本发明涉及药物检测与检验技术领域，特别是涉及一种克拉霉素系列中间体有关物质的检测方法。
背景技术：
克拉霉素，又名6-O-甲基红霉素A，是第二代大环内酯内抗生素，克服了红霉素易在胃酸中易降解的缺点，是临床上呼吸道感染和泌尿系统感染的首选药物之一。克拉霉素的生产以红霉素为原料，经肟化→醚化→硅烷化→甲基化四个生产过程制得，该生产工艺流程长，化学反应多，故而生产过程中中间体质量控制对克拉霉素成品质量非常重要。
华东理工大学张勇在硕士学位论文《罗红霉素和克拉霉素的合成研究》中提到了克拉霉素中间体的HPLC检测方法，仅用于含量检测，用于计算收率。
在《中国科协2001年学术年会》中孙京国《新型红霉素衍生物中间体的HPLC分析》一文中，采用HPLC对红霉素Z、E肟进行了定量分析。色谱条件，色谱柱：SHIMADZU CLC-C 8柱， 150mm*6mm，流动相：磷酸二氢钾-乙腈（70：30）；流速1ml/min；检测波长205nm。该方法并未对醚化、硅烷化、甲基化过程中产生的杂质进行检测。
在《色谱》Vol.22 No.3 237～240《反相高效液相色谱分析克拉霉素合成工艺中区域选择性甲基化的关键中间体》一文中，梁建华等用HPLC对醚化-硅烷化中间体和甲基化中间体进行了分析，色谱条件为：ODS-3（150*4.6mm，5um），流动相乙腈-水（95：5），流速1.5ml/min，检测波长205nm，柱温40℃。色谱图采集需60min。该方法存在检测时间较长等缺陷。
上述文献的缺点是未能采用一个方法，同时将克拉霉素生产过程中各中间体有关物质进行检测。
技术实现要素：
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可快速、准确，利用一种方法就可以检测克拉霉素生产过程中各中间体有关物质的方法。
为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
一种克拉霉素系列中间体有关物质的方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
高压泵：双元泵进行梯度洗脱；
流速：1.5mL/min；
柱温：40～50℃；
检测器：紫外检测器；
检测波长：205nm；
流动相为乙酸胺缓冲液和甲醇混合液。
所述乙酸胺缓冲液的浓度为0.04mol/L，pH为6.0±0.05。
在检测过程中根据不同的反应中间体使用不同的流动相中乙酸胺缓冲液和甲醇的混合比例。
本发明克服了生产过程中凭经验生产、凭经验判断反应终点以及采用多种方法进行过程检测的缺点，采用HPLC法，利用双元泵调整流动相比例，可以同时检测克拉霉素所有反应中间体有关物质，具有：1、检测方法简便，样品处理简单，只需将样品用甲醇稀释后，就可以直接进行进样检测；2、检测速度快，通常30min即可分析完毕，达到指导车间生产和改进工艺提供依据；3、在一个系统条件下，有不同中间体需要检测时，只需改变双元泵的梯度，就可以进行检测，可以节省人力和检测资源。
附图说明
图1为醚化物测定图谱；
图2为硅烷化物测定图谱；
图3为甲基化物测定图谱。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
1仪器和试剂
仪器选择：岛津液相色谱仪；试剂：乙酸铵；甲醇为色谱纯；水为高纯水。
2色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
高压泵：双元泵进行梯度洗脱。
流速：1.5mL/min。
柱温为40～50℃℃。
检测器：紫外检测器。
检测波长：205nm。
流动相：0.04mol/L乙酸铵缓冲液（用乙酸调节pH为6.0±0.05）和甲醇混合液，可以根据不同的反应中间体使用不同的混合比例。
3试验讨论
3.1色谱条件选择
克拉霉素各反应过程中的中间体在紫外波长扫描均在205nm处有最大吸收，故选择205nm作为检测波长。
3.2流动相选择
有文献报道HPLC检测克拉霉素反应中间体流动相选择采用水和乙腈的色谱系统和磷酸盐缓冲液和乙腈色谱系统。但通过试验后，发现硅烷化/甲基化反应的中间体主成分和各杂质不能分离，无法检测各杂质。在磷酸盐缓冲液也乙腈系统中，乙腈比例较大，磷酸盐容易结晶，导致仪器管路堵塞。所以流动相选择乙酸铵缓冲液和甲醇混合液。硅烷化产物在酸性条件下不稳定，乙酸胺缓冲液调pH值为6.0。
3.3柱温选择
提高柱温可以缩短分析时间，也可以改变峰形，最终确定柱温为40～50℃。
3.4流速
选用1.5mL/min流速时，各反应中间体可以在30min内结束。
4 HPLC用于醚化研究
4.1试验方法：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色为填充剂；流动相：0.04mol/L乙酸铵缓冲液（用乙酸调节pH至6.0）-甲醇（30:70）；流速：1.5mL/min；检测波长：205nm；柱温：45℃。
样品处理：直接吸取反应物0.1mL用甲醇稀释至10mL，进样检测。
4.2醚化物测定图谱见图1。
4.3检测结论：通过对醚化物的检测，醚化物的主成分纯度为89%，检测可以在40分钟内完成，主产物和其它杂质分离，可以快速检测，达到车间反应监控的目的。
5硅烷化/甲基化测定
5.1色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色为填充剂；流动相：0.04mol/L乙酸铵缓冲液（用乙酸调节pH至6.0）-甲醇（50:950）；流速：1.5mL/min；检测波长：205nm；柱温：45℃。
样品处理：直接吸取反应物0.1mL用甲醇稀释至10mL，进样检测。
5.2硅烷化物图谱见图2。
5.3检测结论：通过对硅烷化物的检测，硅烷化物的主成分纯度为81%，检测可以在30分钟内完成，主产物和其它杂质分离，可以快速检测，达到车间反应监控的目的。
5.4甲基化物图谱见图3。
5.5检测结论：通过对甲基化物的检测，甲级化物的主成分纯度为73%，检测可以在30分钟内完成，主产物和其它杂质分离，可以快速检测，达到生产过程监控的目的。