂苷rg3、人参皂苷rb2或人参皂苷rb3处理后的细胞内线粒体膜电压变化的图谱。

具体实施方式

本发明的发明人为了开发出能够发掘实际上能够促进线粒体功能的激活剂的方法而进行多种研究的过程中，关注到了绞股蓝皂苷。已知作为一种皂苷类化合物的绞股蓝皂苷，除了人参之外，还在绞股蓝、绞股蓝茶中含有。此外，与在细胞中显示多种活性的人参皂苷不同，绞股蓝皂苷在细胞内仅显示抗氧化活性，而其他细胞内活性尚未公知。

本发明的发明人用绞股蓝皂苷之一的绞股蓝皂苷75处理分离细胞，并测定线粒体中生成的atp生成量的变化，结果确认到通过绞股蓝皂苷75的处理而导致atp生成量增加，从而可以知道所述绞股蓝皂苷75是实际上能够促进线粒体功能的激活剂。

从而，通过将经绞股蓝皂苷处理的细胞用作对照组，筛选预期能够促进线粒体功能的候选物质时，确认到能够筛选实际上能够促进线粒体功能的激活剂，如上所述的使用绞股蓝皂苷来筛选线粒体活性激活剂的方法以往没有公开，是由本发明的发明人第一次开发。

为了达到上述目的，本发明提供一种筛选线粒体活性激活剂的方法，该方法包括：(a)分别获得分离细胞经绞股蓝皂苷处理的对照组和分离细胞经预期能够抑制线粒体活性的候选物质的处理的实验组；(b)分别测定所述对照组和实验组的线粒体活性的步骤；及(c)筛选所述实验组中所测定的线粒体活性等同于或高于所述对照组中所测定的线粒体活性的候选物质的步骤。

此时只要是绞股蓝皂苷使线粒体活性得到促进的细胞，上述分离细胞就不受特别限制，作为一例示可以是胰岛素分泌细胞，可以利用线粒体所生成的atp生成量、线粒体dna水平等来进行测量。作为一例，若用绞股蓝皂苷处理分离细胞后线粒体活性得到提高，则上述细胞内测定的atp生成量随之增加，因此通过测定所述对照组和实验组的细胞所生成的atp生成量，能够测定线粒体活性。

这种测定线粒体活性的方法除了上述方法之外可以使用本领域公知的所有方法，显然本领域技术人员根据需要可以选择性地使用上述公知方法。

本发明的用语“绞股蓝皂苷(gypenoside)”也可以称为“绞股蓝总皂苷(gynosaponin)”，是指绞股蓝(gynostemmapentaphyllum)及绞股蓝茶中包含的皂苷化合物之一的达玛烷型(dammaranetype)皂苷。已知所述绞股蓝皂苷显示脂质代谢改善作用、心血管系统疾病的预防作用、降血糖作用、中枢神经系统作用、抗癌作用、阻碍血小板凝集作用、强壮作用等效果，在细胞内显示抗氧化效果。

根据本发明，所述绞股蓝皂苷可以用作提高线粒体活性的激活剂，所述绞股蓝皂苷只要是显示提高线粒体活性的效果就不受特别限制，作为一例，可以单独使用或组合使用绞股蓝皂苷1、绞股蓝皂苷3、绞股蓝皂苷4、绞股蓝皂苷5、绞股蓝皂苷8、绞股蓝皂苷17、绞股蓝皂苷48、绞股蓝皂苷75等，作为另一例，可以为下列化学式1的绞股蓝皂苷75。

[化学式1]

根据本发明一实施例，用绞股蓝皂苷75处理胰岛素分泌细胞ins-1细胞，并培养2小时后，测定上述细胞中生成的atp量，结果确认了相比没有用绞股蓝皂苷75处理的对照组细胞，atp生产量增加(图1)。

作为本发明另一具体例，提供一种含有绞股蓝皂苷的用于筛选线粒体活性激活剂的组合物及含有所述组合物的用于筛选线粒体活性激活剂的试剂盒。

所述组合物及试剂盒中含有的绞股蓝皂苷75能够提高细胞内线粒体活性，从而所述组合物及试剂盒能够用于制作用于筛选线粒体活性抑制剂的对照组。

尤其，所述试剂盒除了绞股蓝皂苷75还可以包括适合于确认候选物质是否抑制线粒体活性的方法的一种或多种的其他组成成分的组合物、溶液或装置。例如，可以进一步包含借助绞股蓝皂苷75而线粒体活性得以提高的细胞、用于所述细胞培养的容器；用于所述细胞培养的培养基；用于atp生成量测定的适当的缓冲液；用于atp生成量测定的荧光物质(fitc(异硫氰酸荧光素)、ritc(异硫氰酸罗丹明b)等)等。

作为一具体例，根据本发明的用于筛选线粒体活性激活剂的试剂盒可以是包含实施测定线粒体生成的atp量的荧光素酶测定法所需的要素的试剂盒。即，所述试剂盒可以包含：细胞破碎用缓冲液；荧光素酶；诱导所述荧光素酶的荧光发色的基质；所述荧光素酶的荧光发色所必需的缓冲液；试管或其他适当的容器等。

作为另一例，根据本发明的用于筛选线粒体活性激活剂的试剂盒可以是包含实施pcr而扩增线粒体dna所需的要素的试剂盒。即，所述试剂盒可以包含：对所述线粒体dna的各特异性引物对；试管或其他适当的容器；反应缓冲液(ph及镁浓度不同)；脱氧核糖核苷三磷酸(dntps)；诸如taq聚合酶及逆转录酶等酶；dnase(脱氧核糖核酸酶)；rnase(核糖核酸酶)抑制剂；焦炭酸二乙酯-水(depc-water)；灭菌水等。此外，还可以包含对用作定量对照组的基因的特异性引物对。

实施例

下面通过实施例进一步详细说明本发明。但是这些实施例仅用于示例性说明本发明，本发明的范围并不由这些实施例限定。

实施例1：绞股蓝75的线粒体活性促进效果

线粒体的功能降低时，由于胰岛素信号传递阻碍而可能成为糖尿病的原因。从而，为了确认绞股蓝皂苷75的线粒体功能活化效果，用绞股蓝皂苷75处理后，测定增加的atp的量和线粒体膜电压。

首先，将胰岛素分泌细胞ins-1细胞在细胞培养器中培养后(37℃、5％co2、rpmi(无血清细胞冻存)培养基、10％fbs(胎牛血清))，用10μm的绞股蓝皂苷75、人参皂苷f1、人参皂苷rg3、人参皂苷rb2或人参皂苷rb3处理2小时，测定细胞内的atp量和线粒体膜电压。此时，对照组使用经dmso(二甲亚砜)的处理的细胞。

然后，使用荧光素酶测定细胞内atp量，由于荧光素的活化引起的荧光发色依赖atp的量，因此通过测定所述荧光发色水平就能够测定细胞内atp量。

具体地，将处理上述各物质的ins-1细胞通过冷冻-解冻及超声波处理来粉碎而获得细胞粉碎液，在上述获得的细胞粉碎液中添加荧光素酶和荧光素诱导荧光发色后，量化荧光发色水平并进行比较(图1)。

图1是表示用绞股蓝皂苷、人参皂苷f1、人参皂苷rg3、人参皂苷rb2或人参皂苷rb3处理后的细胞内atp量变化的图谱。如图1所示，可以确认用绞股蓝皂苷75处理时，相比对照组，细胞内atp量增加50％。

最后，通过tmrm(四甲基若丹明甲酯)染色测定线粒体膜电压，由于tmrm染色水平相对于线粒体膜电压成比例地增加，因此通过测定tmrm染色水平就能够测定细胞内线粒体的膜电压。

具体地，处理了上述各物质的ins-1细胞用tmrm进行染色，利用流式细胞分析仪(facs)定量分析上述染色水平并进行比较(图2)。

图2是表示根据使用绞股蓝皂苷、人参皂苷f1、人参皂苷rg3、人参皂苷rb2或人参皂苷rb3处理的细胞内线粒体膜电压变化的图谱。如图2所示，确认了当用绞股蓝皂苷75处理时，相比对照组，细胞内膜电压增加约40％。

综合上述图1和图2的结果，可以确认绞股蓝皂苷75活化细胞内线粒体的功能，增加细胞内atp水平和线粒体膜电压水平。

工业实用性

使用本发明的筛选线粒体活性激活剂的方法，能够有效发掘实际上能够促进线粒体活性的制剂，从而能够广泛用于开发针对线粒体活性受抑制而导致的疾病的治疗剂。