天冬酰胺内肽酶联合整合素α5和整合素β1作为诊断试剂的用途的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1，具体来说是天冬酰胺内肽酶（aep）联合整合素α5和β1在制备诊断上皮性卵巢癌预后效果的试剂中的用途。

背景技术：

上皮性卵巢癌（epithelialovariancancer,eoc）是妇科常见恶性肿瘤之一，死亡率位居妇科肿瘤首位，近70%的患者确诊时已为figo分期iii或者iv期，其主要表现为腹膜广泛种植和转移。腹膜具有慢性“腹膜炎”的特征。上皮性卵巢癌预后较差，如何有效的提高上皮性卵巢癌患者的预后为目前待解决的问题。

天冬酰胺内肽酶（aasparaginylendopeptidase,aep），亦称豆荚蛋白（legumain），系半胱氨酸蛋白酶c13家族的成员。人aep基因定位于14q32.1，由13个内含子及14个外显子构成，具有高度保守性。aep有三种形态：未活化aep、活化aep和完全活化aep。aep的激活和构象的稳定性受到微环境中糖激化、ph值及氧化还原电位等的影响。aep在正常人体组织中较少表达或者不表达，然而，在许多实体肿瘤组织、淋巴瘤及肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,tam）中表达增高，aep与恶性肿瘤的发生发展以及病人的预后密切相关。aep也存在于肿瘤微环境中，能够对抗原蛋白进行加工提呈，激活基质金属蛋白酶，调控肿瘤相关巨噬细胞及调控血管新生因子的释放等。

aep在上皮性卵巢癌中的相关研究并不多见，目前主要停留在功能实验阶段，机制研究不明确，因上皮性卵巢癌在女性肿瘤中发病率及死亡率都很高，早期诊断早期治疗能够提高患者预后，因此，深入探索aep有望成为卵巢癌治疗的新靶点。

整合素，是由α（αsubunit,120-170kda）和β(βsubunit,90-100kda)两个亚单位组成的糖蛋白。整合素表达于上皮性卵巢癌表面，介导上皮性卵巢癌细胞对于细胞外机制的粘附。整合素是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互交流的重要介质。许多癌细胞表达的整合素可以调节细胞的生长、增生、粘附和转移等。整合素α5能够和β1亚单位相结合。上皮性卵巢癌细胞对于腹膜间皮细胞的粘附作用可以被整合素α5和β1所调节。有文献报道称aep能够与肿瘤细胞表面的整合素形成复合物，整合素能够促进aep的活化，从而增强其生物学功能。因此，深入研究整合素α5和β1有助于探索eoc腹膜转移的新机制。

外泌体，直径在30-100nm之间，能够在细胞间传递dna、rna、脂质及蛋白质等生物学分子。外泌体能够实现肿瘤细胞与肿瘤微环境中的内皮细胞、间皮细胞、免疫细胞等多种细胞的信号交流。许多文献有报道外泌体大量存在于eoc患者的腹水中，而进展期eoc常伴随腹水形成。因此，我们从eoc患者血清及腹水来源的外泌体中对于天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1进行检测，并从中探索其与eoc患者预后的相关性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种天冬酰胺内肽酶（aep）联合整合素α5和整合素β1在制备诊断上皮性卵巢癌或者诊断上皮性卵巢癌预后效果的试剂中的用途，所述的这种用途要解决现有技术中诊断上皮性卵巢癌预后的试剂和方法效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种天冬酰胺内肽酶（aep）联合整合素α5和整合素β1在制备诊断上皮性卵巢癌或者诊断上皮性卵巢癌预后效果的试剂中的用途。

本发明通过大量实验研究得出，联合检测天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1与上皮性卵巢癌的预后密切相关。具体地，本发明通过免疫荧光共定位鉴定了aep能够与整合素α5和β1在人上皮性卵巢癌细胞skov3及人腹膜间皮细胞hpmc形成复合体。同时，elisa技术检测发现上皮性卵巢癌患者血清及腹水来源的外泌体中的天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1的表达量较良性卵巢肿瘤患者血清来源的外泌体及肝硬化患者腹水来源的外泌体中的表达量高。

本发明和已有技术相比，其技术进步是积极和有效的。本发明提供了一种用于上皮性卵巢癌诊断及预后监测的方法－肿瘤标志物天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1联合检测法。通过检测上皮性卵巢癌患者肿瘤组织中及外周血、腹水来源的外泌体中天冬酰胺内肽酶及整合素α5和β1的表达量来评估患者预后。

附图说明

图1为通过免疫荧光共定位法证实aep能够在上皮性卵巢癌细胞及腹膜间皮细胞与整合素α5和β1形成复合物。

图2外泌体的鉴定－cd63抗体鉴定

图3为良恶性卵巢肿瘤患者血清来源的外泌体中的aep及整合素α5和β1的表达差异。

图4为良恶性卵巢肿瘤患者腹水来源的外泌体中的aep及整合素α5和β1的表达差异。

图5上皮性卵巢癌患者肿瘤组织、腹膜肿瘤转移灶、良性卵巢肿瘤患者肿瘤组织、腹膜组织中aep及整合素α5和β1的表达差异。

图6aep及整合素α5和β1与上皮性卵巢癌预后分析。

具体实施方式：

以下参照具体实施例来说明本发明研究。该领域技术科研人员能够理解，该实施例仅用于说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

以下各实施例中使用的实验试剂及材料如下：

rpmi-1640培养液（hyclone）

dulbecco`smodifiedeaglemedium（highsugar,hyclone）

胎牛血清（fetalbovineserum，gibco-brl）

hank’s平衡液（gibco-brl）

anti-integrinα5,integrinβ1（#4749,integrinantibodysamplerkit,cst）

aep抗体anti-legumain（af2199,r&d）

山羊血清购自武汉博士德

alexafluor488-conjugatedanti-rabbitantibody（abcam）

cy3-conjugatedanti-goatantibody（abcam）

dapi购自santacruzbiotechnology公司

exosomesisolationkit（exoq5a-1,sbi,usa）

ripa缓冲液（ripa:pmsf=100:1,keygenbiotech）

实施例1:

免疫荧光共定位法鉴定aep能够在上皮性卵巢癌细胞及腹膜间皮细胞与整合素α5和β1形成复合物。

本实施例通过免疫荧光共定位方法对细胞中aep及整合素α5和β1是否能形成复合物进行鉴定。

具体实施方法为：

1.标本的获取及细胞培养：上皮性卵巢癌患者外周血、腹水及肿瘤组织标本均获得于2015年1月至2017年5月上海市第一妇婴保健院的65例患者。研究中登记的患者均获得知情同意书，并经过上海市第一妇婴保健院伦理委员会批准。

人上皮性卵巢癌细胞系skov3用rpmi1640培养基进行培养，加入10%fbs及1%抗生素。人腹膜间皮细胞hpmc用dmem培养基进行培养，加入20%fbs及1%抗生素。培养箱环境为5%co2,37℃。

2.免疫荧光染色法：通过加入抗aep及整合素α5和β1抗体对其使用免疫荧光法进行检测。使用alexafluor488-conjugated抗兔抗体对整合素α5和β1进行检测。使用cy3-conjugated抗山羊抗体对aep进行检测。照片通过zeisslsm510激光共聚焦显微镜获取。

图1照片上面两排依次为：在skov3及人腹膜间皮细胞hpmc中染色的细胞核、aep、整合素α5和共定位。

图1照片下面两排依次为：在skov3及人腹膜间皮细胞hpmc中染色的细胞核、aep、整合素β1和共定位。

实验结果表明：aep与整合素α5和β1能在skov3及人腹膜间皮细胞hpmc形成复合物。

结论：本发明通过免疫荧光共定位法证实aep能够在上皮性卵巢癌细胞与整合素α5和β1形成复合物（图1）。

实施例2:

本发明通过使用外泌体分离试剂盒（exoq5a-1,sbi,usa）分离收集上皮性卵巢癌患者血清及腹水中的外泌体、良性卵巢肿瘤患者血清中的外泌体、肝硬化患者腹水中外泌体，并对其进行cd63抗体鉴定（abcam,usa）（图2）。

本实施例通过使用integrinα5,integrinβ1抗体（#4749,integrinantibodysamplerkit,cst,usa）及aep抗体anti-legumain（af2199,r&d,usa）对上皮性卵巢癌患者血清及腹水、良性卵巢肿瘤患者血清及肝硬化患者腹水中的外泌体中的aep及整合素α5和β1进行elisa检测，观察其表达差异。

具体实施方法为：

1.外泌体的分离、提取及鉴定：获得上皮性卵巢癌患者血清及腹水、良性卵巢肿瘤患者血清及肝硬化患者腹水后，通过2500r超速离心30分钟提取外泌体。上清超速离心2次（1000g×10min,3000g×30min），并加入外泌体分离试剂盒中的试剂过夜。然后，使用pbs重悬外泌体。期间，使用cd63对所提取的外泌体进行鉴定。

2.在10%sds聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白裂解物，并转移到硝酸纤维素膜上。孵上aep及整合素α5和β1抗体。使用hrp-linked二抗进行检测。最后分析上皮性卵巢癌患者血清及腹水、良性卵巢肿瘤患者血清及肝硬化患者腹水来源的外泌体中aep及整合素α5和β1的表达量差异。

图2:通过western-blot检测外泌体cd63的表达量。cd63是外泌体特异性标志物。

图3:上皮性卵巢癌患者及良性卵巢肿瘤患者血清外泌体中的天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1的表达量检测。在上皮性卵巢癌患者血清外泌体中，aep的表达量：1.14±0.08，整合素α5表达量：2.46±0.40，整合素β1表达量：3.10±0.35，在良性卵巢肿瘤患者血清外泌体中，aep的表达量：0.14±0.01，整合素α5表达量：2.14±0.32，整合素β1表达量：2.21±0.05，较上皮性卵巢癌患者差异均有显著性（aep：p<0.001，整合素α5:p=0.025,整合素β1：p=0.025）

图4:上皮性卵巢癌患者及肝硬化患者腹水外泌体中的天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1的表达量检测。在上皮性卵巢癌患者腹水外泌体中，aep的表达量：1.93±0.19，整合素α5表达量：3.03±0.54，整合素β1表达量：2.35±0.07，在肝硬化患者腹水外泌体中，aep的表达量：0.98±0.05，整合素α5表达量：1.53±0.17，整合素β1表达量：1.46±0.12，较上皮性卵巢癌患者差异均有显著性（aep：p＝0.025，整合素α5:p=0.038,整合素β1：p=0.001）

结论：由图2-4可知，上皮性卵巢癌患者血清及腹水来源的外泌体中的天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1的表达量较良性卵巢肿瘤患者血清来源的外泌体及肝硬化患者腹水来源的外泌体中的表达量高。

实施例3:

免疫组织化学法检测上皮性卵巢癌患者肿瘤组织、腹膜肿瘤转移灶、良性卵巢肿瘤患者肿瘤组织、腹膜组织中天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1的表达。aep及整合素α5和β1的表达与eoc患者临床密切相关。

本实施例选取上皮性卵巢癌患者肿瘤组织、腹膜肿瘤转移灶、良性卵巢肿瘤患者肿瘤组织、腹膜组织切片，通过免疫组化染色aep及整合素α5和β1的表达。

并通过irs评分系统对其进行统计分析。（irs评分系统：aep染色程度评分：1,1～25%;2,26～50%;3,51～75%;4,76～100%（pp,阳性细胞百分比）。染色强度（si）得分为:0，阴性;1，弱;2,中度;3,强。irs评分是结合pp及si共同得出的分数。irs评分分为以下几组：0-3,阴性;4-6,弱阳性;7-9,阳性;10-12,强阳性。）

具体实施方法为：

1.免疫组化染色：准备好患者组织切片后，通过使用抗aep及整合素α5和β1抗体检测其表达（4℃过夜）。然后，使用hrp-linked抗山羊igg和抗兔igg在37℃孵育60分钟。pbs洗3次，每次5分钟，组织切片使用dab孵育30秒后用苏木精复染及脱水。每个切片随机选择5个高倍镜视野进行irs评分。统计aep及整合素α5和β1的表达与上皮性卵巢癌患者的相关性及预后分析。

2.通过选用上皮性卵巢癌患者肿瘤组织、腹膜肿瘤转移灶、良性卵巢肿瘤患者肿瘤组织、腹膜组织切片，利用免疫组织化学检测法，检测组织中天冬酰胺内肽酶（aep）及整合素α5和β1的表达，并通过irs评分系统对其进行统计分析。（图5）。另外，此三者表达量和eoc患者的临床分期密切相关，在进展期（figo分期ⅲ和ⅳ期）患者的组织切片染色可见其表达增高（figo分期ⅰ和ⅱ期：aep3.93±2.19，整合素α52.40±1.45，整合素β10.87±0.99；figo分期ⅲ和ⅳ期：aep8.75±2.88，整合素α55.25±2.10，整合素β13.30±1.75，mann-whitneyutest,p<0.05）。

3.aep及整合素α5和β1的检测在评估eoc预后中的运用：本发明通过使用spss.20.0进行eoc预后评估：根据eoc组织irs评分将aep分为两组（≤6分，>6分），同样将整合素α5、整合素β1分为两组（≤3分，>3分），并对其进行预后分析（图6）。

图5:a，aep、整合素α5和整合素β1分别在良性卵巢肿瘤患者组织、恶性卵巢肿瘤患者组织、良性卵巢肿瘤患者腹膜及恶性卵巢肿瘤患者腹膜中的染色；b，irs评分系统统计aep在上述组织中的表达量差异；c，irs评分系统统计整合素α5在上述组织中的表达量差异；d，irs评分系统统计整合素β1在上述组织中的表达量差异；可以看到，分数越高，恶性卵巢肿瘤患者组织及腹膜数量越多；分数越低，良性卵巢肿瘤患者组织及腹膜数量越多，表明aep、整合素α5和整合素β1在恶性卵巢肿瘤患者组织及腹膜中表达较良性卵巢患者组织及腹膜高。

图6:aep、整合素α5和整合素β1与恶性卵巢肿瘤患者预后分析（aep生存分析：p＝0.038；整合素α5生存分析：p＝0.029、整合素β1生存分析：p＝0.048），发现aep、整合素α5和整合素β1高表达的患者预后较低表达的患者差。

结论：对于上皮性卵巢癌组织进行免疫组织化学染色并使用irs评分系统发现其组织中aep及整合素α5和β1的表达较良性卵巢肿瘤增高。并且，此三者表达量与患者预后密切相关。

因此，aep及整合素α5和β1表达量的检测能够成为新的指标用于评估eoc的预后。