一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的HPLC检测方法与流程

本发明涉及一种同时测定虎杖苷和白藜芦醇含量测定方法的建立，属于化学药物分析
技术领域：
，其建立的方法应用于虎杖提取工艺优化结果成分分析，比较得出虎杖苷和白藜芦醇含量的hplc测定方法。
背景技术：
：虎杖是蓼科植物虎杖polygonumcuspidatumsieb.et.zucc.的干燥根茎及根，性微寒、味微苦，具利胆退黄、清热解毒、散瘀止痛、化痰止咳等功效。虎杖含蒽醌、二苯乙烯类、酚类、黄酮类等多种成分，其中二苯乙烯类主要为白藜芦醇和虎杖苷，蒽醌类主要以大黄素、大黄素甲醚为代表，也含有多种蒽醌苷。《中华人民共和国药典》2010年版仅以大黄素和虎杖苷作为虎杖含量测定的指标物，而未涉及白藜芦醇。然而白藜芦醇在虎杖中含量相对较高，是一类有特殊的医疗保健功能、对人体健康有着显著作用的多酚物质。白藜芦醇是一种极有前途的药物中间体，对肿瘤具有化学预防作用，而且对癌细胞具有选择性杀伤力；对治疗心脑血管疾病有很好的疗效，且毒副性很小，便于长期服用。但如何通过虎杖苷和白藜芦醇hplc检测方法的建立，并采用所建立的方法对虎杖提取工艺优化结果进行测定，是本领域技术人员急需解决的技术难题。技术实现要素：本发明的目的是提供一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法，并采用所建立的方法对虎杖提取工艺优化结果进行测定，为虎杖资源全利用提供参考，并为其他基质的虎杖苷和白藜芦醇检测提供参考。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法，高效液相色谱分析的条件包括：采用反相填料色谱柱；检测波长为306nm以及全波长扫描，流速为0.8～1.2ml/min，进样量为2～20μl，柱温为25～35℃，流动相为乙腈-水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水，等度洗脱。一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法，高效液相色谱分析的条件为：采用phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，采用波长为306nm，流速为1.0ml/min，进样量为10μl，柱温为25℃，分析时间为40min，流动相为乙腈-水(23:77)，等度洗脱。一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法，前处理方法考察对象有：提取溶剂(无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、稀乙醇)；提取方法(超声提取、加热回流、冷浸)；提取固料比(1:10～1:100)；提取溶剂体积分数(30％、50％、75％、95％、100％)；提取时间(30min、60min、90min)。一种从虎杖中提取白藜芦醇的hplc检测方法，前处理方法为：取虎杖药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml；密塞，加热回流30分钟，取出，放冷至室温后，用甲醇补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得。根据实际生产条件和经济效应，对虎杖纤维素酶酶解提取工艺进行优化包括：酶解液ph值、酶解温度、酶解时间。根据实际生产条件和经济效应，对虎杖纤维素酶酶解提取工艺最佳为：酶解液ph7.5、酶解温度55℃、酶解时间6小时。一种从虎杖中检测白藜芦醇含量的hplc测定方法，对虎杖纤维素酶酶解提取工艺优化结果成分进行测定。与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：本发明提供一种实用性强、稳定可靠、重现性好的同时测定虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法，为虎杖工艺优化结果成分虎杖苷和白藜芦醇进行测定，并通过提取工艺的考察，同时以虎杖苷、白藜芦醇为指标成分优选最佳提取工艺。附图说明图1a和1b分别为虎杖苷和白藜芦醇的全波长扫描图谱；图1c和1d分别为对照品(虎杖供试品色谱图(306nm))和供试品溶液(虎杖供试品色谱图)扫描图谱(dad全波长扫描)；图2a、2b和2c分别为流动相为乙腈-水的对照品(虎杖苷对照品图谱(乙腈-水)、白藜芦醇对照品图谱(乙腈-水))和供试品(虎杖供试品溶液图谱(乙腈-水))图谱；图3a和3b分别为虎杖苷和白藜芦醇的标准曲线图；图4是不同进样量图谱；图5是不同柱温考察图谱；图6是不同提取方法图谱；图7是固料比考察图谱；图8是不同体积分数色谱图；图9是不同提取时间图谱。具体实施方式本发明所用实验材料为由肇庆怀集基地提供的虎杖。本实验将通过对肇庆怀集所产虎杖药材(批号：20140412)进行分析和研究，建立专属性强、重现性好的同时测定虎杖苷和白藜芦醇检测方法，包括步骤：1)虎杖苷和白藜芦醇hplc色谱分析方法建立；2)酶解提取工艺最优化。纤维素酶酶解最佳条件为ph7.5、酶解温度55℃、酶解时间6小时。经过酶解后，白藜芦醇的含量提高了2.85倍。同时利用所建立的含量测定方法，对纤维素酶酶解工艺优化进行单因素考察，考察酶解温度、酶解液ph值、酶解时间对虎杖活性成分(主要目标产物是白藜芦醇)得率的影响。通过对试验结果的综合分析，进而得出各自较优提取工艺，为虎杖的资源全利用提供参考。本发明所用仪器包括：高效液相色谱仪：thermoultimate3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)：四元泵，二极管阵列检测器(dad)，自动进样器，chromelen色谱工作站。色谱柱：phenomenex5μmevoc18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，天平：千分之一天平(上海恒平ja2003)，万分之一天平(sartoriusbs224s)，十万分之一天平(precisaxr205smdr)；超纯水系统(美国millipore(密理博)公司)。本发明所用试剂与试药包括：甲醇、乙醇、甲酸、磷酸等均为国产分析纯；hplc用甲醇、乙腈均为色谱纯(德国merck公司，darmstadt，gemany)；水为超纯水(电阻率18.2mω.cm)。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1一种从虎杖中提取虎杖苷和白藜芦醇的hplc检测方法，包括以下步骤：1、供试品溶液的制备1.1初步方法称取虎杖粉末(过三号筛)1g，精密称定，置于干燥具塞锥形瓶中。精密移取甲醇50ml，称定重量，超声处理30min。取出，放冷至室温后，用甲醇补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得供试品。1.2对不同检测波长的考察本实验考察了306nm以及全波长扫描。色谱条件：色谱柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(23:77)。体积流量：1.000ml/min；进样量：10μl；如图1a-1d所示，由全波长扫描图谱可见虎杖苷和白藜芦醇在280nm～310nm之间有较大吸收。而在306nm的图谱中，虎杖苷和白藜芦醇的峰形状较好，因此选择306nm为检测波长。1.3对不同流动相的考察本实验考察了乙腈-0.1％甲酸水溶液、甲醇-0.1％甲酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液。色谱条件：色谱柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：上述溶液；体积流量：1.000ml/min；进样量：10μl；检测波长：306nm；实验发现甲醇较乙腈的洗脱白藜芦醇和虎杖苷的能力较差，因此有机相选择乙腈。另外，只有乙腈-水系统较其他加酸的流动相的理论塔板数和不对称因子较好，且图谱峰形较好。因此选用乙腈-水系统作为该实验的流动相组成成分。如图2a-2c所示，即选用乙腈-水溶液作为流动相。1.4不同进样量的考察本实验考察了2μl、5μl、8μl、10μl、20μl不同进样量对虎杖样品分离虎杖苷和白藜芦醇的效果。色谱条件：色谱柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(23:77)溶液；体积流量：1.000ml/min；进样量：2、5、8、10、20μl；检测波长：306nm；实验发现2μl和5μl相对8μl、10μl、20μl峰形好，且无裂峰。如图4所示，2μl和5μl色谱图相差不大，为了含量测定更准确，因此选用5μl作为进样量。1.5不同色谱柱温度的考察本实验考察了25℃、30℃、35℃不同柱温对虎杖样品分离虎杖苷和白藜芦醇的效果。色谱条件：色谱柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25、30、35℃；流动相：乙腈-水(23:77)溶液；体积流量：1.000ml/min；进样量：5μl；检测波长：306nm；实验发现不同温度对色谱图影响不大，如图5所示，为了保护高效液相仪，故选择25℃为柱温。1.6不同柱流速的考察本实验考察了0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min不同流速对分离虎杖样品虎杖苷和白藜芦醇的效果。色谱柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(23:77)溶液；体积流量：0.8、0.9、1.0、1.1、1.2ml/min；进样量：5μl；检测波长：306nm；实验发现各流速的系统适应性结果良好，差异不大，故选择常用的1.0ml/min为流速。1.7确定的色谱条件色谱条件：色谱柱：phenomenex5μmevoc18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(23:77)溶液；体积流量：1.000ml/min；进样量：5μl；检测波长：306nm；2、对虎杖苷和白藜芦醇提取的方法的考察2.1提取方法的考察本实验考察超声提取、加热回流、冷浸的提取效率，如下表1所示。精密称取虎杖粉末(过三号筛)6份，每份2g，精密称定，置于干燥具塞锥形瓶中，精密移取甲醇25ml，称定重量，分别超声处理30min、加热回流30min和冷浸提取12h。取出，放冷至室温后，用甲醇补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得供试品。表1不同提取方法考察结果提取方法虎杖苷平均含量(mg/g)白藜芦醇平均含量(mg/g)总含量(mg/g)超声16.201.5117.71加热回流16.591.8318.42冷浸14.381.2915.66表1，图6的结果显示，加热回流具有更加高的提取效率。2.2提取溶剂的考察本实验考察无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、稀乙醇几种不同溶剂的提取效率。如下表4所示。称取虎杖粉末(过三号筛)2g，精密称定，置于干燥具塞锥形瓶中。分别精密移取甲醇25ml、乙醇25ml、乙酸乙酯25ml以及稀乙醇25ml，称定重量，加热回流30min。取出，放冷至室温后，用甲醇补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得供试品。表2不同提取溶剂考察结果表2的结果显示，乙酸乙酯作为提取溶剂时，虎杖苷相邻有杂峰，故排除。甲醇、乙醇、稀乙醇作为提取溶剂时色谱图相差不大，稀乙醇作为提取溶剂白藜芦醇和虎杖苷的提取总含量最高。因此选择稀乙醇作为提取溶剂。2.3提取固料比的考察本实验考察了不同提取物料比，物料比如表5。表3不同提取提取固料比考察表称取虎杖粉末，分别按表3物料比比例进行精密称定并精密移取稀乙醇，称定重量，加热回流30min。取出，放冷至室温后，用稀乙醇补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得供试品。表4不同固料比考察结果固料比(g/ml)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜芦醇平均含量(mg/g)总含量(mg/g)2-2017.262.0919.352-2519.002.0621.052-5022.572.0924.661-2022.082.0624.141-2522.342.0424.381-5022.572.0624.620.5-2023.272.0525.320.5-2523.052.0525.100.5-5022.972.0725.04实验结果发现，如表4、图7所示，不同物料比所得的色谱图相差不大，1:40(g/ml)作为提取物料比白藜芦醇和虎杖苷的提取量最高。因此选择1:40(g/ml)作为物料比提取。2.4提取溶剂体积分数的考察本研究考察了提取溶剂不同体积分数，30％、50％、75％、95％、100％。称取虎杖粉末(过三号筛)0.5g，精密称定，置于干燥具塞锥形瓶中。分别精密移取不同体积分数乙醇20ml，称定重量，加热回流30min。取出，放冷至室温后，用相应溶剂补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得供试品。表5不同提取溶剂体积分数考察结果提取溶剂(ml)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜芦醇平均含量(mg/g)总含量(mg/g)30％乙醇21.180.9922.171350％乙醇22.362.0824.433875％乙醇21.952.0423.997295％乙醇15.371.7717.1368100％乙醇16.561.9818.5423实验结果显示，如表5、图8所示，各体积分数所得色谱图峰形差别不大，50％作为提取溶剂的体积分数白藜芦醇和虎杖苷的提取量最高。因此选择50％作为提取溶剂的体积分数。2.5提取时间的考察本研究考察了提取时间，30min、60min、90min的提取量。称取虎杖粉末(过三号筛)0.5g，精密称定，置于干燥具塞锥形瓶中。分别精密移取50％乙醇20ml，称定重量，分别加热回流30min、60min、90min。取出，放冷至室温后，用50％补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得供试品。表6不同提取时间考察结果提取时间(min)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜芦醇平均含量(mg/g)总含量(mg/g)3023.112.1925.30326020.631.8322.45639022.241.9424.1746实验结果显示，如表6、图9所示，不同提取时间所得色谱图差别不大，30min作为提取时间白藜芦醇和虎杖苷的提取总含量最高。因此选择30min作为提取时间。2.6供试品制备取虎杖药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20ml。密塞，加热回流30分钟，取出，放冷至室温后，用甲醇补回失去的重量。过滤，取续滤液，即得供试品。根据以上确定的方法，对方法进行方法学考察和对样品进行含量测定。3、方法学考察3.1系统适应性试验取适量供试品溶液和对照品溶液，按1.7项下色谱条件下进行测定，记录色谱图，考察系统适应性，结果如图1所示，供试品色谱与对照品色谱在相同时间上有对应的吸收峰，表明系统适应性良好。3.2线性关系的考察取已知浓度的混合对照品溶液，加甲醇分别稀释成不同浓度的溶液：①409.00μg·ml-1的虎杖苷；②204.50μg·ml-1的虎杖苷；③163.60μg·ml-1的虎杖苷；④81.80μg·ml-1的虎杖苷；⑤20.45μg·ml-1的虎杖苷；⑥16.36μg·ml-1的虎杖苷；⑦8.18μg·ml-1的虎杖苷；⑧4.09μg·ml-1的虎杖苷。①411.00μg·ml-1白藜芦醇；②205.50μg·ml-1的白藜芦醇；③164.40μg·ml-1的白藜芦醇；④82.20μg·ml-1的白藜芦醇；⑤20.55μg·ml-1的白藜芦醇；⑥16.44μg·ml-1的白藜芦醇；⑦8.22μg·ml-1的白藜芦醇；⑧4.11μg·ml-1的白藜芦醇。按1.7项下的色谱条件测定峰面积，并以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归计算，得虎杖苷的回归线方程为y＝220.89x-0.4549，(r2＝0.9996)；白藜芦醇的回归方程为y＝421.22x-0.7082(r2＝0.9997)图3a-3b为线性关系图谱，表明虎杖苷在浓度4.09μg·ml-1～409.00μg·ml-1范围内呈良好线性；白藜芦醇在浓度4.11μg·ml-1～411.00μg·ml-1范围内呈良好线性。3.3重复性试验取虎杖粉末6份，按2.6项下的方法平行制备，结果如下表7所示。表7重复性试验结果重复性试验测得虎杖苷和白藜芦醇含量的rsd分别为0.68％和1.24％，表明该方法重复性良好。3.4精密度试验精密吸取同一份供试品溶液5μl，按上述色谱条件重复连续进样6次，实验结果如下表8所示。表8精密度试验结果测得虎杖苷和白藜芦醇峰面积rsd分别为0.71％和1.36％，表明精密度良好。3.5稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液5μl，按上述色谱条件分别于0、4、8、12、16、20、24h进样，实验结果见下表9所示。表9稳定性试验结果测得虎杖苷和白藜芦醇峰面积rsd分别为0.34％和1.43％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。3.6加样回收试验取上述已知含量的虎杖6份，取约0.25g(已知虎杖苷含量21.77mg/g、白藜芦醇含量1.98mg/g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入分别加入虎杖苷和白藜芦醇混合对照品溶液(虎杖苷5.512mg/ml、白藜芦醇0.4745mg/ml)1ml，按2.6项制备供试品，按1.7项下色谱条件测定，计算回收率，结果如下表10、11所示。表10虎杖苷加样回收测定结表11白藜芦醇加样回收测定结果加样回收试验证明，虎杖苷回收率为102.73％，白藜芦醇回收率为99.45％，符合回收率95％-105％的范围，表明该方法稳定可靠。,一种同时测定虎杖苷和白藜芦醇hplc检测方法的建立，该方法稳定可靠，适用性强。其中虎杖苷和白藜芦醇对照品与供试品溶液图谱见图1a-1d，由图可见，虎杖苷和白藜芦醇对照品与供试品溶液在对应的保留时间都有吸收峰，且峰型较好。实施例21、一种同时测定虎杖苷和白藜芦醇检测方法在虎杖提取工艺优化结果成分分析的应用：1.1虎杖提取工艺优化的供试品溶液制备：根据实际生产应用，本部分研究所使用的试剂为生产中常用的乙醇作为工艺研究试剂。考察因素如表12。表12酶解法单因素考察表名称酶解温度(℃)酶解时间(h)ph值13514.524035.034565.545096.0555246.5660487.077.588.0称取虎杖药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置于干燥具塞锥形瓶中。分别精密移取酶溶液25ml，调整为不同的ph，不同的酶解温度，一定的酶解时间。酶解后，100℃水浴，灭酶活。精密加入无水乙醇50ml，加热回流30min。取出，放冷至室温后，过滤，蒸干，残渣加50％乙醇溶解并定容至25ml容量瓶，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。1.2一种同时测定虎杖苷和白藜芦醇检测方法的应用白藜芦醇检测的色谱条件(参考本发明建立的同时测定虎杖苷个白藜芦醇检测方法)1.3一种同时测定虎杖苷和白藜芦醇检测方法应用的结果分析对最优提取工艺的成分进行分析，结果见图6，表13。由图6可见，该工艺优化后，白藜芦醇的峰吸收相应增加，且峰型较好。表13酶解温度优化结果表14酶解时间优化结果酶解时间(h)虎杖苷平均含量(mg/g)白藜芦醇平均含量(mg/g)总含量(mg/g)133.945.1939.13331.036.6437.67626.148.9635.10表15不同ph值考察结果ph值虎杖苷平均含量(mg/g)白藜芦醇平均含量(mg/g)总含量(mg/g)4.535.593.9139.515.035.283.9439.235.534.113.8938.006.034.333.8838.216.532.084.6536.737.031.424.8336.267.530.915.6536.568.030.245.5835.82由结果可知，酶解温度在40℃时，白藜芦醇提取量相对其他酶解温度偏低，其原因是配制酶解温度为40℃的供试品时，虽均按照加酶量为1.5mg/g原则，但仍在称取纤维素酶量有偏差，酶解温度在55℃时白藜芦醇提取量达到最大，55℃之后，酶蛋白开始变性，酶活性下降，白藜芦醇提取量呈下降趋势。可初步确定本工艺最佳酶解温度为55℃。在酶解时间6h内，白藜芦醇提取量一直呈现出直线上升趋势，在设定的时间点内，6h为最佳酶解时间。酶解ph在4.5-6区间，对纤维素酶的活性没有较大影响，白藜芦醇的提取量差异不大。ph在6-7.5时，随着ph值增大，白藜芦醇的提取量呈现上升趋势。ph＝7.5时，白藜芦醇的提取量达到最大值5.6533mg/g(比原来1.9783mg/g提高了2.85倍)。在ph＞7.5后，白藜芦醇提取量呈下降趋势。可初步确定本工艺最佳酶解ph值为7.5。虎杖最佳提取工艺，可表述如下：称取虎杖药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置于干燥具塞锥形瓶中，精密移取酶溶液25ml，ph为7.5，在55℃条件下进行酶解6小时。酶解后，100℃水浴，灭酶活。精密加入无水乙醇50ml，加热回流30min。取出，放冷至室温后，过滤，蒸干，残渣加50％乙醇溶解并定容至25ml容量瓶，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。本发明建立了同时测定白藜芦醇的hplc检测方法，用于提取工艺优化后虎杖苷和白藜芦醇的测定，该工艺稳定可靠，操作简便省时，能耗较低，为虎杖工艺研究提供参考。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12