一种检测沙门氏菌的方法与流程

本发明涉及一种检测沙门氏菌的方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术：

沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是革兰氏阴性、细胞内寄生的一种肠道菌。该菌广泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，对人类造成很大威胁。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙门氏菌每年会导致约四万美国人病倒，约600人死亡。在我国沙门氏菌是食物中毒中最常见的致病菌，占食物中毒的第一位。沙门氏菌病的临床症状主要包括头痛、腹痛、发热等，死亡率在1%，对人危害很大。

目前报道的检测沙门氏菌的方法包括传统的培养方法、酶联免疫法、pcr技术等。传统的沙门氏菌检测方法检测周期长达一周，工序繁琐，设备昂贵，这远远不能满足要求。因此，食品工业急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对食品中的沙门氏菌进行检测。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中检测沙门氏菌的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快、成本低的基于血红素/g-四联体诱导dna银纳米簇光致电子转移检测沙门氏菌的方法。

本发明中一共用到了4条dna链，其序列分别是：

h1：5’-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaagatccccgcattact-3’（seqidno.1）；

primer：5’-agtaatgcgg-3’(seqidno.2)；

h2：5’-ggtagttattcaaagatgagtaggttttggttgagtactttgaataactaccttgggtagggcgggttggg-3’(seqidno.3)；

h3：5’-cctccttcctcccggtagttattcaaagtacacaagcaaaacctactcatctttgaataactaccgcc-3’(seqidno.4)；

其中h1下划线标记部分是沙门氏菌的aptamer，黑色字体是nt.alwi的识别位点，黑色斜体部分是primer的互补序列，当目标物与aptamer结合打开发夹h1后，引物primer与发夹的黑色斜体部分结合，在phi29聚合酶的作用下进行dna的复制同时实现了目标物的循环，形成的双链dna在nt.alwi内切酶的作用下产生引发链置换的trigger序列。此外，将aptamer设计到发夹结构中，增强了传感器的特异性。h2下划线标记的是形成g-四联体的序列，它可以与血红素形成血红素/g-四联体复合物，黑色斜体字体是与产生的trigger碱基互补的序列，h3下划线标记的是形成银纳米簇的序列。trigger将h2打开后，h2暴露的部分又能将h3打开，通过链置换的方式h3与h2形成完全互补的双链结构，同时将trigger置换下来用于下一次的循环，进一步实现信号放大，而形成的h2-h3双链结构将血红素/g-四联体复合物与dna银纳米簇的距离拉近，血红素/g-四联体的复合结构能够诱导dna银纳米簇进行光致电子转移，因此dna银纳米簇的荧光被猝灭。通过测量荧光强度来定量检测沙门氏菌。

本发明中沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过链置换的方式来实现信号的放大，从而实现沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：当有沙门氏菌存在时，沙门氏菌通过与其aptamer的特异性结合将h1打开，使得primer与h1斜体下划线字体部分碱基互补配对，并且primer作为引物在phi29聚合酶的作用下进行h1的复制，同时实现了目标物的循环（循环i）。形成的双链结构中含有nt.alwi内切酶的识别序列(h1黑色字体)和剪切序列(h1黑色字体的互补序列)，因此在nt.alwi内切酶的作用下，产生大量的trigger用于引发链置换，而剩余的部分在phi29的作用下重复上述过程，继续对h1进行循环复制(循环ii)，产生更多的trigger。此外，trigger能够打开h1，这使得更多的primer与h1结合，在phi29的作用下进行dna复制，将trigger置换下来用于下一次循环，同时又产生新的trigger(循环iii)。通过上述无限次循环实现指数放大，产生大量的trigger。产生的trigger能够与h2的紫色部分结合打开发夹，h2的黑色部分又可以将h3打开，h3通过链置换与h2完全结合将trigger置换下来，置换出的trigger将继续打开别的h2，然后重复上述过程，这样trigger可以进行无限次的循环，从而实现信号放大。此外，由于h2-h3形成的双链结构拉近了血红素/g-四联体复合物与dna银纳米簇的距离，使得dna银纳米簇发生光致电子转移，荧光猝灭，产生信号。

在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是90min。

所述的检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

（1）进行dna银纳米簇的合成；

（2）将目标菌加入到均相反应溶液中，均相反应溶液包含h1、primer、phi29聚合酶、dntps、nt.alwi内切酶、h2和h3；

（3）荧光仪检测荧光强度。

所述的制备方法，优选dna银纳米簇的合成操作步骤如下：

将15μl的100μmh3和73μl的20mmpb缓冲液（ph7.0）加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag⁺与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min；

30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上备用。

所述的制备方法，优选均相反应操作步骤如下：

将h1、primer、phi29聚合酶、dntps、nt.alwi内切酶、h2和h3、血红素加入到锡箔纸包裹的ep管中，再加入目标菌，混合均匀后，于37℃下水浴90min

该发明的检测方式是荧光法检测，利用dna链的碱基互补配对将血红素/g-四联体的复合结构与dna银纳米粒子间的距离拉近，血红素/g-四联体诱导dna银纳米粒子发生光致电子转移，使得dna银纳米粒子的荧光猝灭，产生荧光强度的显著下降。在检测之前，先合成dna银纳米粒子作为信号探针。然后在37℃孵育90min下完成酶辅助的指数放大和链置换的循环放大过程。最后，通过检测溶液的荧光强度进行目标物的检测。其中，荧光仪设置激发波长为565nm，出峰位置在650nm左右。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，将aptamer设计到发夹结构的h1中，能够有效的增强传感器的特异性；具有链延伸功能的phi29聚合酶实现链的延伸，实现目标物的循环放大，在nt.alwi内切酶的协助下，同时产生大量既能打开h1又能打开h2的trigger，phi29聚合酶和nt.alwi内切酶的共同作用实现trigger指数放大，而trigger又引发了h2和h3的链置换等温放大以及血红素/g-四联体复合物诱导dna银纳米粒子发生光致电子转移构建了适体生物传感器。该传感器反应只需要一步，因此具有检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高等优点，可以弥补沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，将aptamer设计到h1中，提高了传感器对沙门氏菌的特异性识别，实现了对目标物的高特异性检测；

2、利用phi29聚合酶与nt.alwi内切酶的共同作用，实现了指数放大，产生大量的trigger，有效地提高了传感器的灵敏度。

3、利用链置换循环放大功能，实现了trigger的循环利用，进一步放大了检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物沙门氏菌的超灵敏性检测；

4、该传感器的构建仅需一步，有效地避免了多步加入样品可能带来的污染，同时具有操作简便、反应速度快等优势；

5、由于使用合成的dna银纳米簇作为信号探针，减少了荧光基团的标记，使得大大地降低了成本；

6、检测原理的过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

7、制备方法简单，性能稳定，dna银纳米簇的荧光稳定，因此传感器的重复性好，适用于食品安全及水体中沙门氏菌的检测和生物传感器产业化的实际应用；

8、制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1h1浓度优化检测结果图；

图3为实施例2phi29聚合酶浓度优化检测结果图；

图4为实施例3反应时间优化检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

所述检测方法，包括以下步骤：

（1）进行dna银纳米簇的合成；

（2）将目标菌加入到均相反应溶液中，均相反应溶液包含h1、primer、phi29聚合酶、dntps、nt.alwi内切酶、h2和h3；

所述的制备方法，优选dna银纳米簇的合成操作步骤如下：

①将15μl的100μmh3和73μl的20mmpb缓冲液（ph7.0）加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag⁺与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min。

②30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上备用。

所述的制备方法，优选均相反应操作步骤如下：

将h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi内切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血红素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的缓冲液（buffer10μl）和5μl灭菌水加入到锡箔纸包裹的ep管中，再加入5μl目标菌，混合均匀后，于37℃下水浴90min。

该发明的检测方式是荧光法检测，利用dna链的碱基互补配对将血红素/g-四联体的复合结构与dna银纳米粒子间的距离拉近，血红素/g-四联体诱导dna银纳米粒子发生光致电子转移，使得dna银纳米粒子的荧光猝灭，产生荧光强度的显著下降。在检测之前，先合成dna银纳米粒子作为分子信标。然后在37℃孵育90min下完成酶辅助的指数放大和链置换的循环放大过程。最后，通过检测溶液的荧光强度进行目标物的检测。其中，荧光仪设置激发波长为565nm，出峰位置在650nm左右。具体反应原理图如图1所示。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，将aptamer设计到发夹结构的h1中，能够有效的增强传感器的特异性；具有链延伸功能的phi29聚合酶实现链的延伸，实现目标物的循环放大，在nt.alwi内切酶的协助下，同时产生大量既能打开h1又能打开h2的trigger，phi29聚合酶和nt.alwi内切酶的共同作用实现trigger指数放大，而trigger又引发了h2和h3的链置换等温放大以及血红素/g-四联体复合物诱导dna银纳米粒子发生光致电子转移构建了适体生物传感器。该传感器反应只需要一步，因此具有检测速度快，操作简便，价格低廉，检测限低，特异性高等优点，可以弥补沙门氏菌现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

实施例1

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

dna银纳米簇的合成操作步骤如下：

①将15μl的100μmh3和73μl的20mmpb缓冲液（ph7.0）加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag⁺与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min。

②30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上备用。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将h1（终浓度分别为0.4μm，0.6μm，0.8μm，1.0μm，1.2μm，1.4μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi内切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血红素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的缓冲液（buffer10μl）和5μl灭菌水加入到锡箔纸包裹的ep管中，再加入目标菌（5μl，10⁵cfu/ml），混合均匀后，于37℃下水浴90min。

b、将a步反应后的溶液（60μl）稀释至100μl，用荧光仪在650nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为565nm，发射波长为650nm，检测范围600nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着h1的浓度增大而减小，当浓度超过1.0μm后，荧光强度趋于稳定。所以h1的最佳终浓度为1.0μm。

实施例2

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

dna银纳米簇的合成操作步骤如下：

①将15μl的100μmh3和73μl的20mmpb缓冲液（ph7.0）加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag⁺与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min。

②30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上备用。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.1u，0.2u，0.3u，0.4u，0.5u，0.6u，0.7u）、dntps（5μl）、nt.alwi内切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血红素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的缓冲液（buffer10μl）和5μl灭菌水加入到锡箔纸包裹的ep管中，再加入目标菌（5μl，10⁵cfu/ml），混合均匀后，于37℃下水浴90min。

b、将a步反应后的溶液（60μl）稀释至100μl，用荧光仪在650nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为565nm，发射波长为650nm，检测范围600nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

结果见图3，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着phi29聚合酶的浓度增大而减小，当浓度超过0.5u后，荧光强度趋于稳定。所以phi29聚合酶的最佳终浓度为0.5u。

实施例3

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

dna银纳米簇的合成操作步骤如下：

①将15μl的100μmh3和73μl的20mmpb缓冲液（ph7.0）加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag⁺与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min。

②30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上备用。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi内切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血红素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的缓冲液（buffer10μl）和5μl灭菌水加入到锡箔纸包裹的ep管中，再加入目标菌（5μl，10⁵cfu/ml），混合均匀后，于37℃下水浴30min，45min，60min，75min，90min，105min，120min。

b、将a步反应后的溶液（60μl）稀释至100μl，用荧光仪在650nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为565nm，发射波长为650nm，检测范围600nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

结果见图4，从图中可以看出，检测到的荧光强度峰值随着反应时间的延长而降低，当反应时间超过90min后，荧光强度趋于稳定。所以最佳的均相反应时间为90min。

实施例4

所述的荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

dna银纳米簇的合成操作步骤如下：

①将15μl的100μmh3和73μl的20mmpb缓冲液（ph7.0）加入到用锡箔纸包裹的ep管中，然后再加入6μl的1.5mm的agno3溶液（确保ag⁺与h3的比例为6:1），震荡1min，于4℃下放置30min。

②30min后，继续向ep管中加入6μl的1.5mm的nabh4，震荡1min，于4℃下黑暗放置6h以上备用。

均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

a、将h1（3μl，20μm）、primer（3μl，5μm）、phi29聚合酶（0.5u）、dntps（5μl）、nt.alwi内切酶（0.5u）、h2（9μl，50μm）、血红素(5μl)和h3（9μl，50μm）、10×的缓冲液（buffer10μl）和5μl灭菌水加入到锡箔纸包裹的ep管中，再加入目标菌（终浓度分别为10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml），混合均匀后，于37℃下水浴90min。

b、将a步反应后的溶液（60μl）稀释至100μl，用荧光仪在650nm处检测荧光峰值强度。

荧光仪激发波长设置为565nm，发射波长为650nm，检测范围600nm-800nm，读取荧光信号变化，检测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

2、10×的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。

检测结果如下表所示：

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>济南大学

<120>一种检测沙门氏菌的方法

<160>2

<210>1

<211>53

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(53)

<223>引物

<400>1

agtaatgcccggtagttattcaaagatgag30

taggaaaagatccccgcattact53

<210>2

<211>10

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(10)

<223>引物

<400>2

agtaatgcgg10

<210>3

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(71)

<223>引物

<400>3

ggtagttattcaaagatgagtaggttttgg30

ttgagtactttgaataactaccttgggtag60

ggcgggttggg71

<210>4

<211>68

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(68)

<223>引物

<400>4

cctccttcctcccggtagttattcaaagta30

cacaagcaaaacctactcatctttgaataa60

ctaccgcc68