一种非侵入式机体免疫功能变化的监测方法及其应用与流程

本发明涉及生物医学免疫力监测领域，具体涉及一种非侵入式机体免疫功能变化的监测方法及其应用。

背景技术：

在同样的环境中，有的人感冒了，有的人却若无其事；有的癌症病人被医生“宣判”活不了几个月，但过了多少年，他们仍好好地活着。这些现象是由于个体免疫系统功能的差异所导致，人们通常把人体对外来侵袭、识别和排除异物的抵抗力称为“免疫力”。

免疫系统担当着防御外来病原体入侵、监视体内变异、清除体内衰老和死亡细胞的任务。机体有各种各样的免疫应答方式，有些是特异性的，有些是非特异性的；有些是细胞免疫性的，有些是体液免疫性的。免疫系统有三大作用，即防御、自稳和监视。免疫防御主要针对外来抗原(如微生物、毒素等)的免疫保护作用；免疫自稳主要指免疫系统内部的自我调控，以维持免疫功能的相对稳定性；免疫监视是指免疫系统识别并清除突变的细胞(如癌细胞)。

在正常情况下，机体能够通过适度的免疫应答防止病原微生物的入侵、监视并清除体内恶变的细胞，以保持内环境的稳定。作为人体健康屏障的免疫系统一旦出现异常，就会发生相应的疾病。经典的评价机体免疫功能的方法是：(1)动物实验：脏器/体重比值测定(胸腺/体重比值，脾脏/体重比值)、细胞免疫功能测定(小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验)、体液免疫功能测定(抗体生成细胞检测，血清溶血素测定)、单核-巨噬细胞功能测定(小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验)、nk细胞活性测定；(2)人体免疫功能相关检测指标：抽取血液样本，分析血红蛋白、血中红细胞计数、白细胞计数，细胞免疫功能(t淋巴细胞转化试验，亚群分泌细胞因子的能力(th1、th2、th17)及ctl功能)、调节性t细胞(treg)的比例和分泌细胞因子的能力、体液免疫功能(b淋巴细胞转化试验、b淋巴细胞分泌抗体能力)、中性粒细胞功能(中性粒细胞吞噬细菌的能力、中性粒细胞表达nadph氧化酶复合物的能力)、nk细胞功能(杀伤靶细胞及表达ifn-γ的能力)。这些免疫功能检测方法共性特点是侵入式(取血)、检测物料试剂多、检测周期长、费用高昂，同时需要有正常对照才可以判断所检测指标是正常还是异常。更为重要的是，机体免疫功能的强弱是所检测指标综合的结果，上述单一或数个指标无法做出免疫功能强弱的判断。

因此，开发方便、快速、能反映免疫系统综合功能强弱的非侵入式监测方法，对于预防免疫功能低下相关亚健康状况、疾病的发生和预后具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种体外非侵入式、能反映机体免疫功能变化的监测方法。

本发明的目的还在于提供所述的一种非侵入式机体免疫功能变化的监测方法的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种非侵入式机体免疫功能变化的监测方法，包括如下步骤：

(1)收集尿液样本：收集受检者禁食8小时后的空腹晨尿或受检者的24h尿液，用无菌管保存；

(2)检测尿液样本中的葡萄糖含量：取尿液样本，在高速离心机内离心，取上清液，检测上清液中的葡萄糖含量；

(3)判断机体免疫功能的变化：以受检者健康状态时尿液中葡萄糖含量为参照基准，尿液中葡萄糖浓度上升≥20％，反映机体免疫功能下降；以受检者亚健康或疾病状态时尿液中葡萄糖含量为参照基准，尿液中葡萄糖浓度下降≥20％，反映机体免疫功能增强。

进一步地，步骤(2)中，所述离心是在室温下3000-5000g离心5～10min。

进一步地，步骤(2)中，所述检测的方法包括化学、物理或生物的检测方法。

更进一步地，步骤(2)中，所述化学、物理或生物的检测方法包括硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、高效液相色谱法、核磁共振法(nmr)、光波导共振法或生物酶法。

所述的一种非侵入式机体免疫功能变化的监测方法应用于医疗、保健中的提前预估免疫功能低下相关疾病或亚健康状况的发生、发展，或者评估免疫功能干预手段的效果。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明的监测方法是非侵入式，只需收集尿液样本，样本获得的成本低廉、依从性高、无安全风险。

(2)本发明的监测方法只需检测尿液中葡萄糖浓度，检测指标简单、快速、成本低。

(3)本发明的监测方法中，免疫功能强弱的变化判断只需与受检者其它时间点或健康状态的尿液中葡萄糖浓度进行对比，无需建立标准参数范围或他人的空白对照，实施方便。

附图说明

图1为实施例1中免疫低下组与正常组小鼠的nk细胞的杀伤活性的结果示意图；

图2a为实施例1中免疫低下组与正常组小鼠血清中免疫因子tnf-α的分泌结果示意图；

图2b为实施例1中免疫低下组与正常组小鼠血清中免疫因子il-1α的分泌结果示意图；

图2c为实施例1中免疫低下组与正常组小鼠血清中免疫因子ifn-γ的分泌结果示意图；

图2d为实施例1中免疫低下组与正常组小鼠血清中免疫因子il-2的分泌结果示意图；

图2e为实施例1中免疫低下组与正常组小鼠血清中免疫因子il-6的分泌结果示意图；

图2f为实施例1中免疫低下组与正常组小鼠血清中免疫因子il-12的分泌结果示意图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对所做的任何修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。在未作说明的情况下，本发明涉及的原料与方法均为本领域的常规原料和方法。

实施例1

免疫功能低下小鼠模型和尿液中葡萄糖浓度的监测

方法：实验开始时即开始造模，免疫功能低下小鼠模型造模，模型组小鼠(小鼠数量n＝4)腹腔注射环磷酰胺150mg/kg，制备免疫低下模型，以后每周加强1次，连续四周；正常组造模，正常组小鼠(小鼠数量n＝7)腹腔注射同体积蒸馏水；模型组小鼠和正常组小鼠正常摄食饮水，四周后实验结束前一天代谢笼收集24h尿液，然后脱颈椎处死，常规方法检测免疫指标，nmr法检测尿液样本中葡萄糖相对浓度。

结果：免疫功能低下小鼠模型与正常组的造模结果如表1、图1和图2a～2f所示。其中，脾脏指数与胸腺指数的对比结果如表1(**p＜0.01vs.ngroups.)所示。

表1正常组与模型组胸腺与脾脏指数的对比

而免疫功能低下小鼠模型与正常组小鼠的对自然杀伤细胞(nk细胞)的杀伤活性的结果如图1所示(**p<0.01；***p<0.001)，血清中免疫因子肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-1α(il-1α)、干扰素-γ(ifn-γ)、白介素-2(il-2)、白介素-6(il-6)和白介素-12(il-12)的分泌结果如图2a～图2f(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)所示；

由表1、图1和图2a～图2f可知，模型组小鼠的脾脏指数、nk细胞的杀伤活性、血清免疫因子的分泌均比正常组小鼠低，免疫系统功能低下小鼠模型造模成功。

检测：24h尿液样本中葡萄糖含量，利用nmr法检测，以nmr信号积分面积计定量相对浓度，结果如表2所示。

表2正常组和模型组尿液中葡萄糖相对含量对比

由表2可知，免疫低下模型组小鼠尿液样本中葡萄糖含量相对升高，升高率为29.8％。

综合分析正常小鼠、模型小鼠免疫功能和尿液中葡萄糖的浓度，小鼠免疫功能的降低和尿液中葡萄糖浓度的增加有高度相关性，相关系数r＝-0.83。

实施例2

免疫功能增强小鼠模型和尿液中葡萄糖浓度的监测

方法：实验开始时即开始造模，正常老龄鼠组(o组)、正常老龄鼠灌胃香菇多糖组(oa组)，每组7只小鼠；oa组小鼠的香菇多糖l2灌胃剂量为40mg/kg·day，灌胃体积为0.1ml/10g，每天灌胃一次，连续灌胃30d；o组和oa组小鼠正常摄食饮水；四周后实验结束前一天代谢笼收集24h尿液，然后脱颈椎处死，常规方法检测免疫指标，nmr法检测葡萄糖相对浓度。

结果：o组和oa组小鼠的建模测试结果如表3至表5所示。

表3脏器指数

注：与o组比较，^△p<0.05。

表4免疫功能指数

注：与o组比较，#p<0.05。

表5血清中细胞因子的分泌指数

注：与o组比较，#p<0.05。

由表3-5的结果可知，香菇多糖可以提高老龄小鼠的免疫功能，即免疫增强型小鼠模型建立。

检测：24h尿液样本中葡萄糖含量，利用nmr法检测，以nmr信号峰面积计算相对含量，结果如表6所示。

表6o组和oa组小鼠尿液中葡萄糖浓度(n＝7)

由表6可知，免疫增强组老龄小鼠尿液样本中葡萄糖含量相对降低，降低率为21.6％。

综合分析正常老龄小鼠、免疫增强组(oa组)小鼠免疫功能和尿液中葡萄糖的浓度，免疫功能的增加和尿液中葡萄糖浓度的降低有高度相关性，相关系数r＝-0.79。

实施例3

方法：某受试者，感冒期间收集晨尿15ml，感冒后收集晨尿15ml，分别标记为g1和g2；分别取g1和g2尿液样本10ml，在高速离心机内于4℃下5000g离心10min，取上清液0.5ml，用硫酸苯酚比色法以纯葡萄糖作为对照品，检测上清液中葡萄糖含量。

结果：感冒期间，尿液样本g1中葡萄糖浓度为1.08mg/ml，感冒后尿液样本g2中葡萄糖浓度为0.78mg/ml，葡萄糖浓度下降27.8％。

实施例4

方法：某受试者，发高烧38.9℃，期间收集晨尿10ml，烧退后第三天收集晨尿10ml，分别标记为h1和h2；分别取h1和h2尿液样本5ml，在高速离心机内于4℃下5000g离心10min，取上清液1ml，用硫酸苯酚比色法以纯葡萄糖作为对照品，检测上清液中葡萄糖含量。

结果：尿液样本h1中葡萄糖浓度为1.34mg/ml，烧退恢复健康后尿液样本h2中葡萄糖浓度为0.69mg/ml，葡萄糖浓度下降48.5％。

实施例5

方法：选取3个家庭，老年人共7人(年龄均超过55岁)，青年人共6人(年龄介于28-33岁)。取家庭成员晨尿样本各15ml，取样前后一周观察身体均健康正常，无服用药物。老人尿液样本分别命名为o1、o2、o3、o4、o5、o6、o7，青年人样本分别命名为a1、a2、a3、a4、a5、a6；取尿液样本5ml，在高速离心机内于4℃下3000g离心10min，取上清液1ml，用硫酸蒽酮比色法以纯葡萄糖作为对照品，检测上清液中葡萄糖含量。

结果：各尿液样本的葡萄糖浓度检测结果如表7所示。

表7各样本葡萄糖浓度检测结果

由表7结果可知，老年人尿液样本中葡萄糖平均浓度为1.85mg/ml，而青年人尿液样本中葡萄糖平均浓度为0.86mg/ml。老年人的尿液中葡萄糖浓度与青年人相比，增加率达到115％。众所周知，人体免疫力随着年龄的增长会逐渐下降。因此，尿液中葡萄糖浓度很客观地反映了这种免疫力变化的情况。

以上实施例说明，本发明所述的免疫功能变化监测方法具有客观准确性和实用性。