一种检测尿外泌体荷载miRNAs的试剂盒和方法与流程

本发明涉及一种检测尿外泌体荷载mirnas的试剂盒和方法。

背景技术：

肾纤维化(renalfibrosis，rf)，包括肾间质纤维化和肾小球硬化，是一个动态发展的过程,标志着不可逆性肾损伤,是影响各类肾脏疾病的治疗及预后的重要因素之一。[罗海清,梁冬,刘华锋.肾间质纤维化的形成机制及中医药防治作用.中国中西医结合肾病杂志,2004,5(7):432-434.]因此,延缓和阻断肾纤维化是防治肾损害的关键,也是目前国内外肾脏病研究的热点。能否及时、准确地判断是否存在肾纤维化及其程度,有助于临床医生合理制定治疗方案及较准确地判断预后。

临床上肾纤维化诊断有赖于肾脏病理学诊断,而肾活检是一种有创性检查,对于有肾活检禁忌证的患者则无法施行；无法广泛的在基层医院开展。并且,鉴于医学伦理学,难以通过重复肾活检对病情作动态监测,而且患者也不易接受。因此,寻找一组无创性诊断指标对肾纤维化的诊断、病情动态观察、疗效的客观评价,有着积极的临床意义。

过去，一些血、尿蛋白被用于肾纤维化的诊断，如透明质酸、层粘蛋白、ⅲ型前胶原、ⅳ型胶原等[许筠，张少山，程保智，等.测定血清等对肾纤维化诊断的意义.兰州大学学报(医学版)，2011，37(4)：24-27、32.]，可以在一定程度上反应肾纤维化的进程，但这些蛋白直接暴露于体液中，容易降解而使结果不稳定，不能实时的反应病变。mirnas分子是近年研究的热点，但目前还没有得到公认的用于检测肾纤维化的mirnas分子诊断标志物。

近年来,液体活检方法诊断肾纤维化的价值日益受到人们的重视。尿外泌体(exosome)膜中包含特征性蛋白和核酸，比裸露的蛋白、核酸更稳定的反映肾小球和肾小管细胞损伤和修复情况、间质炎症、基质沉积等，从而反应纤维化和疾病进程。同时，由于尿液取样方便，无创且可反复取样，因此，检测尿外泌体中标志性分子，成为液体活检研究中的热点，可以实时了解肾纤维化的进程。

比如，[lvll，caoyh，nihf，etal.microrna-29cinurinaryexosome/microvesicleasabiomarkerofrenalfibrosis[j].amjphysiolrenalphysiol，2013，305(8):f1220-f1227.]等研究发现肾纤维化患者尿液中的mir-29c较健康人呈低表达，能有效预测肾小球滤过率估算值(egfr)和小管间质性纤维化程度，且能特异性区别轻度、中度和重度肾纤维化。因而，尿液exosome中的mir-29c与肾功能和纤维化程度的相关性，可以作为一种新的非侵入性肾纤维化指示分子。

但是，目前提取分离外泌体的方法多样，包括超速离心、密度梯度离心、免疫磁珠、超滤或试剂盒等方法，这些方法各有优缺点，超速离心法需要超速离心机，过程比较费时，且回收率不稳定(可能与转子类型有关)，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受ph和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。试剂盒价格昂贵，不适合大规模检测。

技术实现要素：

本发明提供了一种检测尿外泌体中的mir-29c的试剂盒和方法。

本发明检测尿外泌体荷载mirnas的试剂盒，它包括外泌体提取试剂和mirnas检测试剂，其中，提取试剂为聚乙二醇和氯化钠的混合溶液。

优选地，所述聚乙二醇和氯化钠的混合溶液中，聚乙二醇的浓度为0.16～0.24g/ml，所述氯化钠的浓度为0.0584g/ml。

优选地，所述聚乙二醇和氯化钠的混合溶液中，聚乙二醇的浓度为0.16g/ml。

优选地，所述mirnas检测试剂为qpcr检测试剂，优选地，所述qpcr检测试剂为基于茎环法的m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)试剂盒。

优选地，它还包括rna提取试剂，所述rna提取试剂为trizol试剂。

本发明还提供了一种检测尿外泌体荷载mirnas的方法，步骤如下：

(1)取尿液，采用权利要求1～4任意一项所述试剂盒中的提取试剂提取尿外泌体；

(2)提取尿外泌体中的总rna，采用权利要求1～5任意一项所述试剂盒中的检测试剂检测，即可。

步骤(1)中，所述提取的方法如下：

1)取待检样品，离心，取上清；

2)将提取试剂加入步骤1)的上清中，混匀，反应12h以上，离心，弃上清，收集沉淀，即可。

步骤1)中，所述离心是在4℃、2000g条件下离心10分钟。

步骤2)中，反应的温度是4℃；离心是在4℃、3580g条件下离心1h。

本发明还提供了前述试剂盒在制备肾纤维化检测试剂中的用途。

本发明采用试剂盒包含提取外泌体的试剂以及mir-29c的检测试剂，本发明外泌体提取试剂可以有效提取外泌体，收率高，制备得到的产品纯度也较高，可以有效检测外泌体中的mir-29c，同时操作简便，不需要超速离心，易于推广应用，成本低廉，临床应用前景良好。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1外泌体检测结果：a.外泌体电镜(×15.0k)，b.外泌体westernblot结果，c.nta分析外泌体粒径分布。

图2mirna-29c水平roc曲线。

具体实施方式

实施例1本发明检测试剂盒的组成

(1)外泌体提取试剂

取聚乙二醇0.8g；氯化钠0.292g，加双蒸水，混匀，定容到5ml，得聚乙二醇-氯化钠混合溶液。

(2)rna提取试剂

可以采用常规的rna提取试剂，如trizol试剂(invitrogen)。

(3)检测试剂

基于poly-a加尾法的midetectatracktmmirnaqrt-pcr试剂盒(广州锐博)。

实施例2本发明检测试剂盒的组成

(1)外泌体提取试剂

取聚乙二醇0.8g；氯化钠0.292g，加双蒸水，混匀，定容到5ml，得聚乙二醇-氯化钠混合溶液即。

(2)rna提取试剂

可以采用常规的rna提取试剂，如trizol试剂(invitrogen)。

(3)检测试剂

m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)试剂盒。

实施例3本发明检测试剂盒的组成

(1)外泌体提取试剂

取聚乙二醇1.2g；氯化钠0.292g，加双蒸水，混匀，定容到5ml，得聚乙二醇-氯化钠混合溶液。

(2)rna提取试剂

可以采用常规的rna提取试剂，如trizol试剂(invitrogen)。

(3)检测试剂

m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)试剂盒。

实施例4本发明mir-29c的检测方法

一、尿液收集与保存

1.研究对象：选取2016年10月至2017年2月成都中医药大学附属医院和四川省人民医院肾病内科住院的经肾穿刺诊断为肾纤维化的患者25例设为研究组。其中男20例，女19例。年龄31～72岁，平均(61.3±10.3)岁。肾组织均经he、masson染色检查证实，符合肾纤维化诊断标准。排除①年龄＜18岁者或伴有尿路感染、sle、器官移植的患者。②因心血管疾病具有明显症状、体征的严重合并症而使用糖皮质激素和免疫抑制剂的患者。③孕妇及哺乳期患者。④合并恶性肿瘤患者。⑤有明显其他器官纤维化患者(如肝纤维化、肺纤维化、大面积纤维疤痕等)。⑥其他研究者认为不适合纳入研究的患者。将同期医院体检中心确诊的的健康志愿者15例设为对照组，其中男12例、女8例，年龄46～79岁，平均(60.25±8.0)岁。本研究获医院伦理委员会批准。

2.尿液收集与保存：健康志愿者于体检中心采清晨第一次晨尿标本，肾纤维化患者于肾穿刺术后7日内收集晨尿标本20ml以上，加入蛋白酶抑制剂后，-80℃冻存。收集患者近期血尿常规及肝肾功结果，及其他一些异常检查结果。

研究组和对照组在性别、年龄间无统计学差异(p＞0.05)；血中尿素氮、肌苷的表达较对照组增高，差异有统计学意义(p＜0.05)。详见表1。

表1研究对象的临床、实验室结果情况表

二.尿外泌体的分离

分离方法：将保存于-80度的尿在冰上融化，3000g，4℃离心10min。将上清转移至新的ep管中，加入5/7体积的聚乙二醇-氯化钠混合溶液，轻轻颠倒混匀，4℃孵育过夜，4000g离心60min，去除上清，保留沉淀备用。

检测：

①分析外泌体的粒径和浓度：采用nanoparticle-trackinganalysis(nta)分析颗粒的数量和粒径分布。将上述沉淀用30μl无颗粒pbs重悬，测试前再稀释1000倍。

②透射电镜观察外泌体的形态：醋酸双氧铀负染外泌体后，80kv-120kv成像观察外泌体电镜结构。

③westenblot检测外泌体标志物：采用sds上样缓冲液充分提取外泌体蛋白，考马斯亮蓝染色观察蛋白分布情况，10％sds-page分离蛋白，湿转法将蛋白转移到pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入cd63(abcam,usa)和cd9(abcam，usa)抗体(1:1000)，4℃封闭过夜，tbs-t洗3次，加入hrp标记的2抗(1:1000)，室温孵育1h，增强化学发光法显色，胶片记录。

本实验获得的血清外泌体大致呈圆形、部分有凹陷，粒径在100nm以下(图1a)，表达cd9，cd63等外泌体的标志分子，且研究组和对照组间无明显差异(图1b)。进一步的nta分析显示，分离到的外泌体粒径并不均一，主要分布在40和100nm附近(图1c)，说明成功分离了人尿外泌体。

三.外泌体rna抽提和定量及实时定量pcr

采用trizol抽提尿外泌体的总rna。

采用基于茎环法的m-mlvfriststrandcdnasynthesiskit(omega)和greenpcrmastermix(appliedbiosystems)试剂盒和7500realtimepcrsystem(appliedbiosystems)检测mir-29c和内参基因snrna-u6，各样本重复检测3次。

研究组尿外泌体中mir-29c的表达：采用qpcr检测尿外泌体中mir-29c，其相对表达水平以方程2^-△ct计算，其中△ct＝(ctmirna-ctu6)。详见表2。

表2肾纤维化患者和健康志愿者尿外泌体源mirna-29c水平情况表

尿外泌体中的mir-29c表达量与肾纤维化程度的关系：为评价尿外泌体中mir-29c的水平与肾纤维化程度之间的关系，以均值±标准差表示mirna表达情况，两组比较采用独立样本t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。以受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，简称roc曲线)评估mir-29c对肾纤维化诊断的特异度和敏感度。详见图2。

实验结果：肾纤维化病例中mir-29c在所有病例中均显著降低，说明肾组织特异性mir-29c以外泌体形式进入尿液，其水平较对照组显著降低，且表达量与肾纤维化的程度呈负相关，roc曲线分析显示曲线下面积(auc)分别为0.947，因此，可以准确检测肾纤维化的程度。

实验结果说明，本发明方法可以有效提取尿液外泌体，并且准确检测尿液中的mir-29c，进而用于肾纤维化的诊断，临床应用前景良好。