基于hemin‑石墨烯复合材料分析检测PARP活性的方法与流程

本发明属于一种定量检测parp(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)活性的技术，涉及石墨烯复合材料在临床检测的应用，具体涉及石墨烯复合材料定量检测生物酶的应用领域。

背景技术：

parp，也称聚adp-核糖聚合酶，是一类存在于绝大多数真核生物中能催化多聚adp核糖基化的细胞核酶，结构主要包括三个区域：dna结合域、自身修饰域、催化域。parp能够结合各种dna结构和核小体，并且具有nad⁺依赖的催化活性，可在目标蛋白上合成聚(adp-核糖)聚合物。聚(adp-核糖)聚合物的形成显著改变了受体蛋白的电荷特性，引发了dna损伤的控制和修补过程。parp在基因稳定和肿瘤的发生发展、炎症和应激反应、代谢和能量消耗、昼夜节律等方面都起重要的调节作用。而且parp在恶性肿瘤与正常组织中的表达存在有差异性，且这种差异性有可能在疾病的发生发展中起重要作用。近几年，parp在dna损伤修复和维持基因组的稳定性的作用引起世人的关注。在此基础上，运用抑制剂抑制parp参与介导的肿瘤细胞dna损伤修复，更是当前研究热点之一。

parp活性检测的传统技术主要有酶联免疫法，使用抗-par的单克隆抗体、hrp标记的羊抗鼠1gg二抗，建立检测沉积在免疫组蛋白上的par的比色方法或化学发光方法；或者采用放射性nad⁺的方法来测定了parp的酶活性。但此类方法有的需要标记，具有成本高、需要样品量较大、灵敏性差、检测时间长的缺点，而且有时候会得到假阳性结果。目前，hergenrother等采用化学定量nad⁺的方法间接测定了parp-1的酶活性，可用于小分子抑制剂的高通量筛查；并合成了adp-ribose-pnp显色底物，发展了简单、灵敏的比色方法来评价parp的活性。然而，这种方法需要繁琐的合成。因此，该方法存在很多局限性。

近年来，为解决parp分析方法的弊端，研究者们已经开发了许多简单、可执行的分析方法并将之应用到parp活性的检测中，例如比色检测、荧光检测、电化学检测等。例如，湖南大学聂舟教授利用par对荧光蛋白scgfp与阳离子聚合物ccp间荧光共振能量转移效率的调节作用，建立了parp活性的荧光检测方法；南京师范大学戴志晖教授利用六氨合钌做指示剂，根据par静电吸附六氨合钌的量建立了parp的电化学检测新方法；南京大学李根喜教授利用parp引起修饰有辅酶nad金胶的聚集，建立了parp活性的比色检测法。受以上方法的启发，我们建立了一种基于hemin-石墨烯复合材料比色检测parp活性的方法。此方法无需标记，易操作，而且与上述的比色方法相比，具有稳定性高、检测线低、检测范围广的优点。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术的问题，提供了一种基于hemin-石墨烯复合材料分析检测parp活性的方法。本发明中利用parp催化合成的聚adp核糖链带有大量的负电，会使在一定盐浓度下的h-gns发生分散程度的变化。在tmb和h2o2存在下，通过得到的显色程度不同的变化来测定parp活性。它具有灵敏度高、准确性好、无标记等优点。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于hemin-石墨烯复合材料分析检测parp活性的方法，包括以下步骤：

(1)选取激活dna激活parp(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)；

(2)合成h-gns(hemin-石墨烯)复合材料；

(3)将激活dna、parp、nad+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)混合反应，合成了带大量负电荷的par(聚adp-核糖)聚合物；

(4)将所述h-gns复合材料与所述par聚合物混合反应，加入盐溶液，记录h-gns与par聚合物产物的团聚变化；

(5)利用紫外-可见光谱仪对步骤(4)获得的产物溶液进行定量检测。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：步骤(1)中所述激活dna的序列选自上海生物工程有限公司：

单链dna1：5’-cccgtgcgtgcgcgagtgagttggtgtgtgtgtgtgtgtgt-3’

单链dna2：5’-caactcactcgcgcacgcacggg-3’

形成激活双链dna的方法为：激活dna单链在95℃水浴反应3-10分钟后，冷却至室温，形成杂交的双链dna，所述双链dna与所述parp进行反应，以激活parp的活性。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(2)具体如下：称取10mg氧化石墨溶于10-40ml二次水中所述氧化石墨的浓度为0.2-1mg/ml，超声分散2～4h进行机械剥离，2000～4000rpm转速下离心20～30min，除去未剥离的氧化石墨，取上清液在透析袋(mw：8000～12000)中透析一周除去杂质小分子得分散均匀的氧化石墨烯；将上述氧化石墨烯溶液与10-40ml溶于0.1mnaoh溶液的hemin在烧瓶中充分混合，所述hemin的浓度为0.2-1mg/ml；之后缓慢加入150～200μl氨溶液，最后加入20～50μl水合肼，剧烈搅拌混合溶液30～60min，将烧瓶置于60℃水浴中反应3～24h，得到稳定分散的黑色溶液；将上述黑色溶液在12000～13000rpm转速下离心30～60min得黑色沉淀物，水洗3～5次得到容易重新分散在水中的h-gns复合材料。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(3)具体如下：用反应缓冲溶液将所述parp配置成不同的浓度，在含有所述激活dna、所述nad⁺的反应缓冲溶液中滴加不同浓度的parp，于30～38℃条件下反应1～2h。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述激活dna浓度为100～200nm。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述nad⁺浓度为100～500μm。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述反应缓冲溶液为含有kcl、mgcl2、zn(oac)2的ph7.2～7.4的50mmtris-hcl，所述kc1初始浓度为50mm，mgcl2初始浓度为2mm，zn(oac)2初始浓度为50μm。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述步骤(4)具体如下：将所述h-gns复合材料加入到所述parp催化反应合成的所述par聚合物混合反应溶液中，反应20～40min，之后加入nacl溶液，在20～30℃条件下反应30～50min，离心取上层清液加入到磷酸缓冲溶液中，在tmb和h2o2存在下，对其溶液进行记录和紫外-可见光谱检测。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述磷酸缓冲溶液为ph5～6的25～50mm的磷酸缓冲溶液。

作为本发明改进的技术方案，还可以采用如下技术措施：所述nacl的浓度为0.01～1.0m，所述tmb和h2o2的最终浓度分别为0.1～1.0mm和5～30mm。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明无需标记，简化了检测方法，避免了标记dna探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。

(2)本发明利用hemin-石墨烯复合材料具有内在的类过氧化氢酶活性、在盐溶液中具有可调控的分散性，而且通过ii-ii作用可吸附单链dna，是一种具有很大潜力的检测材料。

(3)本发明有效利用了纳米材料的特性，不需要借助精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了病毒检测成本，本发明具有成本低、快速、简便、敏感且特异性好的优点。

(4)本方法可成功检测加入血清中的parp的活性，具有一定的临床意义。

附图说明

图1基于h-gns比色检测parp活性的流程图。

图2显示了h-gns紫外吸收光谱表征图：a.hemin紫外吸收曲线，b.氧化石墨紫外吸收曲线，c.h-gns紫外吸收曲线。

图3h-gns的溶解度与nacl溶液浓度(mol)的关系图。

图4显示了端粒酶活性检测实验验证图：a.h-gns与parp、nad⁺混合溶液的紫外吸收强度；b.h-gns与parp、dsdna混合溶液的紫外吸收强度；c.h-gns与dsdna、nad⁺的紫外吸收强度；d.parp催化合成的产物与h-gns混合时的紫外吸收强度。

图5显示了检测parp活性的紫外吸收值变化图：a.在不同的parp浓度下，得到的紫外-可见光曲线图(parp浓度(u，1u＝45ng)：(a)0(b)0.05(c)0.1(d)0.3(e)0.5(f)0.75(g)1(h)2(i)3；b.紫外吸收强度与parp浓度的标准曲线，以及紫外吸收强度与parp浓度之间的线性关系；从图中可以看出parp在0.05u到1u呈良好的线性关系。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

本实验中用到的试剂和仪器：

parp(聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)，nad⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，hemin(氯化血红素)，tmb(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)，h2o2，水合肼，氨水，nacl，紫外-可见光光谱仪。

激活dna序列(选自上海生物工程有限公司)：

单链dna1：5’-cccgtgcgtgcgcgagtgagttggtgtgtgtgtgtgtgtgt-3’

单链dna2：5’-caactcactcgcgcacgcacggg-3’

实施例1：

基于h-gns复合材料分析检测parp活性的分析方法，检测步骤是：

h-gns复合材料合成步骤：称取10mg氧化石墨溶于20ml二次水中(0.5mg/ml)，超声分散2h进行机械剥离，3000rpm离心30min，除去未剥离的氧化石墨，取上清液在透析袋(mw：8000-12000)中透析一周除去杂质小分子得分散均匀的氧化石墨烯。将所得氧化石墨烯溶液与20ml溶于0.1mnaoh溶液的hemin(0.5mg/ml)在烧瓶中充分混合。完成之后，缓慢加入200μl氨溶液，最后加入30μl水合肼。剧烈搅拌混合溶液60分钟，把烧瓶置于水浴中(60℃)反应20h，得到稳定分散的黑色溶液。将所得黑色溶液在13000rpm离心30分钟得黑色沉淀物，水洗三次得到h-gns。得到的h-gns能很容易地重新分散在水中。

dna杂交步骤：在dna杂交缓冲溶液(10mmtris-hcl，ph7.4，0.1mnacl)中加入两条激活dna单链，95℃水浴5分钟慢慢冷却至室温，形成杂交的激活dna。

parp催化合成par的步骤：用反应缓冲溶液将parp配置成不同的浓度，在含有激活dna、nad⁺的反应缓冲溶液(50mmtris-hcl，ph7.4，50mmkcl，2mmmgcl2，50μmzn(oac)2)中滴加0.1uparp，37℃反应1h。

parp活性检测步骤：取150μl50μg/mlh-gns复合材料加入到已生成par的溶液中，加入0.4mnacl溶液，在28℃反应30min。反应结束后，离心，取上层清液加入到磷酸缓冲溶液(25mmph5.0)中，在0.8mmtmb和25mmh2o2存在下，对其溶液进行记录和紫外-可见光谱检测。实验结果如图4d显示，parp在0.05～1u呈良好的线性关系，检测限为0.034u。

参考例

氧化石墨紫外吸收曲线，hemin紫外吸收曲线和h-gns紫外吸收曲线分别如图2a-c所示。

对比例

为了证明激活dna对parp活性测试的必须性，进行空白实验测试，与实施例1不同的是，在其他条件不变的情况下，在缺少激活dna时进行parp的紫外吸收(也就是进行h-gns与parp、nad⁺混合溶液的紫外吸收)，测试结果如图4a所示。

为证明nad⁺对parp活性测试的必须性，进行空白实验测试，与实施例1不同的是，在其他条件不变的情况下，在缺少nad⁺时进行parp的紫外吸收(也就是进行h-gns与parp、激活dna混合溶液的紫外吸收)，测试结果如图4b所示。

缺少反应检测物parp得空白实验测试紫外吸收测试结果如图4c所示。

实施例2

与实施例1不同的是：选用不同浓度的parp(u，1u＝45ng)：(a)0(b)0.05(c)0.1(d)0.3(e)0.5(f)0.75(g)1(h)2(i)3，得到的紫外-可见光曲线如图5所示，可见，在0-3u范围内parp在0.05u到1u呈良好的线性关系。

综上可见，h-gns复合材料可以定量检测parp，缘于h-gns复合材料具有内在的类过氧化氢酶活性、在盐溶液中具有可调控的分散性，有效利用了纳米材料的特性，不需要借助精密仪器检测，简化了检测方法，极大地降低了病毒检测成本，本发明可成功检测加入血清中的parp的活性，具有良好的临床意义。

尽管上面对本发明的实施例进行了描述，但本发明不局限于上述具体的实施方式，上述具体的实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所请求保护的范围情况下，还可以作出多种衍生形式，这些构思均属于本发明的保护范围之内。