一种测定聚电解质构象转变过程中单分子链电荷状态演变的方法与流程

本发明涉及一种测定聚电解质构象转变过程中单分子链电荷状态演变的方法，属于高分子物理和生物物理领域。

背景技术：

聚电解质的构象转变及其伴随的电荷状态演变一直是高分子物理和生物物理领域的基础热点问题。对聚电解质构象转变的理解，尤其是对生命体系聚电解质(如DNA、蛋白质)的折叠/解折叠过程的理解，不仅对纳米智能材料的设计和调控有着重要作用，而且将有助于深入理解一些基本生命过程。然而，聚电解质自身的多电荷特性带来的长程静电相互作用和其周围分布着大量的抗衡离子给该体系带来独特性能的同时也给它的研究带来了复杂性和难度。因此，引入新的方法来探究聚电解质的构象转变及其伴随的电荷状态演变就变得尤为必要。

前人在探究抗衡离子分布的主要方法有：散射的方法，如美国Cornell University的Lois Pollack等人采用反常小角X射线散射(anomalous small-angle X-ray scattering；ASAXS)获得了核酸不同构象态下的抗衡离子空间分布信息(Annual Review of Biophysics,2011,40,225)，小角中散射(SANS)，Stanford University的Daniel Herschlag等人引入缓冲液平衡-原子发射谱方法(buffer equilibration-atomic emission spectroscopy；BE-AES)获得了核酸的不同构象态如B双螺旋结构DNA的离子氛的定量信息(Methods in Enzymology,2009,469,375.)；加拿大University of Waterloo的Jean Duhamel等人发展了fluorescence blob model(FBM)获得了双螺旋DNA的径向抗衡离子分布(Journal of the American Chemical Society,2012,134,16791)；其他的方法如NMR(如²³Na NMR)、电子自旋共振谱等等，但是这些方法都是系综的方法，不能提供单分子的信息。因此，引入单分子水平上的新方法来表征聚电解质构象转变过程的电荷状态演变就尤为必要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种测定聚电解质构象转变过程中单分子链电荷状态演变的方法，本发明采用共聚焦显微镜，引入具有单分子灵敏度的荧光涨落光谱(Fluorescence Fluctuation Spectroscopy，FFS)在单分子水平上表征聚电解质构象转变过程中电荷状态的演变。

本发明所提供的测定聚电解质构象转变过程中单分子链电荷状态演变的方法，包括如下步骤：

(1)利用抗衡离子荧光染料探针标记待测定的聚电解质；

(2)测定所述抗衡离子荧光染料探针在不同抗衡离子浓度条件下的荧光涨落光谱；采用光子计数直方图分析方法分析所述抗衡离子荧光染料探针的荧光涨落光谱信息，得到所述抗衡离子荧光染料探针的分子亮度随抗衡离子浓度的变化曲线，作为标准曲线；

(3)测定所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质在不同诱导构象变化因素变化条件下的荧光涨落光谱，采用光子计数直方图分析方法分析所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质的荧光涨落光谱信息，得到所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质构象演变过程中其分子亮度随诱导构象变化因素的变化的曲线，并与所述标准曲线进行比对(点对点的比较)得到所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质溶液中抗衡离子的浓度与所述抗衡离子荧光染料探针标记处的抗衡离子的浓度之间的曲线；分析所述曲线得到表征所述聚电解质链电荷状态的局部电势信息；

(4)采用荧光关联光谱分析方法分析所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质的荧光涨落光谱信息，得到所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质的扩散系数信息；

(5)将所述局部电势信息和所述扩散系数信息对诱导构象变化的因素作图，即得到所述诱导构象变化的因素诱导的所述聚电解质构象转变过程中的单分子电荷状态演变信息。

上述的方法中，所述聚电解质为多电荷软物质体系，如为DNA、RNA、蛋白质、多糖等。

上述的方法中，所述抗衡离子荧光染料探针指的是对抗衡离子具有响应性的荧光染料，如为质子响应性的探针、外加盐响应性的探针等，所述质子响应性的探针如OG514。

上述的方法中，所述抗衡离子荧光染料探针的浓度为10^-9M量级。

上述的方法中，所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质的浓度为10^-9M量级。

上述的方法中，步骤(2)和(3)中，采用三维Gaussian PCH的拟合方法分析所述所述抗衡离子荧光染料探针和所述抗衡离子荧光染料探针标记的聚电解质的荧光涨落光谱信息。

上述的方法中，步骤(3)中，采用Boltzmann分析法得到表征所述聚电解质链电荷状态的局部电势信息。

上述的方法中，步骤(3)中，所述诱导构象变化因素可为pH值、盐、配体、其它外部刺激条件等，所述外部刺激条件如光照等。

上述的方法中，步骤(4)中，使用三维自由扩散关联函数G(τ)的三维Guassian模型对关联函数曲线作拟合。

本发明方法采用的两种分析方法(荧光关联分析方法和光子计数直方图分析方法)能够统计分析FFS对共聚焦系统确定的极小激发空间(～1×10^-15L)内荧光分子运动带来的荧光涨落信息。

荧光光谱关联分析方法(Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS)是对荧光涨落的时间行为进行分析，即对涨落进行时间关联分析，由该分析可获得激发空间内荧光的分子数目和荧光分子的扩散系数(Biopolymers,1974,13,29；Macromolecules,2012,45,9196)，而扩散系数与分子的尺寸信息相关联。

光子计数直方图分析方法(Photon Counting Histogram，PCH)对荧光涨落的振幅进行统计分析，PCH通过分析探测的荧光光子数的超Poission分布获得激发空间内的荧光分子数目和荧光分子的分子亮度(CPSM,counts per second per molecule)信息(ChemPhysChem,2004,5,1523.)。

本发明方法具有如下有益效果：

(1)本发明可在单分子水平上直接获得聚电解质的局部电势信息；

(2)本发明可同时获得聚电解质的尺寸信息和电势演变信息；

(3)本发明可适用于多种诱导因素(pH值、外加盐、外加配体、外部刺激条件等等)诱导的聚电解质的构象变化情况；

(4)本发明可适用于不同的多电荷软物质体系尤其是生物相关的分子构象变化(如核酸、蛋白质的折叠行为)过程中的带电特性研究；

本发明方法能够为基于上述特性(尺寸变化信息和电势演变信息)的智能纳米材料的设计提供指导。

附图说明

图1为本发明实施例1中i-motif DNA(序列5’-CCC-(TAACCC)₃-3’)的胞嘧啶—质子化的胞嘧啶(C-C⁺)碱基配对方式(图1(a))及其pH驱动的有序-无序构象转变过程(图1(b)，一种可以在弱酸性(一般pH＜6)条件下通过C-C⁺配对方式形成的紧密堆积的分子内四联有序结构)。

图2为本发明实施例1中i-motif DNA在pH诱导的解折叠过程中末端局部pH(pH_local)随本体溶液pH(pH_bulk)变化的曲线，其中内插图的两条曲线分别为pH敏感染料分子OG514的分子亮度对pH的依赖性曲线(即标准曲线)和OG514标记的i-motif DNA(OG514-i-motif)的分子亮度对pH的依赖性曲线。

图3为本发明实施例1中i-motif DNA的pH诱导的解折叠过程的扩散系数曲线(反映解折叠过程的尺寸变化，方块标记)和局部电势曲线(圆形标记)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、有序i-motif DNA解折叠过程中单分子链电荷状态演变的表征

1、抗衡离子荧光探针(此处为质子探针)标记的i-motif DNA的制备

将5’端修饰-(CH₂)₆-NH₂的i-motif DNA溶解在0.1M pH＝8.3的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液中，加入到具有琥珀酰亚胺酯活性基团的pH响应性的染料OG514的DMSO(二甲基亚砜)溶液中搅拌避光反应；将反应完成的溶液过聚丙烯酰胺凝胶柱，再通过高速离心分离直至荧光关联光谱检测不出离心管下清液自由染料的信号，获得纯净的OG514标记的i-motif DNA样品，记为OG514-i-motif DNA。

2、亮度标准曲线和OG514-i-motif DNA的荧光涨落光谱的测定

采用基于Olympus IX-71倒置显微镜的共聚焦系统(Macromolecules,2012,45,9196)，在合适的采样频率(50～100kHz，如100kHz)和采样时间(30～200s，如100s)的采样条件下测定极稀浓度(～1×10^-9M)自由抗衡离子探针(OG514)和OG514-i-motif DNA的荧光涨落光谱，通过数据采集卡(ISS，USA)获得最原始的荧光涨落信号。

3、有序i-motif DNA解折叠过程中单分子链电荷状态演变的表征

使用关联器(ISS，USA)对步骤2获得的荧光涨落信号进行荧光关联光谱(FCS)分析和光子直方图(PCH)分析。

(1)由PCH的分析和三维Gaussian PCH的拟合(ChemPhysChem,2004,5,1523.)分别获得了自由抗衡离子染料(OG514)的分子亮度随pH的变化(通过HCl溶液和NaOH溶液调节)即标准曲线和i-motif DNA局部微环境处(即所用标记染料OG514所在处的抗衡离子环境)抗衡离子染料的亮度随pH的变化曲线(图2中的内插图)，对两个曲线作比对后获得聚电解质构象转变过程中的局部pH(pH_local)随本体pH(pH_bulk)(pH_bulk指本体溶液中的pH)的变化曲线，如图2所示，记作pH_local-pH_bulk曲线。

(2)对步骤(1)中的pH_local-pH_bulk曲线的各点作Boltzmann分析(pH_local＝pH_bulk+0.43(eψ/k_BT)，其中e表示元电荷，k_B表示Boltzmann常数，T为温度，单位为K)获得表征i-motif DNA电荷状态的局部电势ψ(即标记的聚电解质上染料所在位置处的电势)的信息，如图3中圆形所标记的曲线。

(3)对t时刻的荧光光强涨落δI(t)(δI(t)＝I(t)-<I>，I(t)和<I>分别为t时刻的光强和平均光强)和(t+τ)时刻的荧光光强涨落δI(t+τ)作FCS分析(即自关联函数分析)并使用溶液中染料三维自由扩散关联函数G(τ)的三维Guassian模型(Macromolecules,2012,45,9196，其中：τ表示关联时间；N表示探测的共聚焦激发空间内的荧光分子数目；τ_D为自由扩散的特征时间且D表示扩散系数；s表示探测体积的纵横向尺寸比，w₀、z₀分别表示探测椭球体积的短、长半轴长)对关联函数曲线作拟合，获得i-motif DNA解折叠过程的扩散系数演变信息(即尺寸演变信息)，如图3中方块所标记的曲线。

(4)将上述得到的扩散系数信息和局部电势信息对pH作图就获得了i-motif DNA的pH驱动的解折叠过程的单分子电荷状态演变信息(图3)。