一种利用糖来优选逆流色谱溶剂的方法与流程

本发明属于逆流色谱技术领域，涉及一种确定逆流色谱溶剂的方法，尤其涉及一种利用糖来优选逆流色谱溶剂的方法。

背景技术：

逆流色谱是一种无需固相载体的全液－液相分配色谱，由于其不使用固相载体而仅使用液相作固定相，因此与其它色谱相比，逆流色谱有显著的优势，不仅可以避免固相载体造成的吸附、变性、拖尾等不利因素，使样品几乎100％回收，而且对于一些结构类似而分配系数不同的化合物，也常常有较好的选择性。此外，逆流色谱也容易较好地与其它色谱进行联用，解决分离中的问题。但是，由于天然产物成分复杂，逆流色谱分离天然产物仍有很多挑战，其关键还是在于两相分配。选择合适的溶剂体系是逆流色谱分离过程中的第一步也是最重要的一步，约占据了整个工作量的90％。尽管已经存在许多两相溶剂体系家族和相对应的溶剂选择策略，例如在Ito规律上建立的Ito溶剂体系、Arizona溶剂体系、以薄层色谱为基础的HEMWat溶剂体系猜测法、九九表式定向溶剂选择策略和别的以实验为基础的计算方法。但是选择合适的溶剂仍然需要专业的知识并且非常繁琐和耗时。因此，选择一个合适的溶剂，使目标化合物在这一溶剂中具有合适的K值，仍是当前研究的重点和难点。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有逆流色谱分离过程中溶剂选择复杂、耗时长、需要专业知识等缺点，提供一种利用糖来优选逆流色谱溶剂的方法，经大量实验验证该方法是一种可行且简单的溶剂选择策略，可以快速地分离高纯度的黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物。

本发明提供一种利用糖来增加天然产物分配系数和选择逆流色谱溶剂的方法，该方法是将一系列不同质量分数的糖的水溶液加入已选定的两相溶剂中并彻底混匀得到两相体系，分析糖剂量与分配系数的关系，然后根据所需的分配系数确定合适的糖剂量，从而获得逆流色谱溶剂的组成。

上述技术方案中，所述的糖是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、木糖中的一种或多种组合。

上述的用来调节分配系数以获得糖剂量与分配系数关系的糖水溶液的质量分数可以是5-30％。

所述的两相体系是正己烷－乙酸乙酯－甲醇－糖的水溶液。

本发明的有益效果在于：

该方法简单实用，可大大减少逆流色谱溶剂选择的难度和时间，便于推广应用。

(1)糖是一种甜的、短链、可溶性的碳水化合物。作为添加剂，和盐析制备化合物的策略相比，糖析制备的策略更绿色更环保，不会产生盐腐蚀等并发症。

(2)本发明中添加糖到正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的两相体系，可以改变溶剂以及化合物在两相体系中的分配，从而可以快速有效地找到合适的溶剂体系。

(3)采用正己烷、乙酸乙酯、甲醇、糖的水溶液两相体系进行逆流色谱分离，可以实现高纯度的逆流色谱制备。

(4)当吸附有含糖的纯品的反相C18色谱柱用甲醇和水洗脱时，也可良好地实现逆流色谱和柱色谱的连用，提高单位时间的生产效率，同时也降低能耗；也可以重复进行，便于自动化生产。

附图说明

图1在正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4:6:4:6，v/v)体系中，蔗糖与化合物K值关系图；

图2.在正已烷－乙酸乙酯－甲醇－水(5:5:5:5，v/v)体系中，蔗糖与化合物K值关系图；

图3.在正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4.5:5.5:4.5:5.5，v/v)体系中，蔗糖与化合物K值关系图；

图4.每种糖对化合物在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-20％糖溶液4.5:5.5:4.5:5.5(v/v)中分配系数的影响关系图；

图5.糖影响两相的溶剂分配；

图6.逆流色谱分离过程中，八角莲粗品在不加糖的两相体系和质量分数为20％蔗糖的体系(4:6:4:6v/v)中的糖析作用比较。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1：

黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物的物理性质测定，包括以下步骤：

1、提取和富集

首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液。洗脱液中化合物的物理性质根据ChemBioOffice Ultra 13.0,Cambridge Soft计算如表1所示。当石油醚和乙酸乙酯体积比2:1洗脱得到的粗产品包括亲水性的鬼臼毒素类化合物和疏水性的黄酮类化合物。

表1.所选择的化合物物理性质^b

^b根据ChemBioOffice Ultra 13.0,Cambridge Soft计算

实施例2：

黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物在以蔗糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4:6:4:6，v/v)体系中的分配系数测定，包括以下步骤：

1、提取和富集

同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液。

2.糖溶液配制

将蔗糖溶解到一定质量的水中分别配制形成质量浓度10％、20％、30％的糖溶液。

3.八角莲中化合物在以蔗糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4:6:4:6，v/v)体系中的分配系数的测定

将八角莲粗品加入到装有两相体系体积比为4：6：4：6的2mL离心管中，包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定糖浓度的水溶液。两相溶剂平衡建立以后，分别取上相和下相进行HPLC分析。HPLC分析条件为：C18反相色谱柱(Zorbax SB-C18,250mm×4.6mm I.D.,5μm)，保护柱(10mm×4.6mm I.D.,5μm)；流动相为甲醇和0.1％三氟乙酸(TFA)。洗脱采用梯度模式，具体参数如下：0-5min，甲醇由10％梯度变化到30％，三氟乙酸由90％梯度变化到70％；5-35min，甲醇由30％梯度变化到70％，三氟乙酸由70％梯度变化到30％；35-45min,甲醇由70％梯度变化到100％，三氟乙酸由30％梯度变化到0％。流速为0.8mL/min，样本进样量10μL,柱温控制在30℃。洗脱物利用DAD检测器进行检测，检测波长为254nm。分配系数为化合物在上相的峰面积和下相的峰面积的比值。结果表明(图1)八角莲粗品以不同浓度的蔗糖为添加剂的两相体系中的分配系数变化，在正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4:6:4:6，v/v)体系中，蔗糖明显地增加化合物的K值。

实施例3：

黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物在以蔗糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(5:5:5:5，v/v)体系中的分配系数测定，包括以下步骤：

1、提取和富集

同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液。

2.糖溶液配制

将蔗糖溶解到一定质量的水中分别配制形成质量浓度10％、20％、30％的糖溶液。

3.八角莲中化合物在以蔗糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(5:5:5:5，v/v)体系中的分配系数的测定

将八角莲粗品加入到装有两相体系体积比为5：5：5：5的2mL离心管中，包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定糖浓度的水溶液。两相溶剂平衡建立以后，分别取上相和下相进行HPLC分析。HPLC分析条件同实施例2相同，分配系数为化合物在上相的峰面积和下相的峰面积的比值。结果表明(图2)八角莲粗品以不同浓度的蔗糖为添加剂的两相体系中的分配系数变化，在正已烷－乙酸乙酯－甲醇－水(5:5:5:5，v/v)体系中，蔗糖明显地增加化合物的K值。

实施例4：

黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物在以蔗糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4.5:5.5:4.5:5.5，v/v)体系中的分配系数测定，包括以下步骤：

1、提取和富集

同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液。

2.糖溶液配制

将蔗糖溶解到一定质量的水中分别配制形成质量浓度10％、20％、30％的糖溶液。

3.八角莲中化合物在以蔗糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4.5:5.5:4.5:5.5，v/v)体系中的分配系数的测定

将八角莲粗品加入到装有两相体系体积比为4.5:5.5:4.5:5.5的2mL离心管中，包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定糖浓度的水溶液。两相溶剂平衡建立以后，分别取上相和下相进行HPLC分析。HPLC分析条件同实施例2相同，分配系数为化合物在上相的峰面积和下相的峰面积的比值。结果表明(图3)八角莲粗品以不同浓度的蔗糖为添加剂的两相体系中的分配系数变化，在正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4.5:5.5:4.5:5.5，v/v)体系中，蔗糖明显地增加化合物的K值。

实施例5：

黄酮类化合物和鬼臼毒素类化合物在分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、木糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4.5:5.5:4.5:5.5，v/v)体系中的分配系数测定，包括以下步骤：

1、提取和富集

同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液。

2.糖溶液配制

将每种糖溶解到一定质量的水中分别配制形成质量浓度10％、20％、30％的糖溶液。

3.八角莲中化合物在以糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(4.5:5.5:4.5:5.5，v/v)体系中的分配系数的测定

将八角莲粗品加入到装有两相体系体积比为4.5:5.5:4.5:5.5的2mL离心管中，包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定糖浓度的水溶液。两相溶剂平衡建立以后，分别取上相和下相进行HPLC分析。HPLC分析条件同实施例2相同，分配系数为化合物在上相的峰面积和下相的峰面积的比值。结果表明(图4)八角莲粗品以不同糖种类以及不同浓度的糖为添加剂的两相体系中的分配系数变化，每种糖对化合物在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-20％糖溶液4.5:5.5:4.5:5.5(v/v)中分配系数的影响都有些不同。

实施例6：

1、提取和富集

同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液。

2.糖溶液配制

将蔗糖溶解到一定质量的水中分别配制形成质量浓度10％、20％、30％的糖溶液。

3.以糖为添加剂的正己烷－乙酸乙酯－甲醇－蔗糖水水溶液体系配制将八角莲粗品加入到装有两相体系体积比为4:6:4:6和4.5:5.5:4.5:5.5的定容瓶，包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水或者一定蔗糖浓度的水溶液。结果表明(图5)糖影响两相的溶剂分配。

实施例7：

1、提取和富集

同实施例1类似，首先八角莲提取液直接进行柱色谱吸附和富集，然后用石油醚和乙酸乙酯体积比2:1进行洗脱，除去大极性杂质，收集洗脱液。作为进一步逆流色谱分离的样品。

2.糖溶液配制

将葡萄糖溶解到一定体积的水中配制形成质量分数为20％的糖溶液。例如，250g葡萄糖溶解到1000mL(1000g)中，得到质量分数为20％的蔗糖溶液。

3.逆流色谱分离及纯品脱糖

将所得到的250mg八角莲粗品进行逆流色谱(900rpm，柱体积260mL)分离。溶剂体系为正己烷、乙酸乙酯、甲醇和质量分数为20％蔗糖水溶液(4:6:4:6v/v)，上相为固定相，下相为保留相，流速3mL/min。CCC洗脱，如图6为逆流色谱分离过程中，八角莲粗品在不加糖的两相体系和质量分数为20％蔗糖的体系(4:6:4:6v/v)中的糖析作用比较。各个馏分在波长254nm检测。根据CCC洗脱图6,主峰部分收集在离心管中，并且每根离心管收集4min。