一种基于磷酸氢钙‑还原石墨烯/纳米金颗粒的尿酸酶生物传感器及其制备方法与流程

本发明涉及一种尿酸酶生物传感器及其制备方法，特别涉及一种基于磷酸氢钙-还原石墨烯/纳米金颗粒的尿酸酶生物传感器及其制备方法，属于酶生物传感器技术领域。

背景技术：

随着科学技术的不断发展，人们对生活的要求也越来越高，而健康作为这其中的重要一环也越来越得到人们的重视，因此，电化学生物传感器的应用也越来越频繁。在电化学传感器中酶生物传感器凭借其灵敏度高、选择性好、成本低、易小型化的优势而得到研究者的重视。酶生物传感器是利用酶作为分子识别元件，将各种化学物质、热、光、质量等信号转换成可以检测的电等信号，从而实现对目标物的定量分析。

人体各项生理物质都处于一个正常范围，尿酸也不例外，尿酸浓度失衡会导致急慢性肾炎、肾结核、慢性白血病等多种尿酸综合症。长期研究表明，如果将尿酸浓度严格控制在正常生理范围内，尿酸综合征就会得到控制。尿酸酶因为具有极其重要的催化活性而被广泛研究。因此开发用于检测体内尿酸含量的微小变化的高灵敏度的尿酸酶传感器具有重要的科学意义和使用价值。

然而，目前酶生物传感器面临的“瓶颈”就是如何最大程度保持酶的生物活性而不降低其电化学性能，尿酸酶生物传感器作为酶生物传感器的一种也面临着这个挑战。为了解决这一问题，本发明利用羟基磷灰石生物相容性好、比表面积大的特点最大程度的保持尿酸酶的活性；还原石墨烯具有导电性好、比表面积大的优点，其优良的导电性能会更好的促进生物活性分子的电子传递，应用于电化学传感器上能显著提高对检测物质的响应程度。纳米金颗粒的掺入可以在不损坏酶活性的条件下利用金硫键固定酶且明显的提高电化学响应信号；利用羟基磷灰石、还原石墨烯、纳米金颗粒修饰工作电极制备的尿酸酶生物传感器同时具有三种材料的优势，使得制备的尿酸酶传感器具有灵敏度高、反应速度快、检测范围宽的优点，将为生物传感器的发展带来大的进步。

在酶生物传感器技术领域，中国专利(cn200510018941.9)“一种尿酸酶生物传感器及其制备方法”以工作电极－尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系；其中，工作电极－尿酸酶电极的制备方法是：将禽蛋膜从蛋壳剥离、清洗后，平铺于洁净的玻璃片上，在膜上依次滴加10～25μl尿酸酶—牛血清白蛋白混合液、5～10μl改性纳米二氧化硅凝胶液、5～10μl2％戊二醛溶液，室温放置3～4h，在4℃静置8～14h，将膜经漂洗后紧贴在工作电极的表面，再将透气膜覆盖在膜上。本发明工艺简单、成本低廉；所制备尿酸酶生物传感器，具有快捷准确、重复性好、操作简单的特点；中国专利(cn201710106301.6)“一种无酶电化学生物传感器电极的制备方法及其应用”所述无酶电化学生物传感器电极基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料，采用电沉积方式一步原位制备聚(3,4乙烯二氧噻吩)/氧化镍/碳纳米管复合材料修饰电极；所制备的无酶电化学生物传感器电极的应用，用于构建基于电化学方法的无酶的各种生物传感器，具有单组分及多组分检测功能。本发明的优点是：该无酶电化学生物传感器电极制作工艺简单，操作方便；能够通过电化学方法对电极进行多次修饰并实现待测样品的无酶检测；传感器的再现性、重复性、稳定性好，检测限低，测试灵敏度和准确度高；成本低，有利于民用化。截至目前，还未见到利用还原石墨烯、磷酸氢钙纳米线及纳米金颗粒混合物修饰，再用戊二醛和nafion(全氟化高分子聚合物磺酸盐阳离子交换剂)将尿酸酶固定在修饰后的电极表面得到高灵敏度的尿酸酶传感器的相关工艺技术出现。

技术实现要素：

为了解决现有酶生物传感器存在的如何最大程度保持酶的生物活性而不降低其电化学性能的问题，本发明利用滴涂法将dcpa-rgo/aunps的混合液负载到工作电极表面，形成一种载体覆膜，在覆膜表面滴加尿酸酶溶液，在酶溶液中混合戊二醛、nafion(全氟化高分子聚合物磺酸盐阳离子交换剂)使尿酸酶更加稳固的与dcpa-rgo/aunps交联在一起，形成一种对尿酸有特定响应的薄膜；利用这种修饰电极表面的尿酸酶对尿酸进行催化氧化，通过循环伏安法准确的对尿酸进行定量分析，制备得到的尿酸酶生物传感器操作简单、成本低廉、重复性好、灵敏度高、快捷准确，可用于临床肾脏综合症的诊断，具有重要发明意义。本发明的目的是提供一种基于磷酸氢钙-还原石墨烯/纳米金颗粒的尿酸酶生物传感器及其制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是采用以下步骤：

1)将玻碳电极在麂皮上用0.5μm的氧化铝抛光粉粗磨后，用超纯水清洗干净，再用0.35μm的氧化铝抛光粉细磨，用超纯水清洗干净置于体积比为1：3的硝酸/乙醇混合液和二次水中各超声清洗3～5min，用超纯水洗净晾干，得到预处理的玻碳电极；

2)将步骤1)中得到的预处理的玻碳电极作为工作电极，在浓度为0.5mol/l的h2so4溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为-1.0v～1.0v，扫描速率为50mv/s，扫描段数为20段，直至循环伏安扫描曲线稳定，若循环伏安图中峰电位差在80mv以下，则完成电极活化，否则将电极在浓度为0.2mol/l的kno3中记录k3fe[(cn)6]溶液的循环伏安曲线，扫描速度50mv/s，扫描范围-0.1v～0.6v直至稳定，得到活化的玻碳电极；

3)在带有冷凝装置的250ml的圆底烧瓶中加入0.01％的氯金酸水溶液100ml加热至沸腾，剧烈搅动下精确加入1％柠檬酸三钠水溶液0.3～3ml，氯金酸水溶液在1到3min内由金黄色变为紫红色，继续煮沸10～20min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，制得在可见光区最高吸收峰为220～525nm的金溶胶，即得到aunps和go；

4)以na2hpo4和cacl2为原料，在10℃～25℃条件下预冷1～2h后混合并搅拌均匀，然后加入由步骤3)得到的aunps和go3～10ml调节ph至3～5并搅拌均匀，继续在预冷温度下冷却1～2h后在100～160℃下水热反应10～14h，抽滤洗涤后烘干，得到形貌均匀的dcpa-rgo/aunps混合液；

5)以步骤2)中得到的活化的玻碳电极为工作电极，将步骤4)中制得的dcpa-rgo/aunps混合液滴涂在活化的玻碳电极表面，晾干再滴涂再晾干直至复合材料在工作电极达到饱和，用超纯水冲洗干净晾干，得到具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极；

6)取5ml的样品管中依次加入10μl质量百分比浓度为2％的戊二醛水溶液、50μlph值为7.0的pbs溶液和5mg尿酸酶，用nafion溶液定容至500μl，混合、摇匀，得到尿酸酶混合液；

7)将步骤5)中得到的具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极的表面滴涂20μl步骤6)中得到的尿酸酶混合液，晾干，待玻碳工作电极表面形成尿酸酶膜，即得到uao/dcpa-rgo/aunps(尿酸酶/磷酸氢钙纳米线-还原石墨烯/纳米金颗粒)生物传感器。

所述还原石墨烯、磷酸氢钙纳米线及纳米金颗粒混合物分别以三种物质的分散液形式混合得到，三种分散液的混合体积比为1：14～35：1，三种分散液的浓度分别为4mg/ml、1mg/ml、5mg/ml。

所述pbs溶液为0.1mol/l的nah2po4-na2hpo4，na2hpo4和cacl2的浓度分别为60mm和100mm，且体积比为1:1，即ca:p＝5:3(摩尔比)。

所述nafion溶液为全氟化高分子聚合物磺酸盐阳离子交换剂。

与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：

本发明在制备dcpa-rgo/aunps复合材料时利用了水热法一步制得该复合材料，工艺简单、操作方便，制得的dcpa-rgo/aunps复合材料同时具有磷酸氢钙比表面积大、生物相容性好的优点，也具有还原石墨烯导电性能好、纳米金颗粒电化学性能优异、生物相容性好的优势，制备的尿酸酶传感器可实际应用于对尿酸的检测。

附图说明

图1是实施例1制备的dcpa-rgo/aunps复合材料的sem图。

图2是不同材料修饰的工作电极对尿酸溶液的响应图。

图3是实施例1制备的dcpa-rgo/aunps与uao/dcpa-rgo/aunps修饰的工作电极对相同尿酸溶液的响应对比图。

图4是实施例1制备的uao/dcpa-rgo/aunps修饰的工作电极对尿酸溶液的稳定性响应图。

图5是实施例1制备的uao/dcpa-rgo/aunps修饰的工作电极对不同浓度尿酸溶液的响应图。

图6是与图5对应的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1:

1)将玻碳电极在麂皮上用0.5μm的氧化铝抛光粉粗磨后，用超纯水清洗干净，再用0.35μm的氧化铝抛光粉细磨，用超纯水清洗干净置于体积比为1：3的硝酸/乙醇混合液和二次水中各超声清洗3min，用超纯水洗净晾干，得到预处理的玻碳电极；

2)将步骤1)中得到的预处理的玻碳电极作为工作电极，在浓度为0.5mol/l的h2so4溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为-1.0v～1.0v，扫描速率为50mv/s，扫描段数为20段，直至循环伏安扫描曲线稳定，得到活化的玻碳电极；

3)在带有冷凝装置的250ml的圆底烧瓶中加入0.01％的氯金酸水溶液100ml加热至沸腾，剧烈搅动下精确加入1％柠檬酸三钠水溶液2ml，氯金酸水溶液在2min内由金黄色变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，制得在可见光区最高吸收峰为518nm的金溶胶，即得到aunps和go；

4)以na2hpo4和cacl2为原料，在15℃条件下预冷1h后混合并搅拌均匀，然后加入由步骤3)得到的aunps和go5ml调节ph至4.5并搅拌均匀，继续在15℃预冷温度下冷却1h后在140℃下水热反应12h，抽滤洗涤后烘干，得到形貌均匀的dcpa-rgo/aunps混合液；

5)以步骤2)中得到的活化的玻碳电极为工作电极，将步骤4)中制得的dcpa-rgo/aunps混合液滴涂在活化的玻碳电极表面，晾干再滴涂再晾干直至复合材料在工作电极达到饱和，用超纯水冲洗干净晾干，得到具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极；

6)取5ml的样品管中依次加入10μl质量百分比浓度为2％的戊二醛水溶液、50μlph值为7.0的0.1mol/l的ca:p＝5:3(摩尔比)的nah2po4-na2hpo4溶液和5mg尿酸酶，用全氟化高分子聚合物磺酸盐阳离子交换剂溶液定容至500μl，混合、摇匀，得到尿酸酶混合液；

7)将步骤5)中得到的具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极的表面滴涂20μl步骤6)中得到的尿酸酶混合液，晾干，待玻碳工作电极表面形成尿酸酶膜，即得到uao/dcpa-rgo/aunps(尿酸酶/磷酸氢钙纳米线-还原石墨烯/纳米金颗粒)生物传感器(a)。

实施例2:

1)将玻碳电极在麂皮上用0.5μm的氧化铝抛光粉粗磨后，用超纯水清洗干净，再用0.35μm的氧化铝抛光粉细磨，用超纯水清洗干净置于体积比为1：3的硝酸/乙醇混合液和二次水中各超声清洗4min，用超纯水洗净晾干，得到预处理的玻碳电极；

2)将步骤1)中得到的预处理的玻碳电极作为工作电极，在浓度为0.5mol/l的h2so4溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为-1.0v～1.0v，扫描速率为50mv/s，扫描段数为20段，直至循环伏安扫描曲线稳定，得到活化的玻碳电极；

3)在带有冷凝装置的250ml的圆底烧瓶中加入0.01％的氯金酸水溶液100ml加热至沸腾，剧烈搅动下精确加入1％柠檬酸三钠水溶液3ml，氯金酸水溶液在1min内由金黄色变为紫红色，继续煮沸10min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，制得在可见光区最高吸收峰为220nm的金溶胶，即得到aunps和go；

4)以na2hpo4和cacl2为原料，在10℃条件下预冷2h后混合并搅拌均匀，然后加入由步骤3)得到的aunps和go3ml调节ph至5并搅拌均匀，继续在10℃预冷温度下冷却2h后在100℃下水热反应14h，抽滤洗涤后烘干，得到形貌均匀的dcpa-rgo/aunps混合液；

5)以步骤2)中得到的活化的玻碳电极为工作电极，将步骤4)中制得的dcpa-rgo/aunps混合液滴涂在活化的玻碳电极表面，晾干再滴涂再晾干直至复合材料在工作电极达到饱和，用超纯水冲洗干净晾干，得到具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极；

6)取5ml的样品管中依次加入10μl质量百分比浓度为2％的戊二醛水溶液、50μlph值为7.0的0.1mol/l的ca:p＝5:3(摩尔比)的nah2po4-na2hpo4溶液和5mg尿酸酶，用全氟化高分子聚合物磺酸盐阳离子交换剂溶液定容至500μl，混合、摇匀，得到尿酸酶混合液；

7)将步骤5)中得到的具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极的表面滴涂20μl步骤6)中得到的尿酸酶混合液，晾干，待玻碳工作电极表面形成尿酸酶膜，即得到uao/dcpa-rgo/aunps(尿酸酶/磷酸氢钙纳米线-还原石墨烯/纳米金颗粒)生物传感器(b)。

实施例3:

1)将玻碳电极在麂皮上用0.5μm的氧化铝抛光粉粗磨后，用超纯水清洗干净，再用0.35μm的氧化铝抛光粉细磨，用超纯水清洗干净置于体积比为1：3的硝酸/乙醇混合液和二次水中各超声清洗5min，用超纯水洗净晾干，得到预处理的玻碳电极；

2)将步骤1)中得到的预处理的玻碳电极作为工作电极，在浓度为0.5mol/l的h2so4溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为-1.0v～1.0v，扫描速率为50mv/s，扫描段数为20段，直至循环伏安扫描曲线稳定，得到活化的玻碳电极；

3)在带有冷凝装置的250ml的圆底烧瓶中加入0.01％的氯金酸水溶液100ml加热至沸腾，剧烈搅动下精确加入1％柠檬酸三钠水溶液0.3ml，氯金酸水溶液在3min内由金黄色变为紫红色，继续煮沸20min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，制得在可见光区最高吸收峰为525nm的金溶胶，即得到aunps和go；

4)以na2hpo4和cacl2为原料，在25℃条件下预冷1.5h后混合并搅拌均匀，然后加入由步骤3)得到的aunps和go10ml调节ph至3并搅拌均匀，继续在预冷温度下冷却1.5h后在160℃下水热反应10h，抽滤洗涤后烘干，得到形貌均匀的dcpa-rgo/aunps混合液；

5)以步骤2)中得到的活化的玻碳电极为工作电极，将步骤4)中制得的dcpa-rgo/aunps混合液滴涂在活化的玻碳电极表面，晾干再滴涂再晾干直至复合材料在工作电极达到饱和，用超纯水冲洗干净晾干，得到具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极；

6)取5ml的样品管中依次加入10μl质量百分比浓度为2％的戊二醛水溶液、50μlph值为7.0的0.1mol/l的ca:p＝5:3(摩尔比)的nah2po4-na2hpo4溶液和5mg尿酸酶，用全氟化高分子聚合物磺酸盐阳离子交换剂溶液定容至500μl，混合、摇匀，得到尿酸酶混合液；

7)将步骤5)中得到的具有dcpa-rgo/aunps膜的基体电极的表面滴涂20μl步骤6)中得到的尿酸酶混合液，晾干，待玻碳工作电极表面形成尿酸酶膜，即得到uao/dcpa-rgo/aunps(尿酸酶/磷酸氢钙纳米线-还原石墨烯/纳米金颗粒)生物传感器(c)。

通过循环伏安法对实施例1的尿酸酶生物传感器制备过程中不同阶段进行表征,结果如附图所示。如图1为dcpa-rgo复合材料的扫描电镜图，通过对温度、时间、ph的调控制备出长径比大的dcpa纳米线，从而提高了复合材料的比表面积。由图2可知dcpa-rgo/aunps修饰的工作电极相对于其他三种相对单一的材料更加灵敏。由图3可知uao对工作电极的修饰可以大大提高对尿酸溶液的响应。图4为uao/dcpa-rgo/aunps修饰的工作电极在工作10圈之后的响应图，由图可知从第二圈开始基本达到稳定。图5为uao/dcpa-rgo/aunps修饰的工作电极对不同浓度的尿酸溶液的响应图，由图可知随着尿酸浓度的增加峰电流增大。

利用实施例1中uao/dcpa-rgo/aunps修饰的尿酸酶生物传感器对不同浓度的尿酸溶液进行测定。如图6中还原峰电流值与浓度成良好线性关系,线性回归方程和线性相关系数分别为y＝13.85847x+20272；r²＝0.9943。

测定了实施例1、2、3制备得到的三种尿酸酶传感器的灵敏度(见表1)。由表1中数据可知，采用本发明所述的制备方法获得的尿酸酶传感器的灵敏度都较高，可达13.86μa/mm。

表1

以上列举的仅是本发明的具体实施例。本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。