本发明涉及分离方法、检测方法、信号测定方法、疾病的判定方法、药效评价方法、试剂盒、液态组合物以及检体稀释液。更详细而言，涉及外来体等具有脂质双层膜的囊泡的分离方法、利用了该方法的核酸或蛋白质的检测方法、信号测定方法、疾病的判定方法、疾病治疗药的药效评价方法、疾病判定或药效评价用试剂盒、上述分离方法中使用的液态组合物以及检体稀释液。
背景技术：
囊泡具有被脂质双层膜包围的结构，在这样的囊泡中，作为生物体内的体液中存在的囊泡颗粒，已知有外来体。已知在外来体的表面，与一般的细胞表面同样地存在各种膜蛋白质，另一方面，也可知在外来体的内部，除细胞因子等各种蛋白质以外，也含有microRNA(miRNA)。
另外，已知由免疫系统的细胞、各种癌细胞等各种细胞分泌外来体，作为生物体内的细胞间通讯的媒介作用的外来体的功能，外来体与生理现象、癌症等疾病的相关性受到关注，正在对其进行研究。例如，已经报告了使用作为肿瘤标记物的EpCAM的抗体时，从卵巢癌患者的循环血中分离外来体，来自外来体的miRNA表达量与卵巢癌的进行之间具有相关性(非专利文献1)。
另外，作为在外来体上表达的四次跨膜型的膜蛋白质，有属于四跨膜蛋白家族的CD9、CD63和CD81，在非专利文献2中报告了黑色素瘤患者的血浆中的外来体量比健康人高，其能够用针对CD63的抗体、针对肿瘤相关标记物的Caveolin-1的抗体进行检测·定量化。另外，通过对离心分离后的血浆样品组合抗CD63抗体、针对各种膜蛋白质的抗体等进行反应，从而对来自癌患者的外来体的信号进行定量而进行解析(专利文献1)。
如上所述，正在进行如下尝试：从血清、血浆、血液等临床检体中特异性地捕捉外来体，将外来体中含有的蛋白质、miRNA作为新的生物标记物用于疾病的早期诊断、复发的发现。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/065968号
非专利文献
非专利文献1:D.D.Taylor.，et al.，Gynecol.Oncol.，110，13-21(2008)
非专利文献2:M.Logozzi.，et al.，PLoS ONE.，4，1-10(2009)
技术实现要素：
然而，上述临床检体因为含有白蛋白和球蛋白等高浓度的蛋白质，所以在将从临床检体中分离出的外来体用于判定疾病时，由于对固相载体、反应容器内壁的非特异性吸附，从而抗原抗体反应等特异性反应因检体成分而受到阻碍或者应该判定为阴性的检体被错误地判定为阳性(以下，假阳性)，这成为重大问题。该问题在临床检体为血清、血浆的情况下特别显著。
为了减少该假阳性，已经使用了在反应中添加表面活性剂或者在固相载体上外涂(over coat)蛋白质、聚合物等方法，但仅用迄今为止的方法在使因非特异性吸附而引起的假阳性减少方面有限。减少假阳性在利用以外来体为代表的囊泡的疾病的判定或疾病治疗药的药效评价中逐渐成为重要的课题。
另外，提出了在分离外来体之前，进行除去可阻碍抗原抗体反应的检体成分、浓缩外来体等前处理，作为这样的前处理方法，一般进行基于聚乙二醇(PEG)沉淀法的分离法、使用超离心机的分离法等，但即便进行这样的前处理，也难以充分地减少非特异性吸附，还存在耗时耗力的问题。
本发明要解决的课题在于提供能够减少对固相载体的非特异性吸附、能够选择性且高效地分离具有脂质双层膜的囊泡的方法。
因此，本发明人等进行了深入研究，结果发现通过在包含复合体形成工序和清洗工序的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法中，(以下，将复合体形成反应液和清洗工序液统称为“反应液”)在反应液中的盐浓度0.15～2M的环境下进行所述复合体形成工序和所述清洗工序中的至少任一工序，能够减少对固相载体的非特异性吸附，能够选择性且高效地分离具有脂质双层膜的囊泡，所述复合体形成工序将含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样和结合有配体的固相载体混合而形成复合体形成反应液，形成所述囊泡与所述固相载体的复合体，所述配体识别存在于所述囊泡表面的表面抗原，所述清洗工序在所述复合体形成工序中所形成的囊泡与固相载体的复合体中加入清洗液而形成清洗工序液，清洗所述复合体，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的＜1＞～＜23＞。
＜1＞一种具有脂质双层膜的囊泡的分离方法，其特征在于，包含：复合体形成工序，使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体进行接触，形成所述囊泡与所述固相载体的复合体，所述配体识别存在于所述囊泡表面的表面抗原，以及清洗工序，清洗所述复合体；在盐浓度0.15～2M的环境下进行所述复合体形成工序和所述清洗工序中的至少任一工序。
＜2＞根据＜1＞所述的分离方法，其中，在盐浓度0.15～2M的环境下进行所述复合体形成工序。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的分离方法，其中，所述生物体试样为体液或细胞培养上清液。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的分离方法，其中，所述生物体试样为体液。
＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的分离方法，其中，所述复合体形成工序所使用的复合体形成反应液含有无机盐。
＜6＞根据＜5＞所述的分离方法，其中，所述无机盐为碱金属卤化物。
＜7＞根据＜1＞～＜6＞中任一项所述的分离方法，其中，所述复合体形成工序中的复合体形成反应的反应温度为2～42℃的范围内。
＜8＞根据＜1＞～＜7＞中任一项所述的分离方法，其中，所述配体为识别存在于囊泡表面的表面抗原的抗体。
＜9＞根据＜1＞～＜8＞中任一项所述的分离方法，其中，所述囊泡为外来体。
＜10＞根据＜1＞～＜9＞中任一项所述的分离方法，其中，所述固相载体为磁性粒子。
＜11＞根据＜10＞所述的分离方法，其中，所述清洗工序包含如下工序：利用磁力集中所述磁性粒子而将磁性粒子与液相分离的集磁工序以及使在该集磁工序中所分离的磁性粒子分散在清洗液中的分散工序。
＜12＞一种囊泡中的核酸的检测方法，其特征在于，在＜1＞～＜11＞中任一项所述的分离方法之后，进一步包含对囊泡中的核酸进行检测的核酸检测工序。
＜13＞一种来自囊泡的蛋白质的检测方法，其特征在于，在＜1＞～＜11＞中任一项所述的分离方法之后，进一步包含对存在于囊泡的内侧和表面的至少一方的蛋白质进行检测的蛋白质检测工序。
＜14＞一种来自囊泡的信号测定方法，其特征在于，在＜1＞～＜11＞中任一项所述的分离方法之后，进一步包含对来自形成有所述复合体的囊泡的信号强度进行测定的信号测定工序。
＜15＞一种疾病的判定方法，其特征在于，是用于判定被检者是否患有疾病的方法，包含如下工序：使用来自被检者的生物体试样，利用＜14＞所述的信号测定方法对来自形成所述复合体的囊泡的信号强度进行测定。
＜16＞一种疾病治疗药的药效评价方法，其特征在于，是疾病治疗药的药效评价方法，包含如下工序：使用疾病治疗药给予前和给予后的来自被检者的生物体试样，利用＜14＞所述的信号测定方法对来自形成所述复合体的囊泡的信号强度进行测定。
＜17＞一种试剂盒，其特征在于，具备固相载体和液态组合物，所述固相载体结合有配体，所述配体识别存在于具有脂质双层膜的囊泡表面的表面抗原，所述液态组合物含有无机盐或有机盐，该无机盐或有机盐的含量具有0.15M以上的盐浓度。
＜18＞根据＜17＞所述的试剂盒，用于疾病的判定或疾病治疗药的药效评价。
＜19＞一种液态组合物，其特征在于，在包含复合体形成工序和清洗工序的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法中使用，用于在所述复合体形成工序和所述清洗工序中的至少任一工序中添加，所述复合体形成工序使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体进行接触，形成所述囊泡与所述固相载体的复合体，所述配体识别存在于所述囊泡表面的表面抗原，所述清洗工序清洗所述复合体，所述液态组合物具有0.15M以上的盐浓度。
＜20＞一种检体稀释液，其特征在于，在使用不溶性载体从含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样中分离具有脂质双层膜的囊泡的方法中使用，用于形成所述囊泡与所述不溶性载体的复合体，所述检体稀释液具有0.15M以上的盐浓度。
＜21＞根据＜20＞所述的检体稀释液，含有无机盐。
＜22＞根据＜21＞所述的检体稀释液，其中，所述无机盐为碱金属卤化物。
＜23＞一种具有脂质双层膜的囊泡的分离方法，其特征在于，是使用不溶性载体从含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样中分离具有脂质双层膜的囊泡的方法，使用具有0.15M以上的盐浓度的检体稀释液。
根据本发明的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法，能够减少对固相载体的非特异性吸附，能够选择性且高效地分离具有脂质双层膜的囊泡。
因此，根据本发明，能够简便且准确地检测·测定囊泡中的核酸、来自囊泡的蛋白质、来自囊泡的信号。另外，本发明的疾病的判定方法、药效评价方法不易成为假阳性。另外，通过使用本发明的试剂盒、液态组合物、检体稀释液，能够减少对固相载体的非特异性吸附，能够选择性且高效地分离具有脂质双层膜的囊泡。
附图说明
图1-1是表示通过使盐浓度为0.15～0.35M而产生的非特异性吸附减少作用的图(临床检体：血清)。
图1-2是表示通过使盐浓度为0.15～0.35M而产生的非特异性吸附减少作用的图(临床检体：柠檬酸血浆)。
图2-1是表示通过使反应温度25℃下的盐浓度为0.15～0.35M而产生的反应性提高作用的图(临床检体：血清)。
图2-2是表示通过使反应温度4℃下的盐浓度为0.25M而产生的反应性提高作用的图(临床检体：血清)。
图3是确认使用各种临床检体时的非特异性吸附减少作用的图。
图4是确认使用各种临床检体时的反应性提高作用的图。
图5-1是确认使用抗CD63抗体结合磁性粒子作为固相载体时的反应性提高作用的图。
图5-2是确认使用抗CD81抗体结合磁性粒子作为固相载体时的反应性提高作用的图。
图5-3是确认使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时的反应性提高作用的图。
图6是表示使用抗CD9抗体结合磁性粒子作为固相载体并与健康人血清反应时的囊泡中的核酸的检测结果的图。
图7-1是表示来自健康人血清的囊泡中的核酸的检测结果的图。
图7-2是表示来自健康人肝素血浆的囊泡中的核酸的检测结果的图。
图8-1是表示来自健康人血清的囊泡表面的蛋白质的检测结果的图。
图8-2是表示来自健康人肝素血浆的囊泡表面的蛋白质的检测结果的图。
图9-1是表示来自健康人血清的囊泡表面的维持了天然形式的立体结构的蛋白质的检测结果的图。
图9-2是表示来自健康人肝素血浆的囊泡表面的维持了天然形式的立体结构的蛋白质的检测结果的图。
图9-3是表示从在健康人血清中添加了由人结肠癌HT29细胞制备的含有外来体的培养上清液的模拟来自疾病的生物体试样中以维持天然形式的立体结构的状态检测到囊泡表面的蛋白质的结果的图。
图9-4是表示从在健康人肝素血浆中添加了由人结肠癌HT29细胞制备的含有外来体的培养上清液的模拟来自疾病的生物体试样中以维持天然形式的立体结构的状态检测到囊泡表面的蛋白质的结果的图。
图10-1是表示从在健康人血清中添加了由人结肠癌HT29细胞制备的含有外来体的培养上清液的模拟来自疾病的生物体试样中检测囊泡表面的蛋白质而得到的结果的图。
图10-2是表示从在健康人肝素血浆中添加了由人结肠癌HT29细胞制备的含有外来体的培养上清液的模拟来自疾病的生物体试样中检测囊泡表面的蛋白质而得到的结果的图。
具体实施方式
〔具有脂质双层膜的囊泡的分离方法〕
本发明的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法的特征在于，包含复合体形成工序，使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体接触，形成囊泡与固相载体的复合体，所述配体识别存在于囊泡表面的表面抗原，以及清洗工序，清洗复合体；在盐浓度0.15～2M的环境下进行复合体形成工序和清洗工序中的至少任一工序。这里，在本说明书中，盐浓度是指作为无机盐和有机盐的合计的盐浓度，优选为无机盐的盐浓度，进一步优选为1价的无机盐的盐浓度，特别优选为碱金属卤化物的浓度，最优选为氯化钠的浓度。反应液的盐浓度也称为反应液中的盐的终浓度。
(复合体形成工序)
复合体形成工序是将含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体混合而形成复合体形成反应液，形成囊泡与固相载体的复合体的工序，所述配体识别存在于囊泡表面的表面抗原。通过形成复合体形成反应液，含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体接触，所述配体识别存在于囊泡表面的表面抗原。通过上述接触，囊泡被配体捕捉，形成囊泡与固相载体的复合体。应予说明，在复合体形成工序的反应体系中，除与上述固相载体结合的配体以外，也可以共存识别存在于具有脂质双层膜的囊泡表面的表面抗原的配体。
上述生物体试样只要是含有具有脂质双层膜的囊泡的试样就没有特别限定，例如可举出体液、菌体液、细胞培养的培养基、细胞培养上清液、组织细胞的粉碎液等各种液体。其中，优选体液、细胞培养上清液，更优选体液。作为体液，可举出全血、血清、血浆、血液成分、各种血球、血块、血小板等血液组成成分、以及尿、精液、母乳、汗、间质液、间质性淋巴液、骨髓液、组织液、唾液、胃液、关节液、胸膜液、胆汁、腹水、羊水等，优选为血液组成成分。本发明的分离方法即便使用这样的临床检体作为生物体试样时，对固相载体的非特异性吸附也低，捕捉反应的反应性也高，因此，根据本发明的分离方法，能够选择性且高效地从广泛种类的生物体试样中分离囊泡。例如，即便使用血浆作为生物体试样时，也不易发生非特异性吸附，即便使用血清作为生物体试样时，捕捉反应的反应性也高。
应予说明，血液组成成分可以用柠檬酸、肝素、EDTA等抗凝剂进行处理。
上述生物体试样可以使用预先用缓冲液组合物稀释等而进行了前处理的试样，但也可以直接使用从生物体采取的试样。即，根据本发明的分离方法，也可以不进行基于PEG沉淀法、使用超离心机等的分离法等的前处理而简便地进行选择性分离。
另外，作为上述具有脂质双层膜的囊泡，可举出细胞、从细胞释放到细胞外的外来体这样的囊泡、具有包膜的病毒等，本发明的分离方法在囊泡为外来体的情况下特别优选使用。
另外，存在于囊泡表面的表面抗原只要是存在于囊泡表面的物质且具有抗原性，就没有特别限定。如果例举外来体的表面抗原，则可举出CD9、CD63、CD81等四跨膜蛋白类；MHCI、MHCII等抗原呈递相关蛋白；整合素、ICAM-1、EpCAM等粘接分子；EGFRvIII、TGF-β等细胞因子/细胞因子受体、酶类等。其中，优选存在于外来体表面的抗原蛋白质。
生物体试样的使用量(浓度)优选为0.001～100％(w/v)，更优选为0.1～50％(w/v)。
另外，本发明的分离方法中使用的固相载体只要结合有识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体，就没有特别限定。
作为配体，优选识别存在于囊泡表面的表面抗原的抗体，更优选识别存在于外来体表面的表面抗原的抗体。另外，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。
上述单克隆抗体没有特别限定，可以依照公知的方法，例如K.Watanabe et al.，Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis，J.Clin.Invest.114(2004)，898-907中记载的方法制备。另外，识别外来体的表面抗原CD9、CD63、CD81等四跨膜蛋白类的单克隆抗体可以参照国际公开第2013/099925号等进行制作。
应予说明，作为上述抗体的种类，可举出IgG、IgM，优选IgG。另外，可以使用将它们低分子化的片段。例如可举出F(ab’)2、Fab’、Fab等。
作为结合上述配体的固相载体的材质，例如可举出聚苯乙烯类、聚乙烯类、聚丙烯类、聚酯类、聚(甲基)丙烯腈类、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯类、氟树脂、交联葡聚糖、多糖等高分子化合物；玻璃；金属；磁性体；含有磁性体的树脂组合物；它们的组合等。
另外，固相载体的形状没有特别限定，例如，可举出托盘状、球状、粒子状、纤维状、棒状、盘状、容器状、池(セル)、微孔板、试验管等。
本发明中，从固液分离、清洗的容易性的观点考虑，优选磁性粒子。
作为上述磁性粒子，例如可举出四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(γ-Fe2O3)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属；由钴、镍、锰等的合金构成的磁性体所构成的微粒；树脂中含有这些磁性体的磁性粒子。作为树脂，可举出疏水性聚合物、亲水性聚合物等。
其中，优选树脂中含有磁性体的磁性粒子，更优选在含有超顺磁性微粒的母粒的表面形成有聚合物层的磁性粒子。例如可举出日本特开2008-32411号公报中记载的通过在含有超顺磁性微粒的母粒的表面形成疏水性的第1聚合物层，在该第1聚合物层上形成至少在表面具有缩水甘油基的第2聚合物层，对该缩水甘油基进行化学修饰而导入了极性基团的磁性粒子。
这里，作为超顺磁性微粒，代表性的是粒径20nm以下(优选粒径5～20nm)的氧化铁系的微粒，可举出由XFe2O4(X为Mn、Co、Ni、Mg、Cu、Li0.5Fe0.5等)表示的铁氧体、由Fe3O4表示的磁铁矿、γ-Fe2O3，从饱和磁化强且残留磁化少的方面考虑，优选含有γ-Fe2O3和Fe3O4中的任一者。
另外，用于形成上述疏水性的第1聚合物层的单体大致分为单官能单体、多官能单体。这里，单官能单体是指具有1个反应性基团的单体，多官能单体是指具有2个以上反应性基团的单体。
作为单官能单体，例如可以例示苯乙烯、α-甲基苯乙烯、卤代苯乙烯等芳香族乙烯基系单体；丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸硬脂酯、甲基丙烯酸硬脂酯、丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸环己酯、丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸异冰片酯等烯键式不饱和羧酸烷基酯系单体。
作为多官能单体，例如可以例示乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、二季戊四醇六丙烯酸酯、二季戊四醇六甲基丙烯酸酯等多官能(甲基)丙烯酸酯；丁二烯、异戊二烯等共轭二烯烃、以及二乙烯基苯、邻苯二甲酸二烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯等。
另外，用于形成上述第2聚合物层的单体以向粒子表面导入官能团为主要目的，优选包括含有缩水甘油基的单体。作为含有缩水甘油基的单体的含量，在用于形成第2聚合物层的全部单体中，优选20质量％以上。这里，作为含有缩水甘油基的单体，可举出丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚等。
作为对第2聚合物层的缩水甘油基进行化学修饰而导入的极性基团，优选为可与配体反应的官能团，更优选含有1个以上选自氧原子、氮原子和硫原子中的至少1种原子。其中，更优选氨基、醛基、羧基、活性酯基。特别是磁性粒子的第2聚合物层具有上述极性基团和2,3-二羟基丙基时，与配体的结合性良好。
另外，磁性粒子等固相载体可以在其表面固定具有生物素类结合部位的物质。作为具有生物素类结合部位的物质，例如可举出选自亲和素、链霉亲和素、Tamavidin和它们的衍生物中的1种或2种以上的化合物等。进而，该情况下，固相载体可以结合有抗体等，所述抗体等介由具有生物素类结合部位的物质结合有生物素类。具有生物素类结合部位的物质向固相载体的表面的固定只要通过日本专利第4716034号公报中记载的方法等公知的方法进行即可。
作为将配体与固相载体结合的方法，可使用物理吸附法、共价键法、离子键法之类的化学结合的方法等。作为物理吸附法，可举出将配体直接固定于固相载体的方法、与白蛋白等其它蛋白质进行化学结合后吸附而固定的方法等。作为化学结合的方法，可举出利用导入到固相载体表面的可与配体反应的官能团直接结合在固相载体上的方法；在固相载体与配体之间以化学键导入间隔分子(碳二亚胺化合物等)后进行结合的方法；使配体与白蛋白等其它蛋白质结合后，将该蛋白质与固相载体进行化学结合的方法等。
另外，结合有识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体可以使用市售品。例如可举出Exosome-Human CD9 Isolation Reagent(from cell culture)、Exosome-Human CD63 Isolation/Detection Reagent(from cell culture media)(均为Life technologies公司制)、CD9Exo-Flow Capture kit、CD63Exo-Flow Capture kit、CD81 Exo-Flow Capture kit(均为SBI公司制)等。
另外，结合有上述配体的固相载体的使用量相对于生物体试样，优选为0.00001～0.1质量倍，更优选为0.0001～0.01质量倍。
在复合体形成工序中的复合体形成反应液中，除上述各成分以外，还可以根据需要添加表面活性剂；白蛋白等蛋白质；核酸；蔗糖等糖类等。
从减少非特异性吸附的观点、抑制对囊泡的损伤的方面考虑，表面活性剂是有效的，优选非离子性表面活性剂，进一步优选聚乙二醇型非离子性表面活性剂。另外，表面活性剂优选分子中不含芳香族基团的表面活性剂。
作为分子中不含芳香族基团的表面活性剂，例如可举出高级醇环氧乙烷加合物、脂肪酸环氧乙烷加合物、多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加合物、高级烷基胺环氧乙烷加合物、脂肪酸酰胺环氧乙烷加合物、油脂的环氧乙烷加合物、聚亚烷基二醇环氧乙烷加合物等。其中，优选聚亚烷基二醇环氧乙烷加合物。具体而言，可举出聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇、聚氧乙烯(196)聚氧丙烯(67)二醇等。
表面活性剂的使用量相对于复合体形成反应液的总量，优选为0.005～10％(w/v)，更优选为0.015～3.5％(w/v)。
另外，复合体形成工序中的反应温度优选为2～42℃的范围内，更优选为3～40℃的范围内，特别优选为4～37℃的范围内。本发明的分离方法中的复合体形成工序即便在常温或常温附近也选择性且高效地进行反应，因此非常简便。另外，反应时间通常为1分钟～48小时，优选为5分钟～24小时，更优选为10分钟～10小时，特别优选为10分钟～5小时。
复合体形成工序中，体系中的pH没有特别限定，但优选为pH5～10的范围，更优选为pH6～8的范围。为了维持目标pH，通常使用缓冲液。作为缓冲液，例如可举出磷酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等。
(清洗工序)
清洗工序是对上述复合体形成工序中形成的囊泡与固相载体的复合体加入清洗液而形成清洗工序液、对上述复合体进行清洗的工序。由此，除去未反应的成分、未反应的标记物质等。可以直接对复合体形成工序中的含有复合体的体系进行清洗。
上述清洗工序通常根据固相载体的形状分为两种。如磁性粒子那样固相载体为粒子状时，例如可举出使磁性粒子分散在清洗液中进行清洗的方法，另一方面，固相载体为微孔板那样的形态时，可举出使清洗液接触其表面进行清洗的方法。无论是哪一种状态，本发明中，作为清洗液，优选使用含有表面活性剂的清洗液。作为表面活性剂，优选与可以在上述复合体形成工序中使用的表面活性剂同样的表面活性剂。
另外，固相载体为磁性粒子时，作为清洗工序，优选包含：利用磁力集中磁性粒子而将磁性粒子与液相分离的集磁工序以及使在该集磁工序中所分离的磁性粒子分散在清洗液中的分散工序。由此，能够进一步高效地从磁性粒子表面清洗·分离除去未反应的物质、生物体试样中的夹杂物。
具体而言，只要通过如下操作进行即可：使磁场作用于反应容器，使磁性粒子附着于反应容器壁而集中后，除去反应上清液，进一步根据需要加入清洗液，同样地使磁场作用后除去上清液，重复上述操作。作为清洗液，优选含有上述复合体形成工序中举出的表面活性剂和缓冲液的清洗液。
(反应液的盐浓度)
本发明的分离方法中，优选在盐浓度0.15～2M的环境下进行复合体形成工序和清洗工序中的至少任一工序。即，优选在使复合体形成反应液的盐浓度和清洗工序液的盐浓度中的至少任一浓度为0.15～2M的环境下进行。进而，从捕捉反应的反应性的观点考虑，优选在盐浓度0.15～2M的环境下进行复合体形成工序。对于反应液的盐浓度，只要在复合体形成工序的整体或一部分、或者清洗工序的整体或一部分为0.15～2M的范围即可。
反应液的盐浓度更优选为0.2M以上，进一步优选为0.25M以上，另外，更优选为1M以下，进一步优选为0.5M以下，特别优选为0.45M以下，最优选为0.35M以下。
作为反应液中含有的无机盐，可举出碱金属卤化物；碳酸盐、碳酸氢盐等无机酸的盐，优选碱金属卤化物，更优选碱金属氯化物。作为无机盐，具体而言，可举出氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸钠、碳酸氢钠等，其中可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。其中，优选氯化钠、氯化钾、氯化钙，更优选氯化钠、氯化钾，特别优选氯化钠。
作为反应液中含有的有机盐，优选有机酸的盐，更优选有机酸的碱金属盐，进一步优选羧酸的碱金属盐，特别优选羧酸的钠盐。作为有机盐，具体而言，可举出乙酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、苹果酸钠、琥珀酸钠、乳酸钠等，其中，可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
反应液的盐浓度小于0.15M时和高于2M时，存在产生非特异性吸附的增大、捕捉反应的反应性的降低的情况，另外，还存在因囊泡内外的浸透压差而破坏囊泡的情况。
(解离工序)
本发明的分离方法在清洗工序后，还可以具有将被捕捉的囊泡从配体解离的解离工序。
配体为特定的抗体时，作为将抗原·抗体反应所致的异常性结合解离的条件，已知有利用亲和层析等进行的各种解离(例如，参照“Afinity Chromatography principles&methods”Pharmacia LKB Biotechnology)。上述解离工序可以据此进行。即，作为本发明中使用的解离液，可举出盐酸、硫酸、丙酸、乙酸、甘氨酸/盐酸缓冲液等酸性溶液；氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氨水溶液、二乙胺等碱性溶液；3M氯化钠水溶液、4.5M氯化镁水溶液等高离子强度溶液；含有SDS、TritonX-100、Tween20等表面活性剂的溶液；含有二烷、乙二醇等降低极性的物质的缓冲液；含有三氯乙酸、硫氰酸等离液离子以及脲、盐酸胍等的缓冲液。
〔核酸的检测方法和蛋白质的检测方法〕
本发明的囊泡中的核酸的检测方法在上述分离方法之后，进一步包含对囊泡中的核酸进行检测的核酸检测工序。
另外，本发明的来自囊泡的蛋白质的检测方法在上述分离方法之后，进一步包含对存在于囊泡的内侧和表面的至少一方的蛋白质进行检测的蛋白质检测工序。
这些检测方法除进行上述分离方法以外，只要依照常规方法进行即可。上述具有脂质双层膜的囊泡为外来体时，可以根据PCR法、电泳法、Western印迹法、免疫化学的方法、流式细胞技术等公知的方法从回收的外来体中检测核酸、蛋白质。其中，从能够简便且灵敏度好地检测且能够维持天然形式的立体结构的方面考虑，优选流式细胞技术。另外，作为核酸，可举出miRNA、mRNA等。
特别是，外来体由各种细胞例如免疫系统的细胞、各种癌细胞分泌，因此，根据本发明的核酸的检测方法，检测来自外来体的核酸(miRNA等)，对其进行解析，由此能够进行生理现象、各种疾病的判定。
〔信号测定方法〕
本发明的来自囊泡的信号测定方法在上述分离方法之后，进一步包含对来自形成有上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的信号测定工序。
上述信号强度的测定只要通过免疫测定法进行即可，例如可举出酶免疫测定法(EIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、放射线免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、免疫印迹法、Western印迹法、流式细胞技术等。其中，从能够简便且灵敏度好地检测且能够维持天然形式的立体结构的方面考虑，优选流式细胞技术。另外，从能够简便且灵敏度好地检测抗体的方面考虑，优选ELISA法。作为ELISA法，可举出竞争法、夹心法等。另外，从检测灵敏度的方面考虑，还优选发光免疫测定法。发光免疫测定法例如可以通过使FUJIREBIO公司制的III级系列(Class III Series)等市售的发光底物反应，使用Promega公司制的GloMax等发光测定仪来测定发光免疫测定法中的信号强度即发光强度而进行。
这里，示出使用夹心ELISA法时的分离方法的一个例子。首先，将识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体与固相载体结合后，接触含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样而形成复合体，其后进行清洗。向其中添加对单克隆抗体或其抗体断片、疾病特异性膜蛋白质抗体或其抗体断片进行了修饰的标记抗体，形成更进一步的复合体。然后，通过对形成的复合体中的标记量进行检测，能够测定来自生物体试样中含有的囊泡的信号量、生物体试样中含有的疾病异常性囊泡量。
〔疾病的判定方法〕
用于判定本发明的被检者是否患有疾病的方法的特征在于，包含使用来自被检者的生物体试样、利用上述信号测定方法对来自形成有上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序(以下，也称为工序(I))。
然后，将工序(I)中测定的信号强度与来自对照者的生物体试样的信号强度进行对比，确认到被检者的信号强度比对照者的信号强度强时，可以判定为被检者患有疾病(以下，也称为工序(II))。
作为可以用本发明的疾病的判定方法判定的疾病，可例示癌症疾病(大肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、肾癌、皮肤癌等)、炎症类疾病(风湿病、骨关节炎、肾脏疾病、胰腺炎、肝炎、过敏等)、阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病、脑部疾病、免疫缺陷相关的疾病、不孕症、抑郁症、自闭症等精神疾病、帕金森氏病等难治性疾病、自身免疫性疾病、循环系统疾病、血液病、消化系统疾病、伴随衰老的疾病、感染症等。其中，对癌症疾病、免疫系统疾病的判定有用，特别是对癌症疾病的判定特别有用。
另外，如果应用于细胞障碍性T细胞(CTL)的免疫活性的指标，则也能够应用于癌症疫苗对癌症疾病的效果判定。
工序(I)除通过上述信号测定方法进行测定以外，只要依照常规方法进行即可。
另外，工序(II)针对工序(I)中测定的信号强度，基于来自对照者的生物体试样的信号进行统计学解析来进行比较。解析方法没有特别限定，可以使用公知的方法。另外，对于其后的判定，例如来自被检者的生物体试样的信号被对照者的信号强时，判断为患有疾病的可能性高。应予说明，本发明中，对照者是指未患有疾病的与被检者同年龄·同性别的人的平均，对照者的信号强度可以与被检者的信号强度一起进行测定，也可以使用由另外预先测定的值得到的统计值。
〔疾病治疗药的药效评价方法〕
本发明的疾病治疗药的药效评价方法的特征在于，包含使用疾病治疗药给予前和给予后的来自被检者的生物体试样、利用上述信号测定方法对来自形成有复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序(以下，也称为工序(A))。
然后，确认到疾病治疗药给予后的来自被检者的生物体试样中的来自复合体的信号强度比疾病治疗药给予前的来自被检者的生物体试样中的来自复合体的信号强度弱时，可以判定疾病治疗药显示药效的可能性高(以下，也称为工序(B))。
作为上述疾病治疗药，可举出对可用上述判定方法判定的疾病进行治疗的药物。适合的具体例是抗癌剂、抗免疫系统疾病药。
工序(A)除用上述信号测定方法进行测定以外，只要依照常规方法进行即可。
另外，工序(B)针对工序(A)中测定的信号强度，基于疾病治疗药给予前的生物体试样中的信号进行统计学解析来进行比较。解析方法没有特别限定，可以使用公知的方法。另外，对于其后的判定，例如疾病治疗药给予后的生物体试样中的信号量比给予前的生物体试样中的信号量少时，判断为该药具有抑制疾病的效果的可能性高。
特别是，外来体由各种的细胞例如免疫系统的细胞、各种癌细胞所分泌，因此认为通过测定在疾病治疗药的给予前后的血中外来体的变化(除了存在量的增减，还包括膜蛋白质的量的变动)，能够对患者中的药效进行评价。另外，认为例如如果组合针对癌细胞特异性膜蛋白质的配体和针外来体的表面抗原的配体，则能够期待癌症诊断的特异性的提高、癌症种类的确定等，能够进一步开发对癌症疾病特异性的诊断药。
〔试剂盒〕
本发明的试剂盒的特征在于，具备固相载体和液态组合物，所述固相载体结合有配体，所述配体识别存在于具有脂质双层膜的囊泡表面的表面抗原，所述液态组合物具有0.15M以上的盐浓度。这样的试剂盒对上述分离方法、上述疾病的判定、上述疾病治疗药的药效评价有用。
作为固相载体、液态组合物中含有的无机盐或有机盐，可举出与上述分离方法中使用的物质同样的物质。
上述液态组合物中的盐浓度优选为0.3M以上，更优选为0.4M以上，进一步优选为0.5M以上，另外，优选为4M以下，更优选为2M以下，进一步优选为1M以下，进一步优选0.9M以下，特别优选0.7M以下。
另外，液态组合物可以含有与上述分离方法同样的表面活性剂。另外，液态组合物的pH没有特别限定，优选为pH5～10的范围，更优选为pH6～8的范围。为了维持目标pH，通常使用缓冲液，例如可举出磷酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等。
〔液态组合物，检体稀释液〕
本发明的液态组合物在包含复合体形成工序和清洗工序的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法中使用，用于在上述复合体形成工序和上述清洗工序中的至少任一工序中添加，所述复合体形成工序使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体进行接触，形成上述囊泡与上述固相载体的复合体，所述配体识别存在于上述囊泡表面的表面抗原，上述清洗工序清洗上述复合体，所述液态组合物具有0.15M以上的盐浓度。另外，本发明的检体稀释液的特征在于，在使用不溶性载体从含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样中分离具有脂质双层膜的囊泡的方法中使用，用于形成上述囊泡与上述不溶性载体的复合体，所述检体稀释液具有0.15M以上的盐浓度。
[实施例]
以下，举出具体例对本发明进行详细说明，但本发明不限定于这些具体例。
(缓冲液类的制备)
准备表1所示的比较反应缓冲液1和反应缓冲液1～5。
反应缓冲液：在Tris缓冲生理食盐水(TBS(组成为1370mmol/L NaCl、26.8mmol/L KCl、250mmol/L Tris；将Sigma公司的10×TBS用水稀释10倍而得到的溶液。pH7.4。以下相同))中以成为0.03％(w/v)的方式添加作为非离子性表面活性剂的聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇(gibco公司制的Pluronic F-68，以下相同)，进一步根据需要以成为表1所示的浓度的方式添加氯化钠(Wako公司制，特级试剂)而成的缓冲液。
[表1]
作为对照缓冲液，准备以下的缓冲液。
对照缓冲液：在TBS中以浓度为0.03％(w/v)的方式添加作为非离子性表面活性剂的聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇而成的缓冲液。pH7.4。
(检体的制备)
检体1(HT29sup.in Control Buffer)：在对照缓冲液中以稀释20倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液(低分子的盐未浓缩。以下相同。)而成的检体。
检体2(Serum)：混合血清(KOHJIN-BIO公司制)。
检体3(HT29sup.in Serum)：在混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中以浓缩20倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体4(Plasma)：混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)。
检体5(HT29sup.in Plasma)：在混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)中以稀释20倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体6(HT29sup.in Control Buffer)：在试验例1中制作的对照缓冲液中以稀释100倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体7(Serum)：混合血清(KOHJIN-BIO公司制)。
检体8(HT29sup.in Serum)：在混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中以稀释100倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体9(HT29sup.spike Control Buffer)：在试验例1中制作的对照缓冲液中以稀释100倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体10(Serum)：混合血清(KOHJIN-BIO公司制)。
检体11(HT29sup.spike Serum)：在混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中以稀释100倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体12(Plasma(Heparin))：混合肝素血浆(KOHJIN-BIO公司制)。
检体13(HT29sup.spike Plasma(Heparin))：在混合肝素血浆(KOHJIN-BIO公司制)中以稀释100倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体14(Plasma(EDTA))：混合EDTA血浆(KOHJIN-BIO公司制)。
检体15(HT29sup.spike Plasma(EDTA))：在混合EDTA血浆(KOHJIN-BIO公司制)中以稀释100倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体16(Plasma(Citrate))：混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)。
检体17(HT29sup.spike Plasma(Citrate))：在混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)中以稀释100倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体18(HT29sup.spike Serum)：在混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中以稀释10倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
检体19(HT29sup.spike Plasma(Heparin))：在混合肝素血浆(KOHJIN-BIO公司制)以稀释10倍的方式添加HT29细胞培养上清液100倍浓缩液而成的检体。
(抗体结合粒子的制备)
阴性对照粒子：使抗小鼠IgG抗体(JSR Life Sciences公司制，以下相同)与磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl，以下相同。)结合而成的粒子。阴性对照粒子不与外来体反应。
抗CD9抗体结合磁性粒子：使CD9抗体(Abcam公司制ab2215，以下相同)与磁性粒子结合而成的粒子。
抗CD63抗体结合磁性粒子：使CD63抗体(JSR Life Sciences公司制)与磁性粒子结合而成的粒子。
抗CD81抗体结合磁性粒子：使抗CD81抗体(Clone M38，Abnova MAB6435)与磁性粒子结合而成的粒子。
抗EpCAM抗体结合磁性粒子：使抗EpCAM抗体(JSR Life Sciences公司制)与磁性粒子结合而成的粒子。
复合(composite)抗体结合磁性粒子：将抗CD9抗体结合磁性粒子、抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子和抗EpCAM抗体结合磁性粒子以1：1：1：1混合而成的粒子。
(试验例1)
向96孔白色板(Corning公司制#23711007)中加入阴性对照粒子0.0125mg，向各孔中以每1个孔各1种的方式添加对照缓冲液、检体1～5各25μL。以反应液的盐浓度为0.07M的方式加入比较反应缓冲液1，在25℃下反应20分钟(pH：7.4)。另外，分别使用反应缓冲液1～5代替比较反应缓冲液1，进行同样的反应。
在本说明书的所有试验例中，使用各反应缓冲液时的反应液的盐浓度如下。
接下来，使用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS。以下相同)对反应后的阴性对照粒子进行清洗，添加用含有1质量％的BSA的TBS稀释了的碱性磷酸酶(以下为ALP)标记抗CD81抗体(0.1μg/mL)50μL，在25℃下反应20分钟。用与上述同样的清洗缓冲液清洗后，添加发光底物(FUJIREBIO公司制的III级系列lumipuls底物溶液)50μL，在5分钟后使用发光测定仪(Promega公司制的GloMax)测定发光强度。将结果示于图1-1、图1-2。
如图1-1、图1-2所示，反应液的盐浓度为0.07M时，检测到认为由检体成分的非特异性吸附所引起的背景信号，但反应液的盐浓度为0.15～0.35M时，非特异性吸附减少，背景信号减少。
(试验例2-1)
将该抗CD9抗体结合磁性粒子、含有外来体的临床检体和比较反应缓冲液1或反应缓冲液1～5中的任一者混合，清洗后，与试验例1同样地检测由ELISA捕捉到的外来体，由此对使用比较反应缓冲液1或反应缓冲液1～5时的反应性进行评价。
向2mL的蛋白低吸附管(Protein LoBind tube)(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方式添加检体6～8(检体6：0.1mL，检体7：0.1mL，检体8：0.1mL)。以反应液的盐浓度为0.07M的方式加入比较反应缓冲液1，在25℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，分别使用反应缓冲液1～5代替比较反应缓冲液1，进行同样的反应。
接下来，用清洗/稀释缓冲液(Washing/Dilution Buffer，JSR Life Sciences公司制)0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。与试验例1同样地进行利用清洗缓冲液的清洗、与ALP标记抗CD81抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗后，测定发光强度。将结果示于图2-1。
如图2-1所示，可知反应液的盐浓度为0.15～0.35M时，血清中的捕捉反应的反应性提高。
(试验例2-2)
将捕捉反应的反应条件从25℃20分钟变更为4℃5小时，进行与试验例2-1同样的试验。
向2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方式添加检体6～8各0.1mL。以反应液的盐浓度为0.07M的方式加入比较反应缓冲液1，在4℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，使用反应缓冲液3代替比较反应缓冲液1，进行同样的反应。
接下来，用清洗缓冲液0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。与试验例1同样地进行利用清洗缓冲液的清洗、与ALP标记抗CD81抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗后，测定发光强度。将结果示于图2-2。应予说明，在图2-2中也一起示出反应温度25℃下进行的试验结果。
根据试验例2-2的结果(图2-2)，可知反应液的盐浓度为0.25M时，即便反应温度为4℃、25℃中的任一温度，血清中的捕捉反应的反应性均良好。
(试验例3)
变更检体来确认反应缓冲液3的非特异性吸附减少作用。
向2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入阴性对照粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方式添加检体9～17各0.1mL。以反应液的盐浓度为0.07M的方式加入比较反应缓冲液1，在25℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，使用等量的反应缓冲液3代替比较反应缓冲液1，进行同样的反应。
接下来，用清洗缓冲液0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。与试验例1同样地进行利用清洗缓冲液的清洗、与ALP标记抗CD81抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗后，测定发光强度。
如图3所示，反应液的盐浓度为0.25M时，无论检体的种类，背景信号均少。
(试验例4)
变更检体来确认反应缓冲液3的反应性提高作用。以下示出具体的步骤。
向2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方式添加检体9～13各0.1mL。以盐浓度为0.07M的方式加入比较反应缓冲液1，在25℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，使用反应缓冲液3代替比较反应缓冲液1，进行同样的反应。
接下来，用清洗缓冲液0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。与试验例1同样地进行利用清洗缓冲液的清洗、与ALP标记抗CD81抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗后，测定发光强度。将结果示于图4。
如图4所示，盐浓度为0.25M时，无论检体的种类，捕捉反应的反应性均高。
(试验例5)
将抗CD9抗体结合磁性粒子变更为抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子、抗EpCAM抗体结合磁性粒子，使用检体10～13作为检体，除此以外，与试验例4同样地进行反应缓冲液3的反应性提高作用的研究。将结果示于图5-1(抗CD63抗体结合磁性粒子)、图5-2(抗CD81抗体结合磁性粒子)、图5-3(抗EpCAM抗体结合磁性粒子)。
(试验例6囊泡中的核酸的检测)
准备12支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管1～12。向管1～4中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向管5～8中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.5mg，向管9～12中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子1mg。
接着，向管1～12中以反应液的盐浓度为0.25M的方式加入反应缓冲液3，进一步各加入1mL的检体10。管1、5、9在25℃下反应1小时，管2、6、10在25℃下反应5小时，管3、7、11在25℃下反应24小时，管4、8、12在4℃下反应24小时。
接下来，将反应后的各粒子用清洗缓冲液0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中。使用集磁架将抗体结合磁性粒子集磁后，抽取上清液0.4mL，从残留的抗体结合粒子液0.1mL中回收microRNA进行定量。将结果示于图6。
应予说明，microRNA的回收使用ExoCapTM核酸洗脱缓冲液(Nucleic Acid Elution Buffer，MBL公司制，#MEX-E)。另外，microRNA(miR-21)的定量使用TaqMan MicroRNAReverse Transcription Kit(Life technologies公司制，#4366597)、TaqMan MicroRNA Assays(Life technologies公司制，#186948384)、TaqMan Universal Master Mix II、no UNG(Life technologies公司制，#4440040)，操作依照推荐实验方案。
如图6所示，通过在反应液的盐浓度0.25M环境下反应，能够对来自健康人血清的囊泡中的核酸进行检测。进而，检测到的核酸量依赖于抗体结合粒子量、温度、时间而上升。
(试验例7囊泡中的核酸的检测)
准备8支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管13～20。向管13～14中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子1mg，向管15～16中各加入抗CD63抗体结合磁性粒子1mg，向管17～18中各加入抗CD81抗体结合磁性粒子1mg，向管19～20中各加入复合抗体结合磁性粒子(将抗CD9抗体结合磁性粒子、抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子和抗EpCAM抗体结合磁性粒子以1：1：1：1混合而成的物质)1mg。
接下来，向管13～20中以反应液的盐浓度为0.25M的方式添加反应缓冲液3。向奇数编号的管中各加入0.3mL的试验例3中示出的检体10，向偶数编号的管中各加入0.3mL的试验例3中示出的检体12，在25℃下反应24小时。
接下来，将反应后的各粒子用清洗缓冲液0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)。使用集磁架将抗体结合磁性粒子集磁后，抽取上清液0.4mL，从残留的抗体结合粒子液0.1mL中回收microRNA进行定量。将结果示于图7-1、图7-2。
应予说明，microRNA的回收使用miRNeasy Serum/Plasma Kit(50)(QIAGEN公司制，#217184)。另外，microRNA(miR-21)的定量与试验例6的情况同样地进行。
另外，作为比较对象，利用作为回收外来体的标准方法的超速离心分离法进行囊泡中的核酸的检测。即，分别对检体10、12各11mL使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)，以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入11mL的磷酸缓冲生理食盐水(以下，也称为“PBS”)，进行悬浮。再次使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)，以100000rpm、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入0.11mL的PBS，进行悬浮。将悬浮液中的3μL用于microRNA的回收、定量。将结果示于图7-1、图7-2。
应予说明，microRNA的回收、microRNA(miR-21)的定量与上述同样地进行。
如图7-1所示，确认了通过在反应液的盐浓度0.25M环境下反应，能够以与超速离心分离法同等的水平检测来自健康人血清的囊泡中的核酸。
如图7-2所示，来自健康人肝素血浆的囊泡中的核酸在利用超速离心分离法时无法检测到。认为健康人肝素血浆一般含有引起PCR抑制的物质，认为是由于在利用超速离心分离法回收的样品中残留抑制PCR的物质。与此相对，在反应液的盐浓度0.25M的环境下反应时能够检测到来自健康人肝素血浆的囊泡中的核酸。
根据这些结果，可知通过在反应液的盐浓度0.25M的环境下使囊泡与粒子反应，无论血清、血浆这样的检体的种类，均能够检测到囊泡中的核酸。
(试验例8囊泡表面的蛋白质的检测)
准备10支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管21～30。如下向各管中各加入磁性粒子0.2mg。
接下来，向管21～30中以反应液的盐浓度为0.25M的方式添加反应缓冲液3。向奇数编号的管中各加入1.0mL的试验例3中示出的检体10，向偶数编号的管中各加入1.0mL的试验例3中示出的检体12，在25℃下反应3小时。
接下来，将反应后的各粒子用清洗缓冲液0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中。
接着进行集磁并将清洗液废弃后，将抗体结合磁性粒子在1×样品缓冲液20μL中悬浮，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液清洗。
与试验例8同样地，进行与一次抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗，使发光底物反应，利用发光测定仪来确认Western印迹图像。将结果示于图8-1、图8-2。
另外，作为比较对象，利用作为回收外来体的标准方法的超速离心分离法进行囊泡表面的蛋白质的检测。即，对检体10、12各11mL使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入11mL的PBS，进行悬浮。再次使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入0.11mL的PBS，进行悬浮。对悬浮液中的10μL添加4×样品缓冲液5μL、PBS 5μL，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液清洗。
与试验例8同样地进行与一次抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗，使发光底物反应，利用发光测定仪来确认Western印迹图像。将结果示于图8-1、图8-2。
如图8-1、图8-2所示，确认了通过在反应液的盐浓度0.25M的环境下使囊泡与粒子反应，能够以与超速离心分离法同等的水平检测来自健康人血清、健康人肝素血浆的囊泡表面的蛋白质。另外，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子时，检测不到囊泡表面蛋白质。认为EpCAM蛋白质在健康人的血液中几乎不存在，因癌症等疾病而使其血中浓度上升。通过在反应液的盐浓度0.25M的环境下使囊泡与粒子反应，能够抑制非特异性反应。
(试验例9-1囊泡表面的维持了天然形式的立体结构的蛋白质的检测(1))
准备8支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管31～38。如下向各管中各加入磁性粒子0.1mg。
将反应缓冲液3以反应液的盐浓度为0.25M的方式添加到管31～38中。
接下来，向管31、33、35、37中添加0.3mL的试验例3中示出的检体10，在25℃下反应一晚。另外，向管32、34、36、38中添加0.3mL的试验例3中示出的检体12，在25℃下反应一晚。
接下来，将反应后的各粒子用清洗缓冲液0.25mL清洗2次，集磁后，除去上清液，悬浮在磷酸缓冲生理食盐水1mL中。
准备40支与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管39～78。如下将管31～38的悬浮液分注各0.1mL。
将管31的悬浮液向管39～43分注。
将管32的悬浮液向管44～48分注。
将管33的悬浮液向管49～53分注。
将管34的悬浮液向管54～58分注。
将管35的悬浮液向管59～63分注。
将管36的悬浮液向管64～68分注。
将管37的悬浮液向管69～73分注。
将管38的悬浮液向管74～78分注。
接着，如下向各管中分别添加抗体各5μL。
这里，
PE抗小鼠IgG：藻红蛋白(以下为PE)标记抗小鼠IgG抗体(SONY公司制)
PE抗CD9：PE标记抗CD9抗体(SONY公司制)
PE抗CD63：PE标记抗CD63抗体(SONY公司制)
PE抗CD81：PE标记抗CD81抗体(SONY公司制)
PE抗EpCAM：PE标记抗EpCAM抗体(SONY公司制)
其后，将管39～78在25℃、1000rpm的条件下悬浮1小时。
接下来，将反应后的各粒子用磷酸缓冲生理食盐水0.5mL清洗2次后，使用流式细胞仪(BD公司制，BD Accuri C6)来确认各样品的荧光信号。将结果示于图9-1、图9-2。
如图9-1、图9-2所示，通过在反应液的盐浓度0.25M的环境下使囊泡与粒子反应，能够检测到来自健康人血清、健康人肝素血浆的囊泡表面的CD9、CD63、CD81。
另外，使用抗CD9抗体结合磁性粒子、抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子时，将认为因癌变而表达的EpCAM以抗EpCAM抗体检测到的峰与作为对照的抗小鼠IgG抗体相比，未进行峰移位。认为从健康人的检体中检测不到。
进而，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，以抗小鼠IgG抗体检测到的峰和以抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗EpCAM抗体检测到的峰几乎没有变化。即，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，由健康人的检体得不到外来体。认为非特异性吸附低。
另外，认为在解析中使用的样品未进行改变蛋白质的立体结构的热、药剂等的处理，能够检测到存在于囊泡表面的天然形式的CD9、CD63、CD81。
(试验例9-2囊泡表面的维持了天然形式的立体结构的蛋白质的检测(2))
在试验之前，准备以下示出的检体18、19。
准备8支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管79～86。向管79、80中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向管81、82中加入抗CD63抗体结合磁性粒子0.1mg，向管83、84中加入抗CD81抗体结合磁性粒子0.1mg，向管85、86中加入抗EpCAM抗体结合磁性粒子0.1mg。将反应缓冲液3以反应液的盐浓度为0.25M的方式添加到管79～86中。
接下来，向管79、81、83、85中添加0.3mL的检体18，在25℃下反应一晚。另外，向管80、82、84、86中添加0.3mL的检体19，在25℃下反应一晚。
接下来，将反应后的各粒子用清洗缓冲液0.25mL清洗2次，集磁后，除去上清液，悬浮在磷酸缓冲生理食盐水1mL中。
准备40支与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管87～126。如下将管79～86的悬浮液分注各0.1mL。
将管79的悬浮液向管87～91分注。
将管80的悬浮液向管92～96分注。
将管81的悬浮液向管97～101分注。
将管82的悬浮液向管102～106分注。
将管83的悬浮液向管107～111分注。
将管84的悬浮液向管112～116分注。
将管85的悬浮液向管117～121分注。
将管86的悬浮液向管122～126分注。
接着，如下向各管中分别添加抗体各5μL。
其后，将管87～126在25℃、1000rpm的条件下悬浮1小时。
接下来，将反应后的各粒子用磷酸缓冲生理食盐水0.5mL清洗2次后，使用流式细胞仪(BD公司制，BD Accuri C6)来确认各样品的荧光信号。将结果示于图9-3、图9-4。
如图9-3、图9-4所示，通过在反应液的盐浓度0.25M的环境下使囊泡与粒子反应，能够检测到存在于来自健康人血清、健康人肝素血浆、人结肠癌HT29细胞的囊泡表面的CD9、CD63、CD81。
另外，对于将认为因癌变而表达的EpCAM以抗EpCAM抗体检测到的峰，与作为对照的抗小鼠IgG抗体相比，观察到了峰移位。在样品仅使用健康人检体的图9-1、图9-2中未确认到该峰移位，因此，认为能够利用本发明来判定疾病。
进而，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，以抗小鼠IgG抗体检测到的峰和以抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗EpCAM抗体检测到的峰几乎没有变化。即，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，由健康人的检体得不到外来体。认为非特异性吸附低。
另外，认为在解析中使用的样品未进行改变蛋白质的立体结构的热、药剂等的处理，能够检测到存在于囊泡表面的天然形式的CD9、CD63、CD81。
(试验例10)
准备20支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管127～146。如下向各管中加入磁性粒子各0.2mg。
接下来，向管127～146中以反应液的盐浓度为0.25M的方式添加反应缓冲液3。如下向各管中分别加入检体各0.1mL，在25℃下反应24小时。
接下来，将反应后的各粒子用清洗缓冲液0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中。
接着进行集磁并将清洗液废弃后，将抗体结合磁性粒子在1×样品缓冲液20μL中悬浮，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液清洗。
与试验例8同样地进行与一次抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗，使发光底物反应，利用发光测定仪来确认Western印迹图像。将结果示于图10-1、图10-2。
另外，作为比较对象，利用作为回收外来体的标准方法的超速离心分离法进行囊泡表面的蛋白质的检测。即，使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)分别对检体10、12、18、19各11mL以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入11mL的PBS，进行悬浮。再次使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入0.11mL的PBS，进行悬浮。对悬浮液中的1μL添加4×样品缓冲液5μL、PBS14μL，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液清洗。
与试验例8同样地进行与一次抗体的反应、利用清洗缓冲液的清洗，使发光底物反应，利用发光测定仪来确认Western印迹图像。将结果示于图10-1、图10-2。
如图10-1、图10-2所示，通过在反应液的盐浓度0.25M的环境下使囊泡与粒子反应，能够以与超速离心分离法同等或其以上的水平检测到来自健康人血清、健康人肝素血浆、人结肠癌HT29细胞的囊泡表面的蛋白质。另外，使用抗EpCAM抗体进行检测时，在健康人血清、肝素血浆中检测不到条带，它们中添加了人结肠癌HT29细胞的培养上清液时检测到条带。认为能够利用本发明来判定疾病。
〔具有脂质双层膜的囊泡的分离方法(第1分离方法)〕
本发明的第1分离方法的特征在于，包含复合体形成工序和清洗工序，所述复合体形成工序使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体接触而形成囊泡与固相载体的复合体，所述配体识别存在于囊泡表面的表面抗原，所述清洗工序清洗复合体，在终浓度0.15～2M的无机盐或有机盐的存在下进行复合体形成工序和清洗工序中的至少任一工序。这里，本说明书中终浓度(最终浓度)是指不包括来自生物体试样的无机盐(通常为0.14M左右)、有机盐的无机盐，有机盐的浓度，是复合体形成工序、清洗工序时的人为存在的体系内的无机盐或有机盐的最终浓度。无机盐或有机盐的终浓度在使用粉状、粒状等的固体物质、检体稀释液等液态组合物的任一方法中均可以进行调整。另外，终浓度的测定只要使用公知的各种测定方法、测定仪器等进行即可。
(复合体形成工序)
复合体形成工序是使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体接触，形成囊泡与固相载体的复合体的工序，所述配体识别存在于囊泡表面的表面抗原。通过上述接触，囊泡被配体捕捉，形成囊泡与固相载体的复合体。应予说明，在复合体形成工序的反应体体系中，除与上述固相载体结合的配体以外，也可以共存识别存在于具有脂质双层膜的囊泡表面的表面抗原的配体。
上述生物体试样只要是含有具有脂质双层膜的囊泡的试样就没有特别限定，例如可举出体液、菌体液、细胞培养的培养基、细胞培养上清液、组织细胞的粉碎液等各种液体。其中，优选体液、细胞培养上清液，更优选体液。作为体液，可举出全血、血清、血浆、血液成分、各种血球、血块、血小板等血液组成成分、以及尿、精液、母乳、汗、间质液、间质性淋巴液、骨髓液、组织液、唾液、胃液、关节液、胸膜液、胆汁、腹水、羊水等，优选为血液组成成分。本发明的第1分离方法即便使用这样的临床检体作为生物体试样时，对固相载体的非特异性吸附也低，捕捉反应的反应性也高，因此，根据本发明的第1分离方法，能够选择性且高效地从广泛种类的生物体试样中分离囊泡。例如，即便使用血浆作为生物体试样时，也不易发生非特异性吸附，即便使用血清作为生物体试样时，捕捉反应的反应性也高。
应予说明，血液组成成分可以用柠檬酸、肝素、EDTA等抗凝剂进行处理。
上述生物体试样可以使用预先添加到含有终浓度为0.15～2M的量的无机盐或有机盐的缓冲液组合物中等而预先进行前处理的试样，也可以直接使用从生物体采取的试样。即，根据本发明的第1分离方法，也能够不进行基于PEG沉淀法、使用超速离心机等的分离法等的前处理而简便地进行选择性分离。
另外，作为上述具有脂质双层膜的囊泡，可举出细胞、从细胞释放到细胞外放的外来体这样的囊泡，本发明的第1分离方法在囊泡为外来体的情况下特别优选使用。
另外，存在于囊泡表面的表面抗原只要是存在于囊泡表面的物质且具有抗原性，就没有特别限定。如果例举外来体的表面抗原，则可举出CD9、CD63、CD81等四跨膜蛋白类；MHCI、MHCII等抗原呈递相关蛋白；整合素、ICAM-1、EpCAM等粘接分子；EGFRvIII、TGF-β等细胞因子/细胞因子受体、酶类等。其中，优选存在于外来体表面的抗原蛋白质。
另外，在本发明的第1分离方法中使用的固相载体只要结合有识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体，就没有特别限定。
作为配体，优选识别存在于囊泡表面的表面抗原的抗体，更优选识别存在于外来体表面的表面抗原的抗体。另外，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。
上述单克隆抗体没有特别限定，可以依照公知的方法，例如K.Watanabe et al.，Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis，J.Clin.Invest.114(2004)，898-907中记载的方法制备。另外，识别外来体的表面抗原CD9、CD63、CD81等四跨膜蛋白类的单克隆抗体可以参照国际公开第2013/099925号等进行制作。
应予说明，作为上述抗体的种类，可举出IgG、IgM，优选IgG。另外，可以使用将它们低分子化的片段。例如可举出F(ab’)2、Fab’、Fab等。
作为结合上述配体的固相载体的材质，例如可举出聚苯乙烯类、聚乙烯类、聚丙烯类、聚酯类、聚(甲基)丙烯腈类、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯类、氟树脂、交联葡聚糖、多糖等高分子化合物；玻璃；金属；磁性体；含有磁性体的树脂组合物；它们的组合等。
另外，固相载体的形状没有特别限定，例如可举出托盘状、球状、粒子状、纤维状、棒状、盘状、容器状、池(セル)、微孔板、试验管等。
本发明中，从固液分离、清洗的容易性的观点考虑，优选磁性粒子。
作为上述磁性粒子，例如可举出四氧化三铁(Fe3O4)、三氧化二铁(γ-Fe2O3)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属；由钴、镍、锰等的合金构成的磁性体微粒；树脂中含有这些磁性体的磁性粒子。作为树脂，可举出疏水性聚合物、亲水性聚合物等。
其中，优选树脂中含有磁性体的磁性粒子，更优选在含有超顺磁性微粒的母粒的表面形成有聚合物层的磁性粒子。例如可举出日本特开2008-32411号公报中记载的通过在含有超顺磁性微粒的母粒的表面形成疏水性的第1聚合物层，在该第1聚合物层上形成至少在表面具有缩水甘油基的第2聚合物层，对该缩水甘油基进行化学修饰而导入了极性基团的磁性粒子。
这里，作为超顺磁性微粒，代表性的是粒径20nm以下(优选粒径5～20nm)的氧化铁系的微粒，可举出由XFe2O4(X＝Mn、Co、Ni、Mg、Cu、Li0.5Fe0.5等)表示的铁氧体、由Fe3O4表示的磁铁矿、γ-Fe2O3，从饱和磁化强且残留磁化少的方面考虑，优选含有γ-Fe2O3和Fe3O4中的任一者。
另外，用于形成上述疏水性的第1聚合物层的单体大致分为单官能性单体、交联性单体。
作为上述单官能性单体，例如可以例示苯乙烯、α-甲基苯乙烯、卤代苯乙烯等芳香族乙烯基系单体；丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸硬脂酯、甲基丙烯酸硬脂酯、丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸环己酯、丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸异冰片酯等烯键式不饱和羧酸烷基酯系单体。另外，作为上述交联性单体，可以例示乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、二季戊四醇六丙烯酸酯、二季戊四醇六甲基丙烯酸酯等多官能性(甲基)丙烯酸酯；丁二烯、异戊二烯等共轭二烯烃以及二乙烯基苯、邻苯二甲酸二烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯等。
另外，用于形成上述第2聚合物层的单体以向粒子表面导入官能团为主要目的，包括含有缩水甘油基的单体。作为含有缩水甘油基的单体的含量，在用于形成第2聚合物层的单体中，优选20质量％以上。这里，作为含有缩水甘油基的共聚性单体，可举出丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚等。
作为对第2聚合物层的缩水甘油基进行化学修饰而导入的极性基团，优选为可与配体反应的官能团，跟优选含有1个以上选自氧原子、氮原子和硫原子中的至少1种原子。其中，更优选氨基、醛基、羧基、活性酯基。特别是磁性粒子的第2聚合物层具有上述极性基团和2,3-二羟基丙基时，与配体的结合性良好。
另外，磁性粒子等固相载体可以在其表面固定具有生物素类结合部位的物质。作为具有生物素类结合部位的物质，例如可举出选自亲和素、链霉亲和素、Tamavidin和它们的衍生物中的1种或2种以上的化合物等。进而，该情况下，固相载体可以结合有抗体等，所述抗体等介由具有生物素类结合部位的物质结合有生物素类。具有生物素类结合部位的物质向固相载体的表面的固定只要通过日本专利第4716034号公报中记载的方法等公知的方法进行即可。
作为将配体与固相载体结合的方法，可使用物理吸附法、共价键法、离子键法之类的化学结合的方法等。作为物理吸附法，可举出将配体直接固定于固相载体的方法、与白蛋白等其它蛋白质进行化学结合后吸附而固定的方法等。作为化学结合的方法，可举出利用导入到固相载体表面的可与配体反应的官能团直接结合在固相载体上的方法；在固相载体与配体之间以化学键导入间隔分子(碳二亚胺化合物等)后进行结合的方法；使配体与白蛋白等其它蛋白质结合后，将该蛋白质与固相载体进行化学结合的方法等。
另外，结合有识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体可以使用市售品。例如可举出Exosome-Human CD9 Isolation Reagent(from cell culture)、Exosome-Human CD63 Isolation/Detection Reagent(from cell culture media)(均为Life technologies公司制)、CD9 Exo-Flow Capture kit、CD63 Exo-Flow Capture kit、CD81Exo-Flow Capture kit(均为SBI公司制)等。
另外，结合有上述配体的固相载体的使用量相对于生物体试样，优选为0.00001～0.1质量倍，更优选为0.0001～0.01质量倍。
对于复合体形成工序，除上述各成分以外，还可以根据需要使用表面活性剂；白蛋白等蛋白质；核酸；蔗糖等糖类等进行。
其中，从减少非特异性吸附的观点、抑制对囊泡的损伤的观点考虑，优选表面活性剂，更优选非离子性表面活性剂，特别优选聚乙二醇型非离子性表面活性剂。另外，表面活性剂优选分子中不含芳香族基团的表面活性剂。
例如可举出高级醇环氧乙烷加合物、脂肪酸环氧乙烷加合物、多元醇脂肪酸酯环氧乙烷加合物、高级烷基胺环氧乙烷加合物、脂肪酸酰胺环氧乙烷加合物、油脂的环氧乙烷加合物、聚亚烷基二醇环氧乙烷加合物等。其中，优选聚亚烷基二醇环氧乙烷加合物。具体而言，可举出聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇、聚氧乙烯(196)聚氧丙烯(67)二醇等。
表面活性剂的使用量以终浓度计，优选为0.005～10％(w/v)，更优选为0.015～3.5％(w/v)。
另外，复合体形成工序中的反应温度优选为2～42℃的范围内，更优选为15～40℃的范围内，特别优选为20～37℃的范围内。本发明的第1分离方法中的复合体形成工序即便在常温或常温附近，也选择性且高效地进行反应，因此，非常简便。另外，反应时间通常为1分钟～48小时，但优选为5分钟～24小时，更优选为10分钟～10小时，特别优选为10分钟～5小时。
复合体形成工序中，体系中的pH没有特别限定，但优选为pH5～10的范围，更优选为pH6～8的范围。为了维持目标pH，通常使用缓冲液，例如可举出磷酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等。
(清洗工序)
清洗工序是对上述复合体形成工序中形成的囊泡与固相载体的复合体进行清洗的工序。由此，除去未反应的成分、未反应的标记物质等。可以直接对复合体形成工序中的含有复合体的体系进行清洗。
上述清洗工序通常根据固相载体的形状分为两种。如磁性粒子那样固相载体为粒子状时，例如可举出使磁性粒子分散在清洗液中进行清洗的方法，另一方面，固相载体为微孔板那样的形态时，可以举出使清洗液接触其表面进行清洗的方法。不论是哪一种状态，本发明中，作为清洗液，优选使用含有表面活性剂的清洗液。作为表面活性剂，优选与可以在上述复合体形成工序中使用的表面活性剂同样的表面活性剂。
另外，固相载体为磁性粒子时，作为清洗工序，优选包含：利用磁力集中磁性粒子而使磁性粒子与液相分离的集磁工序以及使在该集磁工序中所分离的磁性粒子分散在清洗液中的分散工序。由此，能够进一步高效地从磁性粒子表面清洗·分离除去未反应的物质、生物体试样中的夹杂物。
具体而言，只要通过如下操作进行即可：使磁场作用于反应容器，使磁性粒子附着于反应容器壁而集中后，除去反应上清液，进一步根据需要加入清洗液，同样地使磁场作用后除去上清液，重复上述操作。作为清洗液，优选含有上述复合体形成工序中举出的表面活性剂和缓冲液的清洗液。
(无机盐或有机盐)
本发明的第1分离方法在终浓度0.15～2M的无机盐或有机盐的存在下进行复合体形成工序和清洗工序中的至少任一工序，但从捕捉反应的反应性的观点考虑，优选在终浓度0.15～2M的无机盐或有机盐的存在下进行复合体形成工序。另外，无机盐、有机盐中，从提高本发明的期望的效果的观点考虑，优选无机盐。
作为上述无机盐，可举出碱金属卤化物；碳酸盐、碳酸氢盐等无机酸的盐，优选碱金属卤化物，更优选碱金属氯化物。作为无机盐，具体而言，可举出氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸钠、碳酸氢钠等，其中可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。其中，优选氯化钠、氯化钾、氯化钙，更优选氯化钠、氯化钾，特别优选氯化钠。
作为上述有机盐，优选有机酸的盐，更优选有机酸的碱金属盐，进一步优选羧酸的碱金属盐，特别优选羧酸的钠盐。作为有机盐，具体而言，可举出乙酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、苹果酸钠、琥珀酸钠、乳酸钠等，其中可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。
另外，体系内的无机盐或有机盐的终浓度为0.15～2M。本说明书中规定的终浓度小于0.15M时和高于2M时，有时产生非特异性吸附的增大、捕捉反应的反应性的降低，另外，还存在因囊泡内外的浸透压差而破坏囊泡的顾虑。终浓度优选为0.175M以上，更优选为0.2M以上，特别优选为0.25M以上，另外，优选为1M以下，更优选为0.5M以下，进一步优选为0.45M以下，特别优选为0.35M以下。
(解离工序)
本发明的分离方法在清洗工序后，还可以具有将被捕捉的囊泡从配体解离的解离工序。
配体为特定的抗体时，作为将抗原·抗体反应所致的特异性结合解离的条件，已知以亲和层析等进行的各种解离(例如，参照“Afinity Chromatography principles&methods”Pharmacia LKB Biotechnology)。上述解离工序可据此进行。即，作为本发明中使用的解离液，可举出盐酸、硫酸、丙酸、乙酸、甘氨酸/盐酸缓冲液等酸性溶液；氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氨水溶液、二乙胺等碱性溶液；3M氯化钠水溶液、4.5M氯化镁水溶液等高离子强度溶液；含有SDS、TritonX-100、Tween20等表面活性剂的溶液；含有二烷、乙二醇等降低极性的物质的缓冲液；含有三氯乙酸、硫氰酸等离液离子以及脲、盐酸胍等的缓冲液。
〔核酸的检测方法和蛋白质的检测方法〕
本发明的囊泡中的核酸的检测方法在上述第1分离方法之后，进一步包含对囊泡中的核酸进行检测的核酸检测工序。
另外，本发明的来自囊泡的蛋白质的检测方法在上述第1分离方法之后，进一步包含对存在于囊泡的内侧和表面的至少一方的蛋白质进行检测的蛋白质检测工序。
这些检测方法除进行上述第1分离方法以外，只要依照常规方法进行即可。上述具有脂质双层膜的囊泡为外来体时，可以根据PCR法、电泳法、Western印迹法、免疫化学的方法、流式细胞技术等公知的方法从回收的外来体中检测核酸、蛋白质。其中，从能够简便且灵敏度好地检测且能够维持天然形式的立体结构的方面考虑，优选流式细胞技术。另外，作为核酸，可举出miRNA、mRNA等。
特别是，外来体由各种细胞，例如免疫系统的细胞、各种癌细胞分泌，因此根据本发明的核酸的检测方法，检测来自外来体的核酸(miRNA等)并对其进行解析，由此能够判定生理现象、各种疾病。
〔信号测定方法〕
本发明的来自囊泡的信号测定方法在上述第1分离方法之后，进一步包含对来自形成有上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的信号测定工序。
上述信号强度的测定只要通过免疫测定法进行即可，例如可举出酶免疫测定法(EIA)、酶联免疫分析法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、放射线免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、免疫印迹法、Western印迹法、流式细胞技术等。其中，从能够简便且灵敏度好地检测且能够维持天然形式的立体结构的方面考虑，优选流式细胞技术。另外，从能够简便且灵敏度好地检测抗体的方面考虑，优选ELISA法。作为ELISA法，可举出竞争法、夹心法等。
这里，示出使用夹心ELISA法时的分离方法的一个例子。首先，将识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体与固相载体结合后，接触含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样而形成复合体，其后进行清洗。向其中添加对单克隆抗体或其抗体断片、疾病特异性膜蛋白质抗体或其抗体断片进行了修饰的标记抗体，形成更进一步的复合体。然后，通过对形成的复合体中的标记量进行检测，能够测定来自生物体试样中含有的囊泡的信号量、生物体试样中含有的疾病特异性囊泡量。
〔疾病的判定方法〕
用于判定本发明的被检者是否患有疾病的方法的特征在于，包含使用来自被检者的生物体试样，利用上述信号测定方法对来自形成有上述复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序(以下，也称为工序(I))。
接下来，将工序(I)中测定的信号强度与来自对照者的生物体试样的信号强度进行对比，确认到被检者的信号强度比对照者的信号强度强时，可以判定为被检者患有疾病(以下，也称为工序(II))。
作为可以用本发明的疾病的判定方法判定的疾病，可例示癌症疾病(大肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、肾癌、皮肤癌等)、炎症类疾病(风湿病、骨关节炎、肾脏疾病、胰腺炎、肝炎、过敏等)、阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病、脑部疾病、免疫缺陷相关的疾病、不孕症、抑郁症、自闭症等精神疾病、帕金森氏病等难治性疾病、自身免疫性疾病、循环系统疾病、血液病、消化系统疾病、伴随衰老的疾病、感染症等。其中，对癌症疾病、免疫系统疾病的判定有用，特别是对癌症疾病的判定特别有用。
另外，如果应用于细胞障碍性T细胞(CTL)的免疫活性的指标，则也能够应用于对癌症疫苗的癌症疾病的效果判定。
工序(I)除通过上述信号测定方法进行测定以外，只要依照常规方法进行即可。
另外，工序(II)针对工序(I)中测定的信号强度，基于来自对照者的生物体试样的信号进行统计学解析来进行比较。解析方法没有特别限定，可以使用公知的方法。另外，对于其后的判定，例如，来自被检者的生物体试样的信号比对照者的信号强时，判断为患有疾病的可能性高。应予说明，本发明中，对照者是指与未患有疾病的被检者同年龄·同性别的人的平均，对照者的信号强度可以与被检者的信号强度一起进行测定，也可以使用由另外预先测定的值得到的统计值。
〔疾病治疗药的药效评价方法〕
本发明的疾病治疗药的药效评价方法的特征在于，包含使用疾病治疗药给予前和给予后的来自被检者的生物体试样，利用上述信号测定方法对来自形成有复合体的囊泡的信号强度进行测定的工序(以下，也称为工序(A))。
然后，确认到疾病治疗药给予后的来自被检者的生物体试样中的来自复合体的信号强度比疾病治疗药给予前的来自被检者的生物体试样中的来自复合体的信号强度弱时，可以判定为疾病治疗药显示药效的可能性高(以下，也称为工序(B))。
作为上述疾病治疗药，可举出对可用上述判定方法判定的疾病进行治疗的药物。适合的具体例为抗癌剂、抗免疫系统疾病药。
工序(A)除通过上述信号测定方法进行测定以外，只要依照常规方法进行即可。
另外，工序(B)针对工序(A)中测定的信号强度，基于疾病治疗药给予前的生物体试样中的信号进行统计学解析来进行比较。解析方法没有特别限定，可以使用公知的方法。另外，对于其后的判定，例如，疾病治疗药给予后的生物体试样中的信号量比给予前的生物体试样中的信号量少时，判断为该药具有抑制疾病抑制的效果的可能性高。
特别是，外来体由各种的细胞，例如免疫系统的细胞、各种癌细胞分泌，因此认为通过测定在疾病治疗药给予前后的血中外来体的变化(除了存在量的增减，还包括膜蛋白质的量的变动)，能够对患者中的药效进行评价。另外，例如，认为如果组合针对癌细胞特异性膜蛋白质的配体和针对外来体的表面抗原的配体，则能够期待癌症诊断的特异性的提高、癌症种类的确定等，能够进一步开发癌症疾病特异性诊断药。
〔试剂盒〕
本发明的试剂盒的特征在于，具备固相载体和液体组合物，所述固相载体结合有配体，所述配体识别存在于具有脂质双层膜的囊泡表面的表面抗原，所述液态组合物含有无机盐或有机盐，该无机盐或有机盐的含量为可以将体系内的终浓度调整为0.15～2M的量。这样的试剂盒对上述第1分离方法、上述疾病的判定、上述疾病治疗药的药效评价有用。
作为固相载体、液态组合物中含有的无机盐或有机盐，可举出与上述第1分离方法中使用的物质同样的物质。
上述终浓度优选为0.175M以上，更优选为0.2M以上，特别优选为0.25M以上，另外，优选为1M以下，更优选为0.5M以下，进一步优选为0.45M以下，特别优选为0.35M以下。
具体而言，液态组合物中的无机盐或有机盐的含量优选为0.3M以上，更优选为0.4M以上，进一步优选为0.5M以上，另外，优选为4M以下，更优选为2M以下，进一步优选为1M以下，进一步优选为0.9M以下，特别优选为0.7M以下。
另外，液态组合物可以含有与上述第1分离方法同样的表面活性剂。另外，液态组合物的pH没有特别限定，但优选为pH5～10的范围，更优选为pH6～8的范围。为了维持目标pH，通常使用缓冲液，例如可举出磷酸缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等。
〔液态组合物、检体稀释液和第2分离方法〕
本发明的液态组合物的特征在于，在包含复合体形成工序和清洗工序的具有脂质双层膜的囊泡的分离方法中使用，用于在上述复合体形成工序和上述清洗工序中的至少任一工序中添加，所述复合体形成工序使含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样与结合有配体的固相载体进行接触，形成上述囊泡与上述固相载体的复合体，所述配体识别存在于上述囊泡表面的表面抗原，所述清洗工序清洗上述复合体，所述液态组合物含有无机盐或有机盐，该无机盐或有机盐的含量为可以将体系内的终浓度调整为0.15～2M的量。
另外，本发明的检体稀释液的特征在于，在使用不溶性载体从含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样中分离具有脂质双层膜的囊泡的方法中使用，用于形成上述囊泡与上述不溶性载体的复合体，所述检体稀释液含有无机盐或有机盐，该无机盐或有机盐的含量为可以将体系内的终浓度调整为0.15～2M的量。
另外，本发明的第2分离方法的特征在于，是使用不溶性载体从含有具有脂质双层膜的囊泡的生物体试样中分离具有脂质双层膜的囊泡的方法，将检体稀释液添加到体系内，所述检体稀释液含有无机盐或有机盐，该无机盐或有机盐的含量为可以将体系内的终浓度调整为0.15～2M的量。
本发明的液态组合物和检体稀释液的组成、pH与上述本发明的试剂盒所具备的液态组合物同样。另外，本发明的检体稀释液可以用于使用结合有识别存在于囊泡表面的表面抗原的配体的固相载体以外的不溶性载体(例如，凝胶过滤载体、过滤器等)的囊泡分离中使用。因此，本发明的检体稀释液可以在使用各种载体的囊泡分离中利用。
[实施例]
以下，举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限定于这些实施例。
(试验例1)
将使不与外来体反应的抗小鼠IgG抗体与磁性粒子结合而成的阴性对照粒子、含有外来体的临床检体和反应缓冲液混合，清洗后，利用使用识别在外来体的膜上表达的CD81的抗体的ELISA来检测非特异性吸附于阴性对照粒子的外来体，由此确认反应缓冲液的非特异性吸附减少作用。以下示出具体的步骤。
首先，作为参考例1和实施例1～5的反应缓冲液，准备以下的反应缓冲液。
参考例1和实施例1～5的反应缓冲液：在Tris缓冲生理食盐水(TBS(将Sigma公司制的10×TBS稀释10倍，以下相同))中以浓度为0.03％(w/v)的方式添加作为非离子性表面活性剂的聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇(gibco公司制的Pluronic F-68，以下相同)，进一步以成为表2所示的浓度的方式添加作为无机盐的氯化钠(Wako公司制，特级试剂)而成的缓冲液。
[表2]
接下来，作为对照缓冲液，准备以下的缓冲液。
对照缓冲液：在TBS中以浓度为0.03％(w/v)的方式添加作为非离子性表面活性剂的聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇而成的缓冲液
另外，作为检体1～5，准备以下的检体。
检体1(HT29sup.in Control Buffer)：在对照缓冲液中将作为掺加物(スパイク)的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释20倍的方式添加而成的检体
检体2(Serum)：混合血清(KOHJIN-BIO公司制)
检体3(HT29sup.in Serum)：在混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释20倍的方式添加而成的检体
检体4(Plasma)：混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)
检体5(HT29sup.in Plasma)：在混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释20倍的方式添加而成的检体
接下来，作为阴性对照粒子，准备使抗小鼠IgG抗体(JSR Life Sciences公司制，以下相同)与磁性粒子(JSR Life Sciences公司制MS300/Carboxyl，以下相同)结合而成的粒子。
接着，向96孔白色板(Corning公司制#23711007)加入阴性对照粒子0.0125mg，向各孔中以每1个孔各1种的方式添加对照缓冲液、检体1～5各25μL。以氯化钠的终浓度为0.07M的方式加入参考例1的反应缓冲液，在25℃下反应20分钟(pH：7.4)。另外，分别使用等量的实施例1～5的反应缓冲液代替参考例1的反应缓冲液，进行同样的反应(实施例1：终浓度0.15M，实施例2：终浓度0.2M，实施例3：终浓度0.25M，实施例4：终浓度0.3M，实施例5：终浓度0.35M(实施例1～5：pH7.4))。
接下来，使用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)清洗反应后的阴性对照粒子，添加用含有1质量％的BSA的TBS稀释了的碱性磷酸酶(以下为ALP)标记抗CD81抗体(0.1μg/mL)50μL，在25℃下反应20分钟。用与上述同样的清洗缓冲液清洗后，添加发光底物(FUJIREBIO公司制的III级系列lumipuls底物溶液)50μL，在5分钟后使用发光测定仪(Promega公司制GloMax)测定发光强度。将结果示于图1-1、图1-2。
如图1-1、图1-2所示，氯化钠的终浓度为0.07M时(参考例1)，检测到认为由检体成分的非特异性吸附引起的背景信号，但氯化钠的终浓度为0.15～0.35M时(实施例1～5)，非特异性吸附减少，背景信号减少。
(试验例2-1)
准备使抗CD9抗体(Abcam公司制ab2215，以下相同)与磁性粒子结合而成的粒子(以下，也称为抗CD9抗体结合磁性粒子)，将含有该抗CD9抗体结合磁性粒子和外来体的临床检体与参考例1和实施例1～5的各反应缓冲液混合，清洗后，与试验例1同样地对利用ELISA捕捉的外来体进行检测，由此对使用参考例1和实施例1～5的各反应缓冲液时的反应性进行评价。以下示出具体的步骤。
首先，作为检体6～8，准备以下的检体。
检体6(HT29sup.in Control Buffer)：向试验例1中制作的对照缓冲液中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释100倍的方式添加而成的检体
检体7(Serum)：混合血清(KOHJIN-BIO公司制)
检体8(HT29sup.in Serum)：向混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释100倍的方式添加而成的检体
接下来，向2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方式添加检体6～8(检体6：0.1mL，检体7：0.1mL，检体8：0.1mL)。以氯化钠的终浓度为0.07M的方式加入参考例1的反应缓冲液，在25℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，分别使用等量的实施例1～5的反应缓冲液代替参考例1的反应缓冲液，进行同样的反应(实施例1：终浓度0.15M，实施例2：终浓度0.2M，实施例3：终浓度0.25M，实施例4：终浓度0.3M，实施例5：终浓度0.35M(实施例1～5：pH7.4))。
接下来，用清洗/稀释缓冲液(Washing/Dilution Buffer，JSR Life Sciences公司制)0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。在其中添加用含有1质量％的BSA的TBS稀释了的ALP标记抗CD81抗体(0.1μg/mL)50μL，在25℃下反应20分钟。使用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)清洗反应后的粒子，添加发光底物(FUJIREBIO公司制的III级系列lumipuls底物溶液)50μL，在5分钟后使用发光测定仪(Promega公司制GloMax)测定发光强度。将结果示于图2-1。
如图2-1所示，可知氯化钠的终浓度为0.15～0.35M时(实施例1～5)，血清中的捕捉反应的反应性提高。
(试验例2-2)
将捕捉反应的反应温度从25℃变更为4℃，进行与试验例2-1同样的试验。以下示出具体的步骤。
向2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方式添加检体6～8(检体6：0.1mL，检体7：0.1mL，检体8：0.1mL)。以氯化钠的终浓度为0.07M的方式加入参考例1的反应缓冲液，在4℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，使用等量的实施例3的反应缓冲液代替参考例1的反应缓冲液，进行同样的反应(实施例3：终浓度0.25M(pH：7.4))。
接下来，用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。在其中添加用含有1质量％的BSA的TBS稀释了的ALP标记抗CD81抗体(0.1μg/mL)50μL，在25℃下反应20分钟。使用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)清洗反应后的粒子，添加发光底物(FUJIREBIO公司制的III级系列lumipuls底物溶液)50μL，在5分钟后使用发光测定仪(Promega公司制GloMax)测定发光强度。将结果示于图2-2。应予说明，在图2-2中也一起示出在反应温度25℃下进行的试验结果。
根据试验例2-2的结果(图2-2)，可知氯化钠的终浓度为0.25M时(实施例3)，即便反应温度为4℃、25℃中的任一温度，在血清中的捕捉反应的反应性均良好。
(试验例3)
变更检体来确认实施例3的反应缓冲液的非特异性吸附减少作用。以下示出具体的步骤。
首先，作为检体9～17，准备以下的检体。
检体9(HT29sup.spike Control Buffer)：向试验例1中制作的对照缓冲液中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释100倍的方式添加而成的检体
检体10(Serum)：混合血清(KOHJIN-BIO公司制)
检体11(HT29sup.spike Serum)：向混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释100倍的方式添加而成的检体
检体12(Plasma(Heparin))：混合肝素血浆(KOHJIN-BIO公司制)
检体13(HT29sup.spike Plasma(Heparin))：向混合肝素血浆(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释100倍的方式添加而成的检体
检体14(Plasma(EDTA))：混合EDTA血浆(KOHJIN-BIO公司制)
检体15(HT29sup.spike Plasma(EDTA))：向混合EDTA血浆(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释100倍的方式添加而成的检体
检体16(Plasma(Citrate))：混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)
检体17(HT29sup.spike Plasma(Citrate))：向混合柠檬酸血浆(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释100倍的方式添加而成的检体
接下来，向2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入试验例1中制作的阴性对照粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方法添加检体9～17各0.1mL。以氯化钠的终浓度为0.07M的方式加入参考例1的反应缓冲液，在25℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，使用等量的实施例3的反应缓冲液代替参考例1的反应缓冲液，进行同样的反应(实施例3：终浓度0.25M(pH：7.4))。
接下来，用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。在其中添加用含有1质量％的BSA的TBS稀释了的ALP标记抗CD81抗体(0.1μg/mL)50μL，在25℃下反应20分钟。使用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)清洗反应后的粒子，添加发光底物(FUJIREBIO公司制III级系列lumipuls底物溶液)50μL，在5分钟后使用发光测定仪(Promega公司制GloMax)测定发光强度。
如图3所示，氯化钠的终浓度为0.25M时(实施例3)，无论检体的种类，背景信号均少。
(试验例4)
变更检体来确认实施例3的反应缓冲液的反应性提高作用。以下示出具体的步骤。
向2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向各管中以每1个管各1种的方式加入试验例3中示出的检体9～13各0.1mL。以氯化钠的终浓度为0.07M的方式加入参考例1的反应缓冲液，在25℃下反应5小时(pH：7.4)。另外，使用等量的实施例3的反应缓冲液代替参考例1的反应缓冲液，进行同样的反应(实施例3：终浓度0.25M(pH：7.4))。
接下来，用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.5mL清洗后，以成为0.0125mg/孔的方式分注到96孔白色板(Corning公司制#23711007)中。在其中添加用含有1质量％的BSA的TBS稀释了的ALP标记抗CD81抗体(0.1μg/mL)50μL，在25℃下反应20分钟。使用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)清洗反应后的粒子，添加发光底物(FUJIREBIO公司制的III级系列lumipuls底物溶液)50μL，在5分钟后使用发光测定仪(Promega公司制GloMax)测定发光强度。将结果示于图4。
如图4所示，氯化钠的终浓度为0.25M时(实施例3)，无论检体的种类，捕捉反应的反应性均高。
(试验例5)
分别准备使抗CD63抗体(JSR Life Sciences公司制)与磁性粒子结合而成的粒子(以下，称为抗CD63抗体结合磁性粒子)、使抗CD81抗体(Clone M38，Abnova MAB6435)与磁性粒子结合而成的粒子(以下，称为抗CD81抗体结合磁性粒子)、使抗EpCAM抗体(JSR Life Sciences公司制)与磁性粒子结合而成的粒子(以下，称为抗EpCAM抗体结合磁性粒子)。
将抗CD9抗体结合磁性粒子变更为抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子、抗EpCAM抗体结合磁性粒子，使用在试验例3中示出的检体10～13作为检体，除此以外，与试验例4同样地进行实施例3的反应缓冲液的反应性提高作用的研究。将结果示于图5-1(抗CD63抗体结合磁性粒子)、图5-2(抗CD81抗体结合磁性粒子)、图5-3(抗EpCAM抗体结合磁性粒子)。
(试验例6囊泡中的核酸的检测)
准备12支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管1～12。向管1～4中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向管5～8中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.5mg，向管9～12中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子1mg。
接下来，向管1～12中以氯化钠的终浓度为0.25M的方式各加入实施例3的反应缓冲液1mL，进一步各加入1mL的试验例3中示出的检体10。管1、5、9在25℃下反应1小时，管2、6、10在25℃下反应5小时，管3、7、11在25℃下反应24小时，管4、8、12在4℃下反应24小时。
接着，将反应后的各粒子用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中。使用集磁架将抗体结合磁性粒子集磁后，抽取上清液0.4mL，从残留的抗体结合粒子液0.1mL中回收microRNA进行定量。将结果示于图6。
应予说明，microRNA的回收使用ExoCapTM Nucleic Acid Elution Buffer(MBL公司制，#MEX-E)。另外，microRNA(miR-21)的定量使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Life technologies公司制，#4366597)、TaqMan MicroRNA Assays(Life technologies公司制，#186948384)、TaqMan Universal Master Mix II，no UNG(Life technologies公司制，#4440040)，操作依照推荐实验方案。
如图6所示，通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下进行反应，能够检测来自健康人血清的囊泡中的核酸。进一步确认了检测到的核酸量依赖于抗体结合粒子量、温度、时间而上升。
(试验例7囊泡中的核酸的检测)
准备8支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管13～20。向管13～14中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子1mg，向管15～16中各加入抗CD63抗体结合磁性粒子1mg，向管17～18中各加入抗CD81抗体结合磁性粒子1mg，向管19～20中各加入复合抗体结合磁性粒子(将抗CD9抗体结合磁性粒子、抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子和抗EpCAM抗体结合磁性粒子以1：1：1：1混合而成的物质)1mg。
接下来，向管13～20中以氯化钠的终浓度为0.25M的方式添加实施例3的反应缓冲液各0.3mL。向奇数编号的管中各加入0.3mL的试验例3中示出的检体10，向偶数编号的管中各加入0.3mL的试验例3中示出的检体12，在25℃下反应24小时。
接着，将反应后的各粒子用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中。使用集磁架将抗体结合磁性粒子集磁后，抽取上清液0.4mL，从残留的抗体结合粒子液0.1mL中回收microRNA进行定量。将结果示于图7-1、图7-2。
应予说明，microRNA的回收使用miRNeasy Serum/Plasma Kit(50)(QIAGEN公司制，#217184)。另外，microRNA(miR-21)的定量使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Life technologies公司制，#4366597)、TaqMan MicroRNA Assays(Life technologies公司制，#186948384)、TaqMan Universal Master Mix II，no UNG(Life technologies公司制，#4440040)，操作依照推荐实验方案。
另外，作为比较对象，利用作为回收外来体的标准方法的超速离心分离法进行囊泡中的核酸的检测。即，使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)分别对试验例3中示出的检体10、12各11mL以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入11mL的PBS，进行悬浮。再次使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)，以100000rpm、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入0.11mL的PBS，进行悬浮。将悬浮液中的3μL用于microRNA的回收、定量。将结果示于图7-1、图7-2。
应予说明，microRNA的回收、microRNA(miR-21)的定量与上述同样地进行。
如图7-1所示，确认了通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下进行反应，能够以与超速离心分离法同等的水平检测来自健康人血清的囊泡中的核酸。
如图7-2所示，来自健康人肝素血浆的囊泡中的核酸在利用超速离心分离法时无法检测到。认为健康人肝素血浆一般含有发生PCR抑制的物质，认为是由于在利用超速离心分离法回收的样品中残留抑制PCR的物质。与此相对，在终浓度0.25M的氯化钠存在下进行反应时，能够检测到来自健康人肝素血浆的囊泡中的核酸。
根据这些结果，可知通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下使囊泡与粒子反应，不论血清、血浆之类的检体的种类，均能够检测囊泡中的核酸。
(试验例8囊泡表面的蛋白质的检测)
准备10支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管21～30。向管21～22中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.2mg，向管23～24中各加入抗CD63抗体结合磁性粒子0.2mg，向管25～26中各加入抗CD81抗体结合磁性粒子0.2mg，向管27～28中各加入抗EpCAM抗体结合磁性粒子0.2mg，向管29～30中各加入复合抗体结合磁性粒子(将抗CD9抗体结合磁性粒子、抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子和抗EpCAM抗体结合磁性粒子以1：1：1：1混合而成的物质)0.2mg。
接下来，向管21～30中以氯化钠的终浓度为0.25M的方式各添加实施例3的反应缓冲液1.0mL。向奇数编号的管中各加入1.0mL的试验例3中示出的检体10，向偶数编号的管中各加入1.0mL的试验例3中示出的检体12，在25℃下反应3小时。
接着，将反应后的各粒子用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中。
接下来，进行集磁并将清洗液废弃后，将抗体结合磁性粒子在1×样品缓冲液20μL中悬浮，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)进行清洗。
使作为一次抗体的抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体以及作为标记抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Mouse TrueBlot ULTRA：Anti-Mouse IgG HRP，Rockland 18-8817-33)分别在25℃下反应1小时，将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)清洗后，使发光底物反应，利用发光测定仪(LAS-3000，FUJIFILM)确认Western印迹图像。将结果示于图8-1、图8-2。
另外，作为比较对象，利用作为回收外来体的标准方法的超速离心分离法进行囊泡表面的蛋白质的检测。即，使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)分别对试验例3中示出的检体10、12各11mL以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入11mL的PBS，进行悬浮。再次使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入0.11mL的PBS，进行悬浮。向悬浮液中的10μL中添加4×样品缓冲液5μL、PBS 5μL，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)进行清洗。
使作为一次抗体的抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体以及作为标记抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Mouse TrueBlot ULTRA：Anti-Mouse IgG HRP，Rockland 18-8817-33)分别在25℃下反应1小时，将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)清洗后，使发光底物反应，利用发光测定仪(LAS-3000，FUJIFILM)确认Western印迹图像。将结果示于图8-1、图8-2。
如图8-1、图8-2所示，确认了通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下使囊泡与粒子反应，能够以与超速离心分离法同等的水平检测来自健康人血清、健康人肝素血浆的囊泡表面的蛋白质。另外，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子时，检测不到囊泡表面蛋白质。认为EpCAM蛋白质在健康人的血液中几乎不存在，因癌症等疾病而使其血中浓度上升。确认了通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下使囊泡与粒子反应，能够抑制非特异性反应。
(试验例9-1囊泡表面的维持了天然形式的立体结构的蛋白质的检测(1))
准备8支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管31～38。向管31、32中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向管33、34中加入抗CD63抗体结合磁性粒子0.1mg，向管35、36中加入抗CD81抗体结合磁性粒子0.1mg，向管37、38中加入抗EpCAM抗体结合磁性粒子0.1mg。将实施例3的反应缓冲液以氯化钠的终浓度为0.25M的方式向管31～38中添加各0.3mL。
接下来，向管31、33、35、37中添加0.3mL的在试验例3中示出的检体10，在25℃下反应一晚。另外，向管32、34、36、38中添加0.3mL的在试验例3中示出的检体12，在25℃下反应一晚。
接着，将反应后的各粒子用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.25mL清洗2次，集磁后，除去上清液，悬浮在磷酸缓冲生理食盐水1mL中。
准备40支与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管39～78。从管31向管39～43各分注悬浮液0.1mL。从管32向管44～48各分注悬浮液0.1mL。从管33向管49～53各分注悬浮液0.1mL。从管34向管54～58各分注悬浮液0.1mL。从管35向管59～63各分注悬浮液0.1mL。从管36向管64～68各分注悬浮液0.1mL。从管37向管69～73各分注悬浮液0.1mL。从管38向管74～78各分注悬浮液0.1mL。
接下来，向管39、44、49、54、59、64、69、74中各添加作为对照的藻红蛋白(以下为PE)标记抗小鼠IgG抗体(SONY公司制)5μL，向管40、45、50、55、60、65、70、75中各添加PE标记抗CD9抗体(SONY公司制)5μL，向管41、46、51、56、61、66、71、76中各添加PE标记抗CD63抗体(SONY公司制)5μL，向管42、47、52、57、62、67、72、77中各添加PE标记抗CD81抗体(SONY公司制)5μL，向管43、48、53、58、63、68、73、78中各添加PE标记抗EpCAM抗体(SONY公司制)5μL。其后，将管39～78以25℃、1000rpm的条件悬浮1小时。
接下来，将反应后的各粒子用磷酸缓冲生理食盐水0.5mL清洗2次后，使用流式细胞仪(BD公司制，BD Accuri C6)来确认各样品的荧光信号。将结果示于图9-1、图9-2。
如图9-1、图9-2所示，确认了通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下使囊泡与粒子反应，能够检测来自健康人血清、健康人肝素血浆的囊泡表面的CD9、CD63、CD81。
另外，使用抗CD9抗体结合磁性粒子、抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子时，将认为因癌变而表达的EpCAM以抗EpCAM抗体检测到的峰与作为对照的抗小鼠IgG抗体相比，未进行峰移位，认为从健康人的检体中检测不到。
进而，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，以抗小鼠IgG抗体检测到的峰和以抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗EpCAM抗体检测到的峰几乎没有变化。即，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，无法由健康人的检体得到外来体，认为非特异性吸附低。
另外，认为在解析中使用的样品未进行改变蛋白质的立体结构的热、药剂等的处理，能够检测到存在于囊泡表面的天然形式的CD9、CD63、CD81。
(试验例9-2囊泡表面的维持了天然形式的立体结构的蛋白质的检测(2))
在试验之前，准备以下所示的检体18、19。
检体18(HT29sup.spike Serum)：向混合血清(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释10倍的方式添加而成的检体
检体19(HT29sup.spike Plasma(Heparin))：向混合肝素血浆(KOHJIN-BIO公司制)中将作为掺加物的HT29细胞培养上清液100倍浓缩液以稀释10倍的方式添加而成的检体
准备8支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管79～86。向管79、80中加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.1mg，向管81、82中加入抗CD63抗体结合磁性粒子0.1mg，向管83、84中加入抗CD81抗体结合磁性粒子0.1mg，向管85、86中加入抗EpCAM抗体结合磁性粒子0.1mg。以氯化钠的终浓度为0.25M的方式向管79～86中各添加实施例3的反应缓冲液0.3mL。
接下来，向管79、81、83、85中添加0.3mL的检体18，在25℃下反应一晚。另外，向管80、82、84、86中添加0.3mL的检体19，在25℃下反应一晚。
接下来，将反应后的各粒子用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.25mL清洗2次，集磁后，除去上清液，悬浮在磷酸缓冲生理食盐水1mL中。
准备40支与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管87～126。从管79向管87～91各分注悬浮液0.1mL。从管80向管92～96各分注悬浮液0.1mL。从管81向管97～101各分注悬浮液0.1mL。从管82向管102～106各分注悬浮液0.1mL。从管83向管107～111各分注悬浮液0.1mL。从管84向管112～116各分注悬浮液0.1mL。从管85向管117～121各分注悬浮液0.1mL。从管86向管122～126各分注悬浮液0.1mL。
接下来，向管87、92、97、102、107、112、117、122中各添加作为对照的PE标记抗小鼠IgG抗体(SONY公司制)5μL，向管88、93、98、103、108、113、118、123中各添加PE标记抗CD9抗体(SONY公司制)5μL，向管89、94、99、104、109、114、119、124中各添加PE标记抗CD63抗体(SONY公司制)5μL，向管90、95、100、105、110、115、120、125中各添加PE标记抗CD81抗体(SONY公司制)5μL，向管91、96、101、106、111、116、121、126中各添加PE标记抗EpCAM抗体(SONY公司制)5μL。其后，将管87～126以25℃、1000rpm的条件悬浮1小时。
接下来，将反应后的各粒子用磷酸缓冲生理食盐水0.5mL清洗2次后，使用流式细胞仪(BD公司制，BD Accuri C6)确认各样品的荧光信号。将结果示于图9-3、图9-4。
如图9-3、图9-4所示，确认了通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下使囊泡与粒子反应，能够检测到存在于来自健康人血清、健康人肝素血浆、人结肠癌HT29细胞的囊泡表面的CD9、CD63、CD81。
另外，对于将认为因癌变而表达的EpCAM以抗EpCAM抗体检测到的峰，与作为对照的抗小鼠IgG抗体相比，能够确认到峰移位。可知样品中仅使用了健康人检体的图9-1、图9-2中未确认到该峰移位，因此，能够利用本发明来判定疾病。
进而，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，以抗小鼠IgG抗体检测到的峰和以抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体、抗EpCAM抗体检测到的峰几乎没有变化。即，使用抗EpCAM抗体结合磁性粒子作为固相载体时，无法由健康人的检体得到外来体，认为非特异性吸附低。
另外，认为在解析中使用的样品未进行改变蛋白质的立体结构的热、药剂等的处理，能够检测到存在于囊泡表面的天然形式的CD9、CD63、CD81。
(试验例10)
准备20支2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)，编号为管127～146。向管127～130中各加入抗CD9抗体结合磁性粒子0.2mg，向管131～134中各加入抗CD63抗体结合磁性粒子0.2mg，向管135～138中各加入抗CD81抗体结合磁性粒子0.2mg，向管139～142中各加入抗EpCAM抗体结合磁性粒子0.2mg，向管143～146中各加入复合抗体结合磁性粒子(将抗CD9抗体结合磁性粒子、抗CD63抗体结合磁性粒子、抗CD81抗体结合磁性粒子和抗EpCAM抗体结合磁性粒子以1：1：1：1混合而成的物质)0.2mg。
接下来，向管127～146中以氯化钠的终浓度为0.25M的方式各添加将实施例3的反应缓冲液0.1mL。向管127、131、135、139、143中各加入0.1mL的试验例3中示出的检体10，向管128、132、136、140、144中各加入0.1mL的试验例9-2中示出的检体18，向管129、133、137、141、145中各加入0.1mL的试验例3中示出的检体12，向管130、134、138、142、146中各加入0.1mL的试验例9-2中示出的检体19，在25℃下反应24小时。
接着，将反应后的各粒子用清洗缓冲液(含有0.1质量％的Tween20的TBS)0.5mL清洗3次，将该悬浮液0.5mL分注到与上述不同的新的2mL的蛋白低吸附管(Eppendorf公司制，#0030108132)中。
接下来，进行集磁并将清洗液废弃后，将抗体结合磁性粒子在1×样品缓冲液20μL中悬浮，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)进行清洗。
使作为一次抗体的抗CD9抗体、抗EpCAM抗体、抗Alix抗体以及作为标记抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Mouse TrueBlot ULTRA：Anti-Mouse IgG HRP，Rockland 18-8817-33)分别在25℃下反应1小时，将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)清洗后，使发光底物反应，利用发光测定仪(LAS-3000，FUJIFILM)确认Western印迹图像。将结果示于图10-1、图10-2。
另外，作为比较对象，利用作为回收外来体的标准方法的超速离心分离法进行囊泡表面的蛋白质的检测。即，使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)分别对检体10、12、18、19各11mL以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入11mL的PBS，进行悬浮。再次使用超速离心分离机(贝克曼公司制Optima XE-90)以100000×g、4℃进行70分钟离心。抽取上清液，向沉淀中加入0.11mL的PBS，进行悬浮。向悬浮液中的1μL中添加4×样品缓冲液5μL、PBS14μL，在95℃下进行5分钟静置处理。施加全部量(20μL)的各样品，进行SDS-PAGE。将凝胶转印到PVDF膜后，在封闭缓冲液(含有1％(w/v)BSA和0.1％(w/v)Tween20的TBS)中以37℃振荡2小时。将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)进行清洗。
使作为一次抗体的抗CD9抗体、抗EpCAM抗体、抗Alix抗体以及作为标记抗体的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Mouse TrueBlot ULTRA：Anti-Mouse IgG HRP，Rockland 18-8817-33)分别在25℃下反应1小时，将其用清洗缓冲液(含有0.1％(w/v)Tween20的TBS)清洗后，使发光底物反应，利用发光测定仪(LAS-3000，FUJIFILM)确认Western印迹图像。将结果示于图10-1、图10-2。
如图10-1、图10-2所示，确认了通过在终浓度0.25M的氯化钠存在下使囊泡与粒子反应，能够以与超速离心分离法同等或其以上的水平检测来自健康人血清、健康人肝素血浆、人结肠癌HT29细胞的囊泡表面的蛋白质。另外，使用抗EpCAM抗体进行检测时，健康人血清、肝素血浆时检测不到条带，它们中添加了人结肠癌HT29细胞的培养上清液时检测到条带，因此，可知能够利用本发明来判定疾病。