醋狼毒的质量控制方法与流程

本发明属于中药饮片质量控制领域，具体涉及一种醋狼毒的质量控制方法。

背景技术：

狼毒为大戟科大戟属月腺大戟(euphorbiaebracteolatahayata)或狼毒大戟(euphorbiafischerianasteud)的干燥根，具有逐水祛痰，破积杀虫之功效，药性峻猛。《本草纲目》将其列入毒草类，临床使用不当可对皮肤、口腔及胃肠道粘膜产生强烈刺激，临床主要可引起剧烈的腹痛、腹泻、便血等消化道刺激，故应用时需炮制。

醋狼毒临床应用广泛，且有肠道毒副作用，但目前尚无统一的质量控制方法，难以保证临床安全及疗效稳定。狼毒属于大戟科有毒中药。大戟科有毒中药中的二萜类成分被认为既是有毒成分又是药效成分。狼毒中也含有二萜类成分，包括西松烷型及巴豆烷型二萜类成分。

本发明采用高效液相色谱法同时测定该药中prostratin、pekinening两种既是毒性成分又是药效成分的二萜类指标性成分的含量，制定了最高和最低限量，解决了醋狼毒质量控制的难题，本发明针对醋狼毒提供了一种实用的质量控制方法。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对现有技术尚无统一的醋狼毒质量控制方法，本发明提供一种醋狼毒的质量控制方法。

技术方案：二萜类成分prostratin和pekinening在醋狼毒质量控制中的应用。

具体方法为通过测定醋狼毒中二萜类成分prostratin和pekinening的含量来判定醋狼毒的质量。

测定方法为采用高效液相色谱法测定：

色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温25～35℃；双波长检测：prostratin的检测波长236nm，pekinening的检测波长为273nm；以乙腈-0.1％甲酸的水溶液为流动相梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～25min，75wt.％～85wt.％乙腈；25～30min，85wt.％～100wt.％乙腈；30～31min，100wt.％～75wt.％乙腈；31～35min，75wt.％～75wt.％乙腈；流速：1ml·min^-1；

对照品溶液的制备：分别取相同重量的prostratin、pekinening对照品各2.0～10.0mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作为标准品母液；精密移取prostratin、pekinening单标母液0.2～0.5ml混合，体积比1:1，并定容至10ml容量瓶中，配制为混标溶液，备用；

供试品溶液的制备：取醋狼毒粉末0.5～2.0g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷，加热回流提取至提取液无色，回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

含量测定：精密吸取对照品及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得醋狼毒中prostratin、pekinening含量。

醋狼毒中prostratin的含量范围在0.055wt.％～0.020wt.％；pekinening的含量范围在0.050wt.％～0.020wt.％。

有益效果：本发明对醋狼毒建立了质量控制方法，该方法提供了利用高效液相色谱法同时测定醋狼毒中prostratin、pekinening两种毒性及药效成分含量的质量控制方法，该质量标准简便，且能更好地控制药品的质量。本发明的质量控制方法，具有较强的专属性和良好的重现性，真正体现药品安全有效、质量可控。

附图说明

图1为混合对照品及12个炮制品的三氯甲烷提取物的hplc色谱图；狼毒生品a)；狼毒醋品b)；对照品c)；prostratin1)；对照品pekinening2)；对照品pekineninsa3)

图2狼毒中二萜类成分改变ht-29细胞中aqp3mrna水平变化图与空白组比较，1)p<0.05

图3狼毒中二萜类成分刺激巨噬细胞释放炎症因子的变化图与空白组比较，1)p<0.05。

具体实施方式

结合具体实施方式，对本发明进一步说明如下：

实施例1

1.两种成分同时测定的含量测定方法为：

1.1药材、仪器与试剂

自制的醋狼毒：称取100g狼毒饮片(ld)，160℃条件下不断均匀翻炒10min(cld1)、20min(cld2)、30min(cld3)、40min(cld4)至药物表面呈棕黄色。炮制三批。获得的样品名分别为cld11、cld21、cld31、cld41、cld12、cld22、cld32、cld42、cld13、cld23、cld33、cld43。

waters2695-2489pda高效液相色谱系统；milli-q纯水仪；bp211d电子天平(德国sartorius公司)；kq-500de型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

分析用对照品：prostratin纯度均大于98％，购自sigma；pekinening自制(wangkl,yuhl,wuh,wangxz,panyz,chenyq,liulp,jinyp,zhangcc.anewcasbanediterpenefromeuphorbiapekinensis.natprodres.natprodres.2015；29(15):1456-60.)，纯度大于92％。hplc用甲醇、乙腈及甲酸均为色谱纯，超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2方法与结果

1.2.1色谱条件

色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温25～35℃；双波长检测：prostratin的检测波长236nm，pekinening的检测波长为273nm；以乙腈-0.1％甲酸的水溶液为流动相梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～25min，75wt.％～85wt.％乙腈；25～30min，85wt.％～100wt.％乙腈；30～31min，100wt.％～75wt.％乙腈；31～35min，75wt.％～75wt.％乙腈；流速：1ml·min^-1。对照品及醋狼毒样品的hplc图见图1。

对照品溶液的制备：

含量测定：精密吸取对照品及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得醋狼毒中prostratin、pekinening含量。

1.2.2对照品溶液的制备

分别取相同重量的prostratin、pekinening对照品各2.0mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，作为标准品母液。精密移取prostratin、pekinening单标母液0.2ml混合，体积比1:1，并定容至10ml容量瓶中，配制为混标溶液，备用。

1.2.3供试品溶液的制备

供试品溶液的制备：取醋狼毒粉末1.0g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷，加热回流提取至提取液无色。回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.4线性关系考察

取1.2.2项下的混合对照品溶液，精密稀释至母液的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，制备6个浓度水平的对照品溶液，进样分析，以峰面积和进样浓度建立每个目标分析物的回归方程。结果见表1，所有化合物在检测范围内有较好的线性。线性回归分析结果表明标准曲线的相关系数值>0.9990。数据呈现良好的重现性。

表1两种化合物的线性回归方程、相关系数、线性范围

1.2.6精密度试验

精密吸取1.2.2项下的混合对照品溶液10μl，连续进样6次，考察日内精密度，连续分析3天，考察日间精密度。用于目标分析物定量的精密度结果见表2，结果显示所有的相对标准差(rsd)值不超过5.0％。

1.2.7稳定性和重复性试验

精密吸取1.2.3项下制备的供试品溶液适量，于0h、4h、8h、12h、24h及48h测定样品，考察定量分析的稳定性。按照1.2.3项下供试品制备的方法制备6份样品，分别进样，考察定量分析的重复性。用于目标分析物定量的重复性、稳定性结果见表2，结果显示所有的相对标准差(rsd)值不超过5.0％。

1.2.8加样回收率

取已知被测成分含量的样品6份，精密称定，分别精密加入一定量的被测成分对照品(加入量与所取样品含量之比为1:1)，按1.2.3项下的方法制备样品后进样。按回收率(％)＝(加标样品测定值-样品测定值)/加标量×100％计算回收率。结果见表2，所有待测成分的回收率值在95.00％～105.00％范围内，符合要求。

表2醋狼毒样品重复性、稳定性、精密度及加样回收率的测定结果

1.2.9样品含量测定

取1.2.2项下各药物的混合对照品溶液及1.2.3项下各药物供试品溶液，进样10μl，各批次醋狼毒色谱图见图1。将得到的各药物中待测成分的峰面积代入线性方程中计算含量，结果见表3。

表3狼毒及12批醋狼毒中两种二萜类成分定量分析结果

2.狼毒生醋品对肠道腹泻的影响

2.1方法

参考《中国药典》2015版狼毒的人用剂量，以人一天所用剂量3g/天的等效量作为小鼠的剂量组，生醋品的剂量为0.45生药/kg(低剂量)、4.5g生药/kg(高剂量)。空白组灌胃给药0.5％cmc-na溶液0.03ml·g^-1；给药组参照各部位得率，分别称取生、醋品的95％乙醇提取物适量，再以0.5％cmc-na溶液溶解，配成合适的浓度，作为小鼠灌胃给药的备用液。

取icr小鼠，实验前禁食不禁水24h，随机分为空白组、生品组、醋品组；除空白外，各给药组均设立高、低剂量两个组，每组6只。灌胃给药3小时期间收集小鼠粪便，3小时后脱劲椎处死，立即剪开腹部皮肤和腹膜，暴露肠管，分离肠系膜，截取部分十二指肠、结肠，用电子天平称取各肠道湿重，及烘干后各肠道干重，计算肠道含水量；并截取部分各部位肠道，置于冻存管中，液氮急速冷冻后放置于-80℃冰箱保存。粪便放置干燥器中干燥后测量干重，计算粪便含水量。

2.2结果

由表4可见，狼毒炮制不同时间对小鼠粪便含水量有显著差异。醋制20min后狼毒产生腹泻的毒副作用显著降低。

表4狼毒及4批不同炮制时间醋狼毒对小鼠粪便含水量的影响

注：与空白组相比，**p<0.01，*p<0.05

3.狼毒生醋品对利尿作用的影响

3.1方法

参考《中国药典》2015版狼毒的人用剂量，以人一天所用剂量3g/天的等效量作为大鼠的剂量，生醋品的剂量为0.45g生药/kg。分别取生、醋狼毒饮片，打粉过4号筛，再用0.5％cmc-na生理盐水溶液混悬。每100g大鼠给药1ml。

将sd大鼠称重，放入大鼠代谢笼喂养2d，自由饮水，期间观察大鼠的尿量是否稳定。实验前24h禁食不禁水。取上述合格sd大鼠按照体重随机分为8组，每组6只。生理盐水组，阳性药组，生、醋狼毒组以及模型组。用药前先以蒸馏水2.5ml/100g给大鼠灌胃，半小时后给药。收集其后5h内的尿量。

3.2结果

狼毒炮制10～30min，其利尿作用并未降低，但炮制到40min其利尿作用显著下降。结果见表5。

表5狼毒炮制前后大鼠利尿作用的影响

注：与生理盐水组相比，**p<0.01，*p<0.05。

依据狼毒醋制前后毒性、药效作用，及醋制前后两种二萜类成分含量，发现当prostratin的含量的高于0.055％或pekinening高于0.050％时，狼毒仍然具有肠道毒性。当prostratin的含量的低于0.020％或pekinening低于0.020％时，狼毒利尿作用降低。故本发明限定prostratin的含量范围在0.055wt.％～0.020wt.％；pekinening的含量范围在0.050wt.％～0.020wt.％。