一种检测呋喃妥因代谢物量子点免疫层析试纸、制备方法及其应用与流程

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种检测呋喃妥因代谢物量子点免疫层析试纸、制备方法及其应用。

技术背景

呋喃妥因(nitrofurantion)，属于硝基呋喃类抗生素，是一种广谱性抗生素，具有很好的抗菌作用和药动力的特性，药物对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，因价格较低且效果好，曾经在水产养殖业中广泛使用。但长期研究证明，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变、基因突变和有致畸胎副作用，多国已禁止了此类药物在治疗和饲料中的使用。1995年欧盟全面规定禁止使用硝基呋喃类抗菌药物，在动物源性食品中硝基呋喃类药物及代谢物残留的限值为不得检出。2002年美国全面禁止将硝基呋喃类药物用于食源性动物。2004年美国食品和药物管理局(fda)公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部于2002年4月发布193号公告，公布了《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》，规定在所有食品动物中禁止使用硝基呋喃类抗生素，2003年又将水产品硝基呋喃类代谢物纳入残留监控计划。

目前用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是高效液相色谱法(hplc)、液质联用法(lc-ms、lc-ms/ms)和酶联免疫法等。lc-ms、lc-ms/ms和hplc具有高灵敏度高特异性的特点，但样品前处理繁琐、试剂消耗量大、检测时间长、设备昂贵、需专业技术人员进行操作、不适合进行现场快速检测和大量样品的筛选，难以满足大量样本的筛查的需要。酶联免疫分析法虽然灵敏度高，特异性强，但需要酶标仪等仪器设备，检测时间长，并且要求本领域专业技术人员来操作。这些方法难以实现大批量样品的快速检测与现场检测。

量子点(quantumdots，qds)，又称为半导体纳米晶，是一种在光源激发下发射出明亮荧光的半导体纳米晶粒，主要由ⅱ～ⅵ族或者ⅲ～ⅴ族元素组成，如碲化镉(cdte)、硒化镉(cdse)等。与传统荧光材料相比，qds的优点有：具有量子效应和良好的发光性；具有较宽的激发波长和较窄的发射波长；稳定性好；具有良好的生物兼容性；荧光寿命较长。由于量子点具有以上优良特性，使其可能成为分子检测和医学诊断的有力工具，经过近20多年的发展，逐步从细胞、组织标记成像、细胞示踪、活体成像等应用研究开始向临床检测、疾病控制、食品安全检测等领域方向发展。

量子点标记免疫层析技术在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，利用荧光量子点作标记物，将量子点与抗体通过化学反应(cooh与nh2)偶联在一起，当抗体与抗原特异性结合时，量子点就标记于待测抗原上，在紫外灯的照射下呈现不同的荧光强度。其中，控制线(c线)颜色的有无决定着试纸条的有效性，而检测线(t线)的有无则表示着目标物的有无。除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该技术操作简单快速，反应通常只需数分钟至数十分钟，检测结果以肉眼可见的显色条带来判读，安全无污染，具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足和缺陷，利用量子点多波长激发、高强度荧光发射、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，提供一种新型的检测呋喃妥因代谢物的量子点免疫层析试纸条的制备方法及其应用，根据量子点的荧光性质和呋喃妥因代谢物浓度之间的关系，在试纸条上检测代谢物，实现量子点试纸条检测代谢物的定量检测，以解决现有技术灵敏度低，操作复杂，设备要求高等问题。

本发明提供了一种检测呋喃妥因代谢物量子点免疫层析试纸，所述试纸由样品垫、微孔纤维膜、反应膜、吸水垫依次粘贴在支持板上组成，所述微孔纤维膜上具有呋喃妥因代谢物特异性抗体-量子点探针。

所述呋喃妥因代谢物特异性抗体-量子点探针中的呋喃妥因代谢物特异性抗体是以呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述呋喃妥因代谢物特异性抗体为呋喃妥因代谢物特异性单克隆抗体。

所述反应膜上设置有由呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物包被制成的检测线和由兔抗鼠抗抗体包被制成的控制线。

一种检测呋喃妥因代谢物量子点免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

1)将制备的呋喃妥因代谢物特异性抗体加入到制备的量子点中，得到呋喃妥因代谢物特异性抗体-量子点探针；将呋喃妥因代谢物特异性抗体-量子点探针均匀喷覆于微孔玻璃纤维膜表面得到微孔纤维膜；

2)将呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物和兔抗鼠抗抗体分别喷到硝酸纤维素膜上对应的检测线位置和控制线位置上并进行包被，得到反应膜；

3)将微孔纤维膜，反应膜以及样品垫、吸水垫、支持板组装在一起，装入卡盒，加干燥剂密封，得到检测呋喃妥因代谢物量子点免疫层析试纸的制备方法。

5.根据权利要求4所述的检测呋喃妥因代谢物量子点免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述呋喃妥因代谢物特异性抗体的制备方法包括以下步骤：

1)将呋喃妥因代谢物与对羧基苯甲醛反应，制备呋喃妥因代谢物半抗原；

2)将呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联，制备呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物；

3)提取小鼠免疫球蛋白g免疫健康山兔，得到兔抗鼠抗抗体；用呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌呋喃妥因代谢物特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，得到呋喃妥因代谢物特异性单克隆抗体，作为呋喃妥因代谢物特异性抗体。

所述呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物是由呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述呋喃唑酮代谢物半抗原是由呋喃妥因代谢物与对羧基苯甲醛反应得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白。

所述量子点的制备方法为：

将cdcl2.2.5h2o溶解于水中，通氮气除氧20-30mim，再加入巯基乙酸共同溶，用naoh溶液调节到ph值为11.0±0.2，通高纯氮气保护，加入na2teo3溶液和nabh4，继续搅拌下加热溶液至沸腾，反应回流，得到红色cdteqds作为量子点。

上述所述的检测呋喃妥因代谢物的量子点免疫层析试纸条在检测动物源性食品中硝基呋喃类代谢物代谢物的应用。

所述支持板可为pvc支持板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫可为吸滤纸或滤油纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜；所述试纸条外面有试纸条卡壳，卡壳上壳面对应于样品垫位置处开有加样孔，加样孔看见样品垫；所述卡壳上壳面对应于反应膜位置处开有观测窗，观测窗可见检测线和控制线。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测动物组织中呋喃妥因代谢物残留，它包括步骤：

(1)样本前处理；

(2)用试纸条进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明试纸条的检测原理(如图1、2所示)：将处理后的待检样品液滴加于试纸条加样孔中，待检样品液与微孔纤维膜中的量子点探针结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中呋喃妥因代谢物的含量高，则扩散过程中待检样品液中的呋喃妥因代谢物可与量子点探针相结合，进而完全封闭探针上呋喃妥因代谢物的抗原结合点，阻止探针与反应膜上呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物结合，检测线不显色，而兔抗鼠二抗则可与探针结合，控制线显色；若待检样品液中呋喃妥因代谢物的含量低或无，则探针上的抗原结合位点不能被封闭，进而探针会与反应膜上呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联抗原结合，检测线显色，同时兔抗鼠二抗也可与探针结合，控制线显色。如果控制线不显色，则试纸失效。

定性检测或半定量检测：采用紫外灯照射加样反应后的反应膜线域，通过肉眼观察条带发光情况，当控制线(c)显示出荧光条带，而检测线(t)不显色时，判为阳性；当控制线(c)显示出荧光条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，判为阴性；当质控线(c)不显示出荧光条带，则无论检测线(t)显示出荧光条带与否，该试纸均判为无效。

定性检测：取80μl混合液加入到试纸条上的加样孔内，反应3-10min即可读取结果；

定量检测：配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液，然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测，通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线，再将待检未知样品进行同样处理，得到峰面积，根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量。

本方明的有益技术效果是：本发明所述的量子点荧光免疫层析试纸条检测法与酶联免疫吸附法、气相色谱法、液相色谱法等方法相比，具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长、定性定量皆可等优点。其中，采用高特异性的呋喃妥因代谢物特异性单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；用本发明试纸条检测呋喃妥因代谢物的方法简便、快速、准确。

说明书附图

图1呋喃妥因代谢物的量子点免疫层析试纸条的原理图；

图2呋喃妥因代谢物的量子点免疫层析试纸条外形图；

图3呋喃妥因代谢物的量子点免疫层析试纸检测结果判定图；

图4呋喃妥因代谢物的量子点免疫层析试纸条定量检测标准曲线图；

其中，1、支持板，2样品垫，3微孔纤维膜，4检测线，5控制线，6硝酸纤维膜，7吸收垫，8量子点探针，9呋喃妥因代谢物，10兔抗鼠抗抗体，11呋喃妥因代谢物与载体蛋白偶联物，12加样孔，13观测窗，14卡盒。

具体实施方式

实施例1检测呋喃妥因代谢物的试纸的制备

1微孔纤维膜的制备

1.1将呋喃妥因代谢物与对羧基苯甲醛反应，制备呋喃妥因代谢物半抗原；将呋喃妥因代谢物半抗原与载体蛋白偶联，制备呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物；用呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌呋喃妥因代谢物特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，得到呋喃妥因代谢物特异性单克隆抗体(anti-npahdmcab)。

1.2圆底烧瓶中加入0.120g的cdcl2.2.5h2o溶解在100ml三蒸水中，通氮气除氧20-30mim，加入72.7μl巯基乙酸共同溶于200ml三蒸水中，用1.00mol/l的naoh溶液调节到ph值为11.0左右，通高纯氮气30min，在氮气保护下加入na2teo3溶液210μl和20mg的nabh4，继续搅拌下加热溶液至沸腾，反应回流，得到红色cdteqds，作为量子点(qds)。

1.3取1.2中制备的羧基水溶性qds600μl，加入18μl的碳二亚胺盐酸盐(1mg/ml)和800μl的甲醇混合后避光震荡30min，再加入8μl的β-巯基乙醇进行终止，取10ml的anti-npahdmcab(3mg/ml)加入活化的qds中与之混合，避光震荡2h，再加入巯基乙醇稳定qds，进行透析。透析后在1,6300r/min条件下离心3min，去除上清，沉淀重悬于10mmol/lpbs(ph7.4)中，4℃保存，得到呋喃妥因代谢物特异性抗体-量子点探针。

1.4将呋喃妥因代谢物特异性抗体-量子点探针取出放置至室温，用pbs-tbn稀释100-1000倍成量子点标记探针溶液，然后将量子点标记抗体探针均匀喷覆于玻璃纤维膜表面，室温干燥，4℃保存。所用pbs-tbn为含20mm-150mm氯化钠nacl、0.02％-0.1％吐温tween-20、2mg/ml-10m/ml牛血清白蛋白bsa、0.05％叠氮化钠nan3的10mm-100mm磷酸盐缓冲液pb，得到微孔纤维膜。

2反应膜的制备

2.1提取小鼠免疫球蛋白g(igg)免疫健康山兔，得到兔抗鼠抗抗体；

2.2以硝酸纤维素膜固定粘贴在pvc背衬的中间部位，将硝酸纤维素膜置于zx1000点膜仪平台上，将呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物包被缓冲液调节浓度至1mg/ml，并将兔抗鼠二抗用包被缓冲也调节浓度至0.5mg/ml，按照1ul/cm的膜液量，将呋喃妥因代谢物半抗原-载体蛋白偶联物，以及兔抗鼠抗抗体喷到反应膜上对应的检测线和控制线上进行包被，检测线和控制线之间间隔为4mm，放置25～37℃烘箱处理2小时，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有20mm-150mm氯化钠nacl、0.05％-3％聚乙二醇peg20000、0.2％-1％海藻糖、2mg/ml-10m/ml牛血清白蛋白bsa、0.05％叠氮化钠nan3的10mm-100mm磷酸盐缓冲液pb；得到反应膜。

3样品垫的制备

将吸滤纸置于含0.5％牛血清白蛋白(体积百分含量)、0.1mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.2)中浸泡2h，37℃烘2h备用，得到样品垫。

4检测呋喃妥因代谢物试纸的制备

所述试纸是由支持板、样品垫、微孔纤维膜、反应膜、吸水垫组成；所述样品垫、微孔纤维膜、反应膜和吸水垫依次按顺序粘贴在支持板上，样品垫的末端与微孔纤维膜重叠相连、微孔纤维膜的末端与反应膜重叠相连，反应膜的末端与吸水垫重叠相连，样品垫的始端与支持板的始端对齐，吸水垫的末端与支持板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和控制线，均呈与所述试纸条的长相垂直的条线状(如图1、2所示)；用cm4000切条机切成3mm宽的试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，制得量子点荧光免疫层析试纸条。

其中，所述支持板为pvc支持板；所述样品垫为吸滤纸；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜。将上述试纸条装入试纸卡盒内，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。

实施例2检测呋喃妥因代谢物试纸的应用

1样本前处理

取(5.0±0.05)g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入5ml10％三氯乙酸，再加入100μl衍生化试剂，充分振荡3min，在60℃放置1.5h；取出依次加入1ml0.5mol/l磷酸氢二钾溶液、1.5ml2mol/l氢氧化钠溶液和10ml乙酸乙酯，振荡10s，脂肪含量高的样本轻微振荡8～10下；3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；取8ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加入0.6ml0.2mol/l磷酸盐缓冲液，涡动10s充分混匀；3000g以上，室温(20～25℃)离心5min，除去上层有机相，取下层100μl用于分析。

2试纸条灵敏度

用微量移液器吸取100μl待检样品液加入试纸条样品垫中，使微孔纤维膜充分浸入溶液中；室温(20-25℃)孵育5min后，取出试纸条，通过肉眼目测观察其检测线，结果见图2，当呋喃妥因代谢物浓度低于0.1ng/ml时其检测线荧光与0ng/ml空白对照检测线的荧光没有明显差异；当呋喃妥因代谢物浓度为0.3ng/ml时其检测线荧光与0ng/ml空白对照检测线的荧光明显变弱；当呋喃妥因代谢物含量大于或等于1ng/ml范围时，其检测线无颜色出现；此试纸条目测判定检测限为1ng/ml。用荧光试纸条读取仪测定纸条检测线(t)和控制线(c)荧光值，根据机读各浓度呋喃妥因代谢物的荧光值与0浓度荧光值的比值(b/b0)和各呋喃妥因代谢物浓度的对数值拟合绘制标准曲线，见图3。试纸条检测呋喃妥因代谢物浓度范围为0.01–100ng/ml；好的标准曲线呋喃妥因代谢物线性范围为0.1ng/mlto10ng/ml，定量检测试纸条灵敏度为0.58ng/ml。

3试纸条特异性

将呋喃妥因代谢物类似物(呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物)用0.2mol/l的磷酸盐缓冲液(ph7.2)进行稀释，用实施例7中所述的试纸条进行检测，测定试纸条的特异性，实验结果见表1。从表1结果可见，用该试纸条检测呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物等药物时，试纸条控制线和检测线均显色，说明本试纸条对这些药物无交叉反应，特异性较好。

表1试纸条特异性

4添加回收率

将呋喃妥因代谢物加入鱼肉、蟹肉和虾肉空白样品中，添加量分别为0.2ng/g、0.5ng/g、2ng/g、5ng/g，按照前述方法进行样品处理后进行，用试纸条检测，并用荧光读取仪测其检测线荧光值，根据建立的标准曲线计算呋喃妥因代谢物含量及其回收率。实验结果见表2。由

表2可知，鱼肉、蟹肉和虾肉组织中添加回收率为81.5％～108.2％，批内变异系数为8.7％～12.5％。

表2鱼肉、蟹肉和虾肉组织中回收率和变异系数(n＝5)

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