本发明涉及抗菌技术领域，尤其是涉及一种纳米金刚石生物拉曼探针及其制备和应用。
背景技术：
自第一种抗生素发现以来，人类在大量利用抗生素的同时，饱受其副作用的困扰。细菌耐药性问题愈演愈烈，世界卫生组织专门制定了遏制细菌耐药性的全球发展战略，以推迟细菌耐药性大规模到来以及控制耐药细菌的传播。但是，据报道，细菌的耐药性一直呈现增长趋势，并且一些细菌呈现多重耐药和交叉耐药，细菌的耐药性已经对治疗临床感染构成了严重的威胁，一些医院甚至出现了抗生素无法杀灭的超级细菌。由于微生物本身的传播性，细菌耐药性不是某个国家或者某个地区的问题，而是演变成全世界共同面临的最紧迫的公共卫生问题之一。我们必须找到新型抗菌物质来代替抗生素以应对微生物的威胁。国际科学家也都在极力寻找和研发新型抗菌物质，这些物质中，溶菌酶和抗菌肽是过去几十年发现的有显著效果的天然抗菌物质，并且发现的数量也在逐年增加。
溶菌酶的抗菌能力在自发现以来就被广泛研究，大量实验结果表明，溶菌酶具备成为抗生素替代品的潜力。目前，溶菌酶被应用于食品保藏工业、疾病研究和临床治疗领域。carlosa.rubi证明了溶菌酶在胃肠道疾病的良好治疗作用[carlosa.rubio.thenaturalantimicrobialenzymelysozymeisup-regulatedingastrointestinalinfammatoryconditions.2014,3:73-92]。事实上，在青霉素发现之前，发现于鼻涕中的溶菌酶，其良好的抗菌性能已经被验证，之后陆续有多种溶菌酶被发现研究。溶菌酶的抗菌机理比较清晰，作为一种水解酶，主要是水解细菌细胞壁肽聚糖中的乙酰胞壁酸和乙酰葡糖胺酶，通过对肽聚糖的水解影响细胞壁的形成从而导致细菌死亡。
此外，抗菌肽作为有望替代抗生素的另一大类天然物质，同样吸引广泛的关注和研究。抗菌肽一般长度小于100个氨基酸残基、具有两亲性，大多数抗菌肽含有较多的碱基氨基酸和疏水氨基酸。由于其分子量小，抗菌肽具有低的免疫原性和较高的热稳定性，而且研究表明一些抗菌肽在较低和较高的ph中保持良好的抗菌活性。进一步研究验证，多种抗菌肽具备良好杀死细菌的性能，zhengetal.验证r-thanatin抗菌多肽可以抑制细菌的细胞膜形成，从而展现良好的抗菌性能。但是，由于之前对抗菌肽的研究重点关注在新型抗菌物质的发现和其抗菌效果的定性上，对抗菌肽抗菌机理的研究不够深入，不同种类抗菌肽对不同细菌的作用机理差异分析较少，进而影响抗菌肽的实际应用价值，限制抗菌肽的临床应用潜力。因此，采用多种观测分析手段，研究不同种类抗菌肽与不同细菌间相互作用过程，对于补充抗菌肽抗菌机理的研究，有重要意义。
众多研究方案中，通过可视化成像手段，监测抗菌物质物细菌间的相互作用过程，是一种重要的方式。通常，大家采用荧光成像技术，用荧光分子标记抗菌肽，用于观测抗菌肽与细菌相互作用，实现对整个杀菌过程的可视化。但是，荧光技术存在很多亟待解决的问题，如稳定性差，光漂白和生物自发荧光干扰等，极大地限制了荧光成像技术的应用。而拉曼成像技术，因具备非侵入性，自发性和高分辨等优势，其在生物体成像中的广阔应用前景，被不断挖掘和开发。
因此，本发明提供一种纳米金刚石生物拉曼探针，利用拉曼成像技术，实现对非抗生素类抗菌物质与细菌相互作用过程的可视化，对于非抗生素类抗菌物质的研究及整个抗菌领域具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种纳米金刚石生物拉曼探针；该探针可以实现对非抗生素类抗菌物质的定位。
本发明的第二个目的是提供一种纳米金刚石生物拉曼探针的制备方法；该方法简单，易于操作。
本发明的第三个目的是提供一种纳米金刚石生物拉曼探针的应用；该应用以拉曼成像技术为基础，实现对非抗生素类抗菌物质与细菌相互作用过程的观察。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种纳米金刚石生物拉曼探针，该纳米金刚石生物拉曼探针包括纳米金刚石和非抗生素类抗菌物质；
所述纳米金刚石生物拉曼探针以纳米金刚石为载体，羧基化的纳米金刚石和非抗生素类抗菌物质通过静电吸附的方式结合形成纳米金刚石生物拉曼探针。
进一步，所述纳米金刚石的粒径≥50nm；所述非抗生素类抗菌物质为死亡素、溶菌酶或天蚕素。
一种纳米金刚石生物拉曼探针的制备方法，包括如下步骤：
1)纳米金刚石羧基化
纳米金刚石与混合酸发生羧基化反应，得羧基化的纳米金刚石；
2)静电吸附结合非抗生素类抗菌物质
在30-40℃的水浴条件下，羧基化的纳米金刚石通过静电吸附非抗生素类抗菌物质，结合形成纳米金刚石生物拉曼探针。
进一步，步骤1)具体通过如下步骤实现：
1)将纳米金刚石与混合酸混合，然后在60-85℃下搅拌12-24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温后吸出多余混合酸，然后向所述第一混合物中加入氢氧化钠，于60-85℃下搅拌50-120min，得第二混合物；测定所述第二混合物的ph值，然后用去离子水进行多次清洗，使其ph值呈中性，得到羧基化的纳米金刚石；
进一步，步骤2)具体通过如下步骤实现：将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中超声5-20min，得羧基化的纳米金刚石水溶液；将羧基化的纳米金刚石水溶液和非抗生素类抗菌物质水溶液进行混合，于30-40℃水浴条件下搅拌1-2h，得第三混合物；将所述第三混合物进行离心处理，得纳米金刚石生物拉曼探针。
进一步，所述混合酸为硫酸和硝酸的混合物；混合酸中硫酸和硝酸的体积比为2-4:1。所述混合酸将纳米金刚石进行羧基化，从而使其表面均一化。
进一步，所述纳米金刚石是高温高压合成的金刚石粉末。
进一步，所述羧基化的纳米金刚石水溶液的浓度为1-5mg/ml(例如为：1、2、3、4或5mg/ml等)；所述非抗生素类抗菌物质水溶液的浓度为200-600μmol/l(例如为：1、2、3、4或5mg/ml等)。
进一步，所述羧基化的纳米金刚石水溶液和非抗生素类抗菌物质水溶液的体积比为1：1-3；优选地,，所述羧基化的纳米金刚石水溶液和非抗生素类抗菌物质水溶液的体积比为1：1。
一种纳米金刚石生物拉曼探针的应用，包括如下步骤：
1)制备细菌样品:将配制好的纳米金刚石生物拉曼探针溶液和细菌作用0.5-10min，用质量百分数为2％-5％的戊二醛过夜处理，然后用质量百分数为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇溶液梯度脱水，得到细菌样品；将所细菌存放在乙醇中；
2)拉曼成像:将所述细菌样品滴在载薄片上，然后置于共聚焦拉曼显微镜的100倍水镜上，用532nm激发波长光源，采用线扫描方式进行拉曼扫描，观测即可。
进一步，所述细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌等。
另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的的纳米金刚石生物拉曼探针，由非抗生素类抗菌物质的正电位和纳米金刚石表面的负电位间通过静电吸附方式结合形成的。该纳米金刚石生物拉曼探针为细菌体系内生命活动的可视化提供新方法。
2、本发明的纳米金刚石生物拉曼探针的制备方法简单方便，易于操作。
3、本发明采用的拉曼成像技术，能有效地利用纳米金刚石生物拉曼探针，无损观测非抗生素类抗菌物质与细菌相互作用过程，全面反应不同种类非抗生素抗菌物质体系对不同种类细菌造成的影响。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1：示出了纳米金刚石-死亡素拉曼探针的制备流程图。
图2：示出了纳米金刚石上成功吸附死亡素的红外光谱图。
图3：示出了纳米金刚石-死亡素拉曼探针的粒径分布图。
图4：示出了纳米金刚石-死亡素拉曼探针的zeta电位图。
图5：示出了纳米金刚石-死亡素拉曼探针利用拉曼成像可视化死亡素与枯草芽孢杆菌相互作用过程的示意图。
图6：在扫描电镜的条件下，纳米金刚石、纳米金刚石-死亡素拉曼探针分别与枯草芽孢杆菌相互作用过程的示意图。
图7：示出了纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针利用拉曼成像可视化溶菌酶与枯草芽孢杆菌相互作用过程的示意图。
图8：在扫描电镜的条件下，纳米金刚石、纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针分别与大肠杆菌相互作用过程的示意图。
图9：(a)示出了纳米金刚石-死亡素拉曼探针对大肠杆菌的抗菌效果；(b)示出了纳米金刚石-死亡素拉曼探针对枯草芽孢杆菌的抗菌效果。
图10：(a)示出了纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针对大肠杆菌的抗菌效果；(b)示出了纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针对枯草芽孢杆菌的抗菌效果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
1)纳米金刚石羧基化
将0.5g粒径为≥50nm的纳米金刚石与混合酸(混合酸为体积比为3:1的硫酸和硝酸)混合，然后在70℃下搅拌24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温后吸出多余混合酸，然后向所述第一混合物中加入10ml浓度为0.1mol/l的氢氧化钠水溶液，于70℃下搅拌60min，得第二混合物；测定所述第二混合物的ph值，然后用去离子水进行多次清洗，使其ph值呈中性，得到羧基化的纳米金刚石；
2)静电吸附结合死亡素
将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中超声10min，得浓度为10mg/ml的羧基化的纳米金刚石水溶液；将100ul浓度为10mg/ml的羧基化的纳米金刚石水溶液和100μl浓度为200μmol/l死亡素水溶液进行混合，于37℃水浴条件下搅拌1h，得第三混合物；将所述第三混合物在1200rpm的条件下进行离心处理3min，得纳米金刚石-死亡素拉曼探针。
表征结果：
用傅立叶变换红外光谱仪(excalibur3100，varian，america)，验证死亡素与纳米金刚石间简单吸附作用；结果如图2所示，图2中a、b和c曲线分别表示死亡素、纳米金刚石和纳米金刚石-死亡素拉曼探针的吸收曲线；纳米金刚石-死亡素(c)中明显观察到来源于死亡素多肽，位于1510-1580cm-1处的酰胺ii峰和1600-1700cm-1处的酰胺i峰。对照于死亡素(a)和纳米金刚石(b)的红外光谱，死亡素在纳米金刚石上的成功负载，且通过c曲线中的酰胺i峰和酰胺ii峰得以验证，而且该结合是非共价性的。
另外，采用zetasizer仪(3000hs,malverninstruments,malvern,england)检测纳米金刚石-死亡素的拉曼探针的粒径分布(图3)和表面zeta电位(图4)；图3实验结果显示，修饰死亡素后，纳米金刚石的粒径由102.2nm增加到271.6nm，这表明死亡素在纳米金刚石表面的成功负载；图4电位分析表明，结合死亡素后，纳米金刚石表面的电位由-15.27mv转变为6.12mv，是由于表面负载的死亡素的正电位引起的。这一结果与上述红外结果对应，表明纳米金刚石与死亡素之间是通过静电吸附作用结合的。
3)拉曼可视化的实现
将配制好的纳米金刚石-死亡素拉曼探针溶液和枯草芽孢杆菌作用0.5-10min，用质量百分数为2％的戊二醛过夜处理，然后用质量百分数为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇溶液梯度脱水，得到枯草芽孢杆菌样品；将所述枯草芽孢杆菌样品滴在载薄片上，然后置于共聚焦拉曼显微镜的100倍水镜上，用532nm激发波长光源，采用线扫描方式进行拉曼扫描，观测即可。
图5：(a)和(c)分别为枯草芽孢杆菌的拉曼成像图和拉曼光谱图；(b)为纳米金刚石-死亡素拉曼探针与枯草芽孢杆菌相互作用的拉曼成像图；(d)为纳米金刚石-死亡素拉曼探针的拉曼光谱图。
比较图5(a)和图5(b)的拉曼成像图可以看出，经过3min的作用时间，图5(b)的枯草芽孢杆菌表面出现大量纳米金刚石-死亡素拉曼探针信号，表明枯草芽孢杆菌表面聚集大量金刚石-死亡素拉曼探针。比较图5(c)和图5(d)拉曼光谱图，可以看出图5(d)的谱峰出现明显的金刚石纳米信号，而图5(c)无明显信号。以上结果说明，该纳米金刚石生物拉曼探针可以有效地用于观测死亡素与枯草芽孢杆菌之间的相互作用过程。
4)扫描电子显微镜对拉曼可视化的补充
为了进一步验证和可视化非抗生素类抗菌物质与细菌之间的相互作用过程，采用扫描电子显微镜的手段进行观察，以补充拉曼成像。将枯草芽孢杆菌样品滴加在硅片上晾干，喷金，置于扫描电子显微镜下，进行观测即可。
图6：(a)和(b)分别为纳米金刚石和枯草芽孢杆菌的扫描电镜图；(c)和(d)分别为纳米金刚石和枯草芽孢杆菌作用1min和3min的扫描电镜图；(e)和(f)分别为纳米金刚石-死亡素拉曼探针和枯草芽孢杆菌作用1min和3min的扫描电镜图；从(c)和(d)中可以看出，纳米金刚石对枯草芽孢杆菌附着性很差，经过一段时间作用，纳米金刚石依然只有个别吸附在枯草芽孢杆菌上；从图(e)和(f)中可以看出，纳米金刚石-死亡素拉曼探针对于枯草芽孢杆菌的附着力很强，作用1min，枯草芽孢杆菌表面就大量聚集纳米金刚石-死亡素拉曼探针；作用3min，枯草芽孢杆菌出现死亡，菌体形态改变，胞内物质流出，仅余留细胞外膜的状态。这表明金刚石-死亡素拉曼探针对枯草芽孢杆菌的抗菌性能是通过表面吸附，然后破坏细菌内部电荷平衡的方式发挥作用，而不是破坏细胞壁结构的方式实现。以上结果说明，该纳米金刚石生物拉曼探针可以有效地用于观测死亡素与细菌之间的相互作用过程。
实施例2
1)纳米金刚石羧基化
将0.5g粒径为≥50nm的纳米金刚石与混合酸(混合酸为体积比为3:1的硫酸和硝酸)混合，然后在70℃下搅拌24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温后吸出多余混合酸，然后向所述第一混合物中加入10ml浓度为0.1mol/l的氢氧化钠水溶液，于70℃下搅拌60min，得第二混合物；测定所述第二混合物的ph值，然后用去离子水进行多次清洗，使其ph值呈中性，得到羧基化的纳米金刚石；
2)静电吸附结合溶菌酶
将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中超声10min，得浓度为10mg/ml的羧基化的纳米金刚石水溶液；将100ul浓度为10mg/ml的羧基化的纳米金刚石水溶液和100μl浓度为600μmol/l溶菌酶水溶液进行混合，于37℃水浴条件下搅拌1h，得第三混合物；将所述第三混合物在1200rpm的条件下进行离心处理3min，得纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针。
3)拉曼可视化的实现
首先配制上述的纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针的溶液，与不同细菌作用0.5-10min，用质量百分数为2％戊二醛固定过夜处理，后分别用质量百分数为20％、40％、60％、80％和100％的乙醇溶液梯度脱水，得到细菌样品，存放在100％乙醇中。然后将细菌滴加在载薄片上，置于共聚焦拉曼显微镜的100倍水镜上，用532nm激发波长光源，采用线扫描方式进行拉曼扫描，观测即可。
图7：(a)为大肠杆菌的拉曼成像图；(b)为纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针与大肠杆菌相互作用的拉曼成像图；(c)中a为大肠杆菌的拉曼光谱图，b为纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针的拉曼光谱图。
比较图7(a)和7(b)的拉曼成像图可以看出，经过3min的作用时间，7(b)的大肠杆菌表面出现大量纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针信号，表明大肠杆菌表面聚集大量纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针。比较图7(c)中的a曲线和b曲线可以看出b曲线的谱峰出现明显的金刚石纳米信号，而a曲线无明显信号。以上结果说明，该纳米金刚石生物拉曼探针可以有效地用于观测溶菌酶与大肠杆菌之间的相互作用过程。
4)扫描电子显微镜对拉曼可视化的补充
为了进一步验证和可视化非抗生素类抗菌物质与细菌之间的相互作用过程，采用扫描电子显微镜的手段进行观察，以补充拉曼成像。将大肠杆菌样品滴加在硅片上晾干，喷金，置于扫描电子显微镜下，进行观测即可。
图8：(a)为大肠杆菌的扫描电镜图；(b)为大肠杆菌和纳米金刚石作用3min后的扫描电镜图；(c)为大肠杆菌和纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针的扫描电镜图；(d)大肠杆菌和纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针作用3min后的扫描电镜图。
从图8(b)可以看出，经过一段时间作用，纳米金刚石依然只有个别吸附在大肠杆菌上；而纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针对于大肠杆菌的附着力很强，作用一段时间，大肠杆菌表面大量聚集纳米金刚石-溶菌酶，而且大肠杆菌出现死亡，菌体结构被破坏，细胞壁出现破裂被溶解的现象。这表明纳米金刚石-溶菌酶对大肠杆菌的抗菌性能是通过表面吸附，然后水解细胞壁，破坏细胞壁结构，这与上述死亡素的作用方式不同。以上结果说明，该纳米金刚石生物拉曼探针可以有效地用于观测溶菌酶与大肠杆菌之间的相互作用过程，而且可以用来研究不同种类的非抗生素类抗菌物质抗菌原理。
实施例3
1)纳米金刚石羧基化
将0.5g粒径为≥50nm的纳米金刚石与混合酸(混合酸为体积比为3:1的硫酸和硝酸)混合，然后在70℃下搅拌24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温后吸出多余混合酸，然后向所述第一混合物中加入10ml浓度为0.1mol/l的氢氧化钠水溶液，于70℃下搅拌60min，得第二混合物；测定所述第二混合物的ph值，然后用去离子水进行多次清洗，使其ph值呈中性，得到羧基化的纳米金刚石；
2)静电吸附结合天蚕素
将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中超声10min，得浓度为10mg/ml的羧基化的纳米金刚石水溶液；将100ul浓度为10mg/ml的羧基化的纳米金刚石水溶液和100μl浓度为400μmol/l天蚕素水溶液进行混合，于37℃水浴条件下搅拌1h，得第三混合物；将所述第三混合物在1200rpm的条件下进行离心处理3min，得纳米金刚石-天蚕素拉曼探针。
实验例4
纳米金刚石-死亡素拉曼探针对大肠杆菌的抗菌效果检测
实验组：选用大肠杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养18h，然后用磷酸盐缓冲液(pbs溶液)将培养好的大肠杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的细菌分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、实施例1制备的纳米金刚石-死亡素拉曼探针的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、与纳米金刚石-死亡素拉曼探针中死亡素含量一致的含死亡素的pbs溶液(浓度为40μmol/l)培养1h。培养后将上述培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl稀释后的培养液加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
对照组：选用大肠杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养18h，然后用pbs溶液将培养好的大肠杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的大肠杆菌直接加入pbs溶液中培养1h，之后将上述培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl稀释后的培养液加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
结合图9a比较了实验组和对照组结果。在pbs中加入纳米金刚石，大肠杆菌存活率为99.02±0.28％，表明纳米金刚石本身在此浓度下对细菌没有杀伤作用，验证纳米金刚石适合作为生物探针；在pbs中加入纳米金刚石-死亡素拉曼探针，大肠杆菌的存活率为45.81±2.07％，表明纳米金刚石-死亡素拉曼探针在该浓度下可以有效地杀死大肠杆菌；而在pbs中加入与纳米金刚石-死亡素拉曼探针中死亡素含量一致的死亡素，大肠杆菌的存活率为39.93±4.24％。这表明负载于纳米金刚石上的死亡素展现良好的抗菌性能，与溶液中同浓度的死亡素效果接近。以上实验结果验证了，将纳米金刚石作为生物探针时，在纳米金刚石上负载死亡素不会改变死亡素本身的抗菌性能，为该纳米金刚石-死亡素拉曼探针的应用奠定基础。
实施例5
纳米金刚石-死亡素拉曼探针对枯草芽孢杆菌的抗菌效果检测
实验组：选用枯草芽孢杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养24h，然后用磷酸盐缓冲液(pbs溶液)将培养好的枯草芽孢杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的细菌分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、实施例1制备的纳米金刚石-死亡素拉曼探针的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、与纳米金刚石-死亡素拉曼探针中死亡素含量一致的含死亡素的pbs溶液(浓度为40μmol/l)培养1h。之后将将培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
对照组：选用大肠杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养18h，然后用pbs溶液将培养好的枯草芽孢杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的细菌直接加入pbs溶液中培养1h，之后将将培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
结合图9b比较了实验组和对照组结果。在pbs中加入纳米金刚石，枯草芽孢杆菌存活率为100.02±3.67％，表明纳米金刚石本身在此浓度下对枯草芽孢杆菌没有杀伤作用，验证纳米金刚石适合作为生物探针；在pbs中加入纳米金刚石-死亡素拉曼探针，枯草芽孢杆菌的存活率为65.58±2.42％，表明纳米金刚石-死亡素拉曼探针在该浓度下可以有效地杀死枯草芽孢杆菌；而在pbs中加入与纳米金刚石-死亡素拉曼探针中死亡素含量一致的死亡素，枯草芽孢杆菌的存活率为60.58±2.42％。这表明负载于纳米金刚石上的死亡素展现良好的抗菌性能，与溶液中同浓度的死亡素效果接近。以上实验结果验证了，将纳米金刚石作为生物探针时，在纳米金刚石上负载死亡素不会改变死亡素本身对枯草芽孢杆菌的抗菌性能，为该探针的应用奠定基础。
实验例6
纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针对大肠杆菌的抗菌效果检测
实验组：选用大肠杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养18h，然后用磷酸盐缓冲液(pbs溶液)将培养好的大肠杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的细菌分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、实施例1制备的纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、与纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针中死亡素含量一致的含溶菌酶的pbs溶液(浓度为80μmol/l)培养1h。之后将培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
对照组：选用大肠杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养18h，然后用pbs溶液将培养好的大肠杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的细菌直接加入pbs溶液中培养1h，之后将培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
结合图10a比较了实验组和对照组结果。在pbs中加入纳米金刚石，大肠杆菌存活率为101.02±2.88％，表明纳米金刚石本身在此浓度下对细菌没有杀伤作用，验证纳米金刚石适合作为生物探针；在pbs中加入纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针，大肠杆菌的存活率为59.79±4.05％，表明纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针在该浓度下可以有效地杀死大肠杆菌；而在pbs中加入与纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针中溶菌酶含量一致的溶菌酶，大肠杆菌的存活率为64.64±1.28％。这表明负载于纳米金刚石上的溶菌酶展现良好的抗菌性能，与溶液中同浓度的溶菌酶效果接近。以上实验结果验证了，将纳米金刚石作为生物探针时，在纳米金刚石上负载溶菌酶不会改变溶菌酶本身的抗菌性能，为该探针的应用奠定基础。
实验例7
纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针对枯草芽孢杆菌的抗菌效果检测
实验组：选用枯草芽孢杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养24h，然后用磷酸盐缓冲液(pbs溶液)将培养好的枯草芽孢杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的细菌分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、实施例1制备的纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针的pbs溶液(浓度为1mg/ml)、与纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针中死亡素含量一致的含死亡素的pbs溶液(浓度为80μmol/l)培养1h。然后将培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl稀释后的培养液加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
对照组：选用大肠杆菌，在蛋白胨、牛肉膏和氯化钠组成的培养基中，于37℃培养18h，然后用pbs溶液将培养好的枯草芽孢杆菌，冲洗并三次离心。将冲洗后的细菌直接加入pbs溶液中培养1h，之后将培养液稀释104倍，充分搅拌，然后取20μl稀释后的培养液加入到培养皿的琼脂上。将培养皿在37℃下培养12-16h，之后采用菌落计数法评价抗菌性能。
结合图10b比较了实验组和对照组结果。在pbs中加入纳米金刚石，枯草芽孢杆菌存活率为96.96±2.73％，表明纳米金刚石本身在此浓度下对枯草芽孢杆菌没有杀伤作用，验证纳米金刚石适合作为生物探针；在pbs中加入纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针，枯草芽孢杆菌的存活率为53.15±2.58％，表明纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针在该浓度下可以有效地杀死枯草芽孢杆菌；而在pbs中加入与纳米金刚石-溶菌酶拉曼探针中溶菌酶含量一致的溶菌酶，枯草芽孢杆菌的存活率为54.46±1.33％。这表明负载于纳米金刚石上的溶菌酶展现良好的抗菌性能，与溶液中同浓度的溶菌酶效果接近。以上实验结果验证了，将纳米金刚石作为生物探针时，在纳米金刚石上负载溶菌酶不会改变溶菌酶本身对枯草芽孢杆菌的抗菌性能，为该探针的应用奠定基础。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。