本发明涉及液相色谱检测技术领域，具体为一种鸡肉中肌苷酸含量液相色谱检测方法。
背景技术：
肌苷酸(Inosinic acid，IMP)，即次黄嘌呤核苷酸，是动物组织中重要的风味物质，其与畜禽肉类食品鲜味的产生密切相关。目前，肌肉组织中肌苷酸含量被作为肉质评定的重要指标，已广泛应用于各种动物肉类产品的品质评定，其含量的高低可间接反映出肉类食品风味的优劣。为此，肌肉组织中肌苷酸含量测定方法的研究已显得尤为重要。目前测定肌肉组织中肌苷酸含量的方法有薄层层析法、紫外分光光度法和高效液相色谱法等。其中，以磷酸－三乙胺缓冲溶液为流动相的反相液相色谱法已成为当前肌肉组织中肌苷酸含量测定的常用方法。然而，该测定方法的相对标准偏差和回收率在已报道的试验研究中差异较大，反映出该方法可能存在一定的缺陷。因此，本文在总结前人研究的基础上，通过对流动相的改进，旨在探讨肌肉组织中肌苷酸含量测定的精确度和准确性更高的反相液相色谱法，针对上述问题，特提出一种鸡肉中肌苷酸含量液相色谱检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种鸡肉中肌苷酸含量液相色谱检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种鸡肉中肌苷酸含量液相色谱检测方法，包括以下步骤：第一步，选定原材料；
第二步，选定试剂及主要仪器；
第三步，配制主要溶液；
第四步，原材料处理；
第五步，色谱条件设置；
第六步，检测结果的分析的计算。
所述第一步，选定原材料的具体步骤如下，选取一定量的新鲜肉鸡胸肌样品，并置于-20℃、常压的状态下保存待用。
所述第二步，选定试剂及主要仪器的具体步骤如下，试剂包括：肌苷酸标准品，含量65.32％；甲醇，色谱纯；甲酸铵，分析纯；高氯酸，优级纯，含量 70％～72％，主要仪器包括：液相色谱仪；紫外检测器；高速离心机；高速组织匀浆机；绞肉机。
所述第三步，配制主要溶液的具体步骤如下，所述主要溶液包括甲酸铵缓冲溶液、肌苷酸标准储备液和肌苷酸标准工作液；
甲酸铵缓冲溶液的配制：称3.15g甲酸铵置于烧杯内，并向烧杯内加500ml 去离子水，再向烧杯内倒入0.5mol/L的氢氧化钠溶液，将烧杯内的混合液调至 pH为6.5，定容至1000ml，选用0.45μm滤膜进行过滤，再置入超声水浴内脱气20min；
肌苷酸标准储备液的配制：准确称取15.31mg肌苷酸标准品，用浓度为5％的甲醇水溶液定容至10ml，并且充分摇匀；
肌苷酸标准工作液的配制：取配制好的肌苷酸标准储备液1ml，用浓度为 5％的甲醇水溶液定容至10ml，并且充分摇匀。
所述第四步，原材料处理的具体步骤如下，将肉鸡胸肌样品用绞肉机绞碎后称取5g，准确至0.0001g，置于50ml塑料离心管中，分次加入共20m浓度为 l6％的高氯酸，用高速组织匀浆机匀浆，匀浆液以8000r/min的速度离心13min，离心过滤后将上清液置于100ml三角瓶中，将离心后得到的沉淀物用15m浓度为l6％的高氯酸再次进行匀浆、离心，过滤出第二次离心的上清液并倒入三角瓶中，用5.0mol/L和0.5mol/L的NaOH溶液将三角瓶中液体的pH值调至6.5，再将三角瓶内的溶液转移至100ml容量瓶中，定容并且充分摇匀，用0.45μm滤膜过滤后制得样品提取液备用。
所述第五步，色谱条件设置的具体步骤如下，色谱柱： WatersAtlantisTMdC18柱(5μm，Φ4.6mm×150mm)；流动相：50mmol/LpH6.5 甲酸铵缓冲溶液(含5％甲醇)；流速：1ml/min；柱温：25℃；进样量：5μl；紫外检测波长：254nm；运行时间：肌苷酸标准工作液运行4min，样品提取液运行11min。
所述第六步，检测结果的分析的计算的具体步骤如下，将样品提取液和肌苷酸标准工作液在设置的色谱条件下进行分析，根据两种溶液峰面积响应值计算出原材料中肌苷酸的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：一种鸡肉中肌苷酸含量液相色谱检测方法，流动相中采用的甲酸铵为水溶性弱酸盐，其化学特性可能更有利于延长色谱柱的使用寿命，从而使本方法更适用于大量样品的测定，采用甲酸铵缓冲液作为流动相进行反相液相色谱分析，优化了色谱条件，提高了肌肉组织样品中肌苷酸含量测定的精密度和准确性，达到了准确、快速测定肌苷酸含量的目的，可应用于生鲜肉类食品中肌苷酸含量的检测分析。
附图说明
图1为本发明中肌苷酸标准工作液的色谱图；
图2为本发明中肌苷酸样品提取液的色谱图；
图3为本发明中肌苷酸精密度试验的结果图；
图4为本发明中肌苷酸回收率试验的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种鸡肉中肌苷酸含量液相色谱检测方法，包括以下步骤：第一步，选定原材料；
第二步，选定试剂及主要仪器；
第三步，配制主要溶液；
第四步，原材料处理；
第五步，色谱条件设置；
第六步，检测结果的分析的计算。
所述第一步，选定原材料的具体步骤如下，选取一定量的新鲜肉鸡胸肌样品，并置于-20℃、常压的状态下保存待用。
所述第二步，选定试剂及主要仪器的具体步骤如下，试剂包括：肌苷酸标准品，Sigma公司生产，含量65.32％；甲醇，色谱纯，Fisher公司生产；甲酸铵，分析纯，北京市西中化工厂；高氯酸，优级纯，含量70％～72％北京南尚乐化工厂，主要仪器包括：Waters 2695 AllianceTM高效液相色谱仪；Waters2487 紫外检测器；高速离心机；高速组织匀浆机；绞肉机。
所述第三步，配制主要溶液的具体步骤如下，所述主要溶液包括甲酸铵缓冲溶液、肌苷酸标准储备液和肌苷酸标准工作液；
甲酸铵缓冲溶液的配制：称3.15g甲酸铵置于烧杯内，并向烧杯内加500ml 去离子水，再向烧杯内倒入0.5mol/L的氢氧化钠溶液，将烧杯内的混合液调至 pH为6.5，定容至1000ml，选用0.45μm滤膜进行过滤，再置入超声水浴内脱气20min；
肌苷酸标准储备液的配制：准确称取15.31mg肌苷酸标准品(Sigma公司，含量65.32％)，用浓度为5％的甲醇水溶液定容至10ml，并且充分摇匀；
肌苷酸标准工作液的配制：取配制好的肌苷酸标准储备液1ml，用浓度为 5％的甲醇水溶液定容至10ml，并且充分摇匀。
所述第四步，原材料处理的具体步骤如下，将肉鸡胸肌样品用绞肉机绞碎后称取5g，准确至0.0001g，置于50ml塑料离心管中，分次加入共20m浓度为 l6％的高氯酸，用高速组织匀浆机匀浆，匀浆液以8000r/min的速度离心13min，离心过滤后将上清液置于100ml三角瓶中，将离心后得到的沉淀物用15m浓度为l6％的高氯酸再次进行匀浆、离心，过滤出第二次离心的上清液并倒入三角瓶中，用5.0mol/L和0.5mol/L的NaOH溶液将三角瓶中液体的pH值调至6.5，再将三角瓶内的溶液转移至100ml容量瓶中，定容并且充分摇匀，用0.45μm滤膜过滤后制得样品提取液备用。
所述第五步，色谱条件设置的具体步骤如下，色谱柱： WatersAtlantisTMdC18柱(5μm，Φ4.6mm×150mm)；流动相：50mmol/LpH6.5 甲酸铵缓冲溶液(含5％甲醇)；流速：1ml/min；柱温：25℃；进样量：5μl；紫外检测波长：254nm；运行时间：标准工作液运行4min，样品提取液运行11min。
所述第六步，检测结果的分析的计算的具体步骤如下，将样品提取液和肌苷酸标准工作液在设置的色谱条件下进行分析，根据两种溶液峰面积响应值计算出原材料中肌苷酸的含量(mg/g)；
具体公式为Ci＝(Cs*Ai*V)/(m*As)
式中：Ci：原材料中肌苷酸的含量(mg/g)；
Cs：肌苷酸标准工作液中肌苷酸的浓度(mg/ml)；
Ai：原材料中肌苷酸所对应的峰面积响应值；
As：肌苷酸标准工作液中肌苷酸所对应的峰面积响应值；
V：样品提取液总体积(ml)；
m：原材料称取的质量(g)。
标准曲线及线性范围分析：将1mg/ml的肌苷酸标准储备液分别配制成0.02、 0.04、0.08、0.10、0.12、0.16mg/ml的肌苷酸标准工作液，按设定的色谱条件进行色谱分析，以肌苷酸浓度为自变量(X)，相应的色谱峰面积响应值为依变量(Y)，建立标准曲线方程，结果表明：在0.02～0.16mg/ml浓度范围内，肌苷酸浓度与峰面积响应值之间具有良好的线性关系，回归方程为：Y＝7.78×106X －1.90×104，相关系数R＝0.9998。
精密度试验：
取原材料5份，分别按所述原材料处理方法进行样品前处理，再按设置的色谱条件进行液相色谱分析，对肌苷酸的保留时间及含量的重现性进行分析，结果如图3所示。
回收率试验：
按所述原材料处理方法制备样品提取液，从同一样品提取液中分别取两份，每份5ml，其中一份用浓度为5％的甲醇水溶液定容至10ml，另一份加入2.5ml 0.24mg/ml的肌苷酸标准溶液，同样定容至10ml，按按设置的色谱条件对两份溶液进行液相色谱分析，依据加肌苷酸标准溶液前后溶液肌苷酸浓度变化与加肌苷酸标准溶液量的百分比计算肌苷酸的回收率，平行测定6次，结果如图4所示。
本发明采用50mmol/LpH6.5甲酸铵缓冲溶液(含5％甲醇)作为流动相测定了肌肉中肌苷酸的含量，图1和图2表明，肌肉组织样品提取液的肌苷酸色谱峰峰形优异，且与其它组分的色谱峰之间达到了良好的分离，保留时间与标准溶液中的基本一致，由图3和图4可知：原材料样品中肌苷酸保留时间和肌苷酸含量的相对标准偏差分别为0.02％和1.11％，回收率为100.33％～101.67％，表明该发明具有较好的精密度和较高的准确性，达到甚至优于以往报道。同时，与以往试验研究采用的流动相相比，本发明流动相中采用的甲酸铵为水溶性弱酸盐，其化学特性可能更有利于延长色谱柱的使用寿命，从而使本发明更适用于大量样品的测定。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“同轴”、“底部”、“一端”、“顶部”、“中部”、“另一端”、“上”、“一侧”、“顶部”、“内”、“前部”、“中央”、“两端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。