一种心肌肌钙蛋白I的高灵敏定量检测方法与流程

本发明涉及一种心肌肌钙蛋白i的高灵敏定量检测方法，属于生物医学检测
技术领域：
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背景技术：
：心肌肌钙蛋白是心肌的收缩调节蛋白，由心肌肌钙蛋白i(ctni)、心肌肌钙蛋白c(ctnc)和心肌肌钙蛋白t(ctnt)三个亚单位构成，其中ctni由于具有高度的心肌特异性，成为临床诊断心肌梗死的首选标志物。ctni的高灵敏检测对于提高临床上急性心肌梗死的早期诊断率、快速分诊、危险分层和预后评估具有重要意义。目前常见的ctni定量检测方法包括放射免疫法(ria)、酶联免疫吸附法(elisa)、化学发光法、试纸条快速检测等，这些方法对ctni的检测灵敏度通常在ng/ml水平，难以满足临床诊断对ctni高灵敏检测的需求，因此建立准确灵敏的ctni定量检测方法对心肌梗死的早期诊断具有重要的现实意义和临床应用价值。近年来，由于核酸的易合成、易修饰和可扩增的特点，使得基于核酸的高灵敏度蛋白检测方法受到广泛关注。目前涌现出了许多新型的高灵敏的检测方法，如免疫聚合酶链式反应、免疫滚环扩增反应(irca)、邻位连接技术等，这些检测方法的灵敏度与特异性都明显高于传统的elisa方法。其中，滚环扩增技术(rca)是借鉴自然界中环状病原生物dna分子滚环式复制方式建立的核酸扩增技术，在具有链置换活性的dna聚合酶作用下由一条引物即可引发沿环形dna模板的链置换合成，实现环状dna模板的体外等温线性扩增，具有灵敏、特异、操作简便的特点。将普通rca技术与抗原抗体的免疫反应相结合产生了irca方法。在该方法中，识别靶分子的抗体上结合了一段可以与环状模板互补的寡核苷酸引物，在具有链置换或解旋活性的酶的作用下，扩增出一条由多段与环状模板互补的重复序列构成的单链dna。值得一提的是，irca方法中作为探针分子的抗体，易受ph、温度等环境条件的影响而变性，且合成价格昂贵。而经指数富集配体系统进化(selex)技术筛选出来的核酸适配体是一段dna/rna序列，能够与多种目标物质进行高选择性、高特异性的结合，已被广泛地用于生物传感器领域。相比于抗体，核酸适配体能发生亲和作用的范围更广，成本更低，易于修饰且性质更稳定。因此，核酸适配体作为探针分子在蛋白检测领域具有广阔的发展空间。到目前为止，基于核酸适配体对ctni的特异性识别、核酸的滚环扩增及荧光共振能量转移技术的ctni定量检测方法未见报道。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种心肌肌钙蛋白i的高灵敏定量检测方法，主要是通过核酸适配体对心肌肌钙蛋白i进行特异性识别，并利用核酸的滚环扩增技术和基于氧化石墨烯(go)的荧光共振能量转移技术，实现对ctni的准确灵敏的定量检测，所述检测方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便以及成本低等优点。本发明的目是通过以下技术方案实现的：一种ctni的高灵敏度定量检测方法，所述方法步骤如下：(1)将包被缓冲液稀释后的ctni抗体包被至黑色酶标板上，然后在37℃下孵育2h；(2)弃去黑色酶标板上的液体，再加入封闭液，并在4℃下封闭1h以上；(3)弃去黑色酶标板上的液体，用pbst洗涤黑色酶标板3～5次，且完成最后一次洗涤后，倒去液体并拍干；(4)将黑色酶标板上的孔划分成不同的实验组，分别将不同浓度的ctni以及含ctni的待测样品加入到不同的实验组中，然后在37℃下孵育1h；(5)重复步骤(3)的操作；(6)向黑色酶标板中加入用筛选缓冲液稀释的适配体环化产物，然后在37℃下孵育1h；(7)重复步骤(3)的操作；(8)向黑色酶标板中加入rca体系，并在37℃下反应12h～15h；(9)弃去黑色酶标板中的液体，先用pbst洗涤2～5次，再用pbs洗涤2～5次，且完成最后一次洗涤后，倒空液体并拍干；(10)向黑色酶标板中加入检测体系后检测荧光强度，根据检测结果绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测样品中ctni浓度；其中，激发波长为492nm，检测波长为520nm；步骤(1)中，所述包被缓冲液的组成成分及各成分的浓度如下：na2co315mm，nahco335mm，水为溶剂；ctni抗体的体积与包被缓冲液的体积比为1:1000。步骤(2)中，所述封闭液由bsa(牛血清白蛋白)和pbst组成；其中，1mlpbst中含有1mgbsa，所述pbst是含有体积分数为0.05％twen-20的磷酸盐缓冲溶液。步骤(4)中，在0～500pg/ml范围内选择6组以上不同浓度的ctni。步骤(6)中，适配体环化产物在筛选缓冲液中的浓度为50nm；所述筛选缓冲液的组成组分及各成分的浓度如下：nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo4·12h2o6.5mm，nah2po4·2h2o1.8mm，mgcl21.47mm，水为溶剂；所述适配体环化产物的组成成分及各成分的浓度如下：适配体引物复合物(ap)0.1μm，锁式探针(lp)0.1μm，t4dna连接酶10u，t4dna连接酶buffer，水为溶剂；其中，适配体引物复合物的核苷酸序列选自序列表中的seqidno.1；锁式探针的核苷酸序列选自序列表中的seqidno.2。进一步的，所述适配体环化产物的制备步骤如下：将适配体引物复合物、锁式探针、t4dna连接酶、t4dna连接酶buffer以及去离子水混合，然后置于37℃下反应2h，再沸水浴5min～10min，得到适配体环化产物。步骤(8)中，rca体系的组成成分及各成分的浓度如下：phi29dna聚合酶10u，phi29dna聚合酶缓冲液，dntp(脱氧核糖核苷三磷酸)0.5mm，水为溶剂。步骤(10)中，检测体系的组成成分及各成分的浓度如下：氧化石墨烯25μg/ml，fam标记的ssdna探针60nm，水为溶剂；其中，fam标记的ssdna探针中的的ssdna核苷酸序列选自序列表中的seqidno.3。有益效果：(1)使用易合成、易修饰、可扩增、便于操作且能与ctni特异性结合的核酸适配体代替蛋白检测中常用的抗体，直接在适配体上进行引物修饰，大大降低了实验难度与成本；(2)采用rca反应作为信号放大手段，将对蛋白的检测转化为对扩增产物的检测，大大提升了检测灵敏度；而且结合基于氧化石墨烯的荧光共振能量转移技术，实现了rca产物的检测，进而准确灵敏的实现了ctni的定量检测。本发明所述检测方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便以及成本低等优点，符合临床检测的需求。附图说明图1为本发明所述检测方法的原理示意图。图2为实施例1中环化产物与适配体对ctni的亲和力表征对比图。图3为实施例2中不同浓度的氧化石墨烯对fam标记探针的淬灭效率图。图4为实施例3中ctni定量检测的标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。以下实施例中：核苷酸序列表中seqidno.1所述的适配体引物复合物(ap)序列如下：gcctgttgtgagcctcctaactacatgttctcagggttgaggctggatggcgatggtggc60atgcttattcttgtctcccttttttgtccgtgctagaaggaaacagttac110核苷酸序列表中seqidno.2所述的锁式探针(lp)序列如下：tagcacggacatatatgatggaccgcagtatgagtatctcctatcactactaagtggaag60aaatgtaactgtttccttc79核苷酸序列表中seqidno.3所述的ssdna探针序列如下：gtttccttctagcac15适配体引物复合物、锁式探针以及fam标记的ssdna探针均由上海生工生物工程股份有限公司合成。包被缓冲液中含有na2co315mm，nahco335mm以及作为溶剂的水；封闭液由bsa和pbst组成；其中，1mlpbst中含有1mgbsa，所述pbst是含有体积分数为0.05％twen-20的磷酸盐缓冲溶液；筛选缓冲液中含有nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo4·12h2o6.5mm，nah2po4·2h2o1.8mm，mgcl21.47mm以及作为溶剂的水；多功能酶标仪：synergy2，美国柏腾；检测荧光强度的激发波长为492nm，检测波长为520nm。实施例1rca反应中，环化反应的成功是后续扩增反应的基础，可通过两种方式进行环化反应：第一种方法为原位环化，即在固定了ctni的透明96孔板上加入ap，37℃孵育1h，再加入lp、t4dna连接酶以及t4dna连接酶buffer，37℃孵育1h，在透明96孔板上进行环化连接。但是此方法步骤较为繁琐，实验时间较长。第二种方法为将预先制备好的适配体环化产物加入已固定了ctni的黑色96孔酶标板上，37℃孵育1h。此方法操作简便，可以一次性制备大量适配体环化产物备用，减少实验时间。通过生物素修饰的ap与链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶(hrp)之间的亲和作用，以hrp催化底物四甲基联苯胺(tmb)的颜色反应为依据，考察适配体环化产物对目标蛋白ctni的亲和力和特异性。其中，适配体环化产物的制备方法如下：取1μm5‘标记生物素的ap5μl、1μmlp5μl、t4dna连接酶0.5μl以及t4dna连接酶buffer5μl，再用去离子水补齐至50μl，然后将混合溶液置于37℃下反应2h，再沸水浴10min，使酶失活，得到适配体环化产物，并放于-20℃保存待用。表1实验组1实验组2实验组3环化产物+ctni标记的ap+ctni环化产物+胰蛋白酶实验操作如下：(1)用包被缓冲液分别将ctni、胰蛋白酶稀释为5μg/ml；将透明96孔板上的孔划分成3个实验组后，再将包被缓冲液稀释后的ctni包被至实验组1和实验组2的孔中，包被缓冲液稀释后的胰蛋白酶包被至实验组3的孔中，且每个孔中加入100μl，4℃包被10h；(2)弃去透明96孔板上的液体，每个孔中再加入300μl封闭液，4℃封闭1h；(3)弃去透明96孔板上的液体，每孔中加入300μlpbst洗板3次，最后一次冲洗后，倒空液体并拍干；(4)用筛选缓冲液将所制备的适配体环化产物的浓度稀释至60nm后，向实验组1和实验组3的每个孔中加入100μl，同时向实验组2的每个孔中加入同等浓度和体积的5‘标记生物素的ap，37℃孵育1h；(5)重复步骤(3)；(6)向透明96孔板上的每孔加入按1:2000的体积比稀释的hrp标记的链霉亲和素100μl，37℃孵育1h；(7)弃去透明96孔板上的液体，每孔用300μlpbst洗板3次，然后每孔中加入300μlpbst浸泡5min，倒空液体并拍干，再用300μlpbs(ph＝7.4的磷酸盐缓冲液)清洗两次；(8)向透明96孔板上的每孔加入tmb显色液100μl，避光显色5min～30min，时刻观察溶液颜色，若蓝色出现褪色，立即向每孔加入50μltmb显色终止液终止反应；反应停止后，酶标仪450nm读取吸光值。根据图2的测试结果可知，实验组1中的适配体环化产物对ctni仍具有较好的特异性和较高的亲和力，且与实验组2中5‘标记生物素的ap的结果相比没有显著性差异，说明适配体环化产物中的环状结构并未影响ap对目标蛋白ctni的亲和力和特异性。实验组3说明适配体环化产物对于胰蛋白酶没有特异性识别作用。实施例2氧化石墨烯具有一系列独特的化学性质和结构，对单链dna具有很强的吸附作用，此时能量供体与受体靠近，发生荧光共振能量转移，荧光淬灭；但当单链dna与其互补序列结合后，形成的双链dna带有大量负电荷，与氧化石墨烯产生排斥，使氧化石墨烯的吸附作用变弱，从表面脱落，此时荧光基团无法将能量传递给受能量体，荧光恢复，从而达到检测的目的。氧化石墨烯对标记了fam荧光基团的ssdna探针的淬灭是建立氧化石墨烯传感器的关键步骤。目标序列不存在时，氧化石墨烯传感器处于关闭状态，此时，氧化石墨烯的淬灭效率直接影响到检测时的背景信号值，从而对传感器的灵敏度造成影响，因此，我们对氧化石墨烯淬灭荧光探针的浓度进行了优化分析。设定氧化石墨烯浓度梯度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml，将不同浓度的氧化石墨烯分别与60nmfam标记的ssdna探针在室温避光条件下混合孵育5min，再用多功能酶标仪测定其荧光强度。根据测试结果分析不同浓度的氧化石墨烯对荧光检测探针的淬灭效率，详见图3所示。从图3可知，随着氧化石墨烯浓度的增大，对检测探针荧光的淬灭效率越高，在25μg/ml浓度时，可以使90％的荧光淬灭，因此在实验中选取浓度为25μg/ml的氧化石墨烯进行后续实验。实施例3将所建立的基于核酸滚环扩增和荧光共振能量转移的定量检测方法用于ctni的定量检测中，检测原理如图1所示，具体的检测步骤如下：(1)将包被缓冲液稀释后的ctni抗体包被至黑色96孔酶标板上，且每孔100μl，然后在37℃下孵育2h；(2)弃去黑色96孔酶标板上的液体，每孔中再加入300μl封闭液，并在4℃下封闭1h；(3)弃去黑色96孔酶标板上的液体，每孔中加入300μlpbst洗涤黑色96孔酶标板3次，倒去第三次的洗涤液体并将黑色96孔酶标板拍干；(4)将黑色96孔酶标板上的孔划分成10个实验组，分别将0pg/ml、50pg/ml、75pg/ml、100pg/ml、150pg/ml、250pg/ml和500pg/ml的ctni以及三组待测样品加入到10个不同的实验组中，且每个孔中加入100μl，在37℃下孵育1h；为表征本发明所述检测方法对临床样本的检测能力，在人血样本中分别加入浓度为75pg/ml、150pg/ml以及250pg/ml的ctni标准样品，得到三组含有不同ctni浓度的待测样品；(5)重复步骤(3)的操作；(6)向黑色96孔酶标板的每个孔中加入100μl用筛选缓冲液稀释的适配体环化产物，然后在37℃下孵育1h；(7)重复步骤(3)的操作；(8)向黑色96孔酶标板每个孔中加入60μlrca体系，并在37℃下反应12h；(9)弃去黑色96孔酶标板中的液体，每个孔先用pbst洗涤3次，再用pbs洗涤3次，倒去最后一次的pbs洗涤液体并将黑色96孔酶标板拍干；(10)向黑色96孔酶标板的每个孔中加入200μl检测体系，然后在多功能酶标仪上检测荧光强度；根据检测结果，以荧光强度为纵坐标，以ctni浓度为横坐标，进行线性回归得到的标准曲线方程为y＝7.177x–66.995，r2＝0.983，详见图4；通过计算空白值的标准偏差σ，得到σ＝12.12；按照检测限＝3σ可得，3σ＝36.36，代入标准曲线方程，计算得到该方法的检测限为14.40pg/ml；同理，按照定量限＝10σ可得，该方法的定量限为26.23pg/ml。(11)根据对三组待测样品测得的荧光强度以及步骤(10)中得到的标准曲线，计算得到三组待测样品中ctni浓度。步骤(1)中，ctni的体积与包被缓冲液的体积比为1:1000。步骤(6)中，适配体环化产物在筛选缓冲液稀释中的浓度为50nm；所述适配体环化产物中含有适配体引物复合物0.1μm，锁式探针0.1μm，t4dna连接酶10u，t4dna连接酶buffer以及作为溶剂的水。步骤(8)中，rca体系中含有phi29dna聚合酶10u，phi29dna聚合酶缓冲液，dntp0.5mm以及作为溶剂的水。步骤(10)中，检测体系中含有氧化石墨烯25μg/ml，fam标记的ssdna探针60nm以及作为溶剂的水。将三组待测样品中实测的ctni浓度与加入的ctni标准样品的浓度作比，得出回收率，结果详见表2。根据表2可知，采用本发明所述方法的回收率在95％～105％之间，准确度较高。表2ctni浓度(pg/ml)75150250回收率(％)100.2±2.197.6±2.7104.0±2.3综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。核苷酸序列表<110>北京理工大学<120>一种心肌肌钙蛋白i的高灵敏度定量检测方法<160>3<210>1<211>110<212>dna<213>人工序列<220><223>适配体引物复合物<400>1gcctgttgtgagcctcctaactacatgttctcagggttgaggctggatggcgatggtggc60atgcttattcttgtctcccttttttgtccgtgctagaaggaaacagttac110<210>2<211>79<212>dna<213>人工序列<220><223>锁式探针<400>2tagcacggacatatatgatggaccgcagtatgagtatctcctatcactactaagtggaag60aaatgtaactgtttccttc79<210>3<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>ssdna探针<400>3gtttccttctagcac15当前第1页12