一种HPLC-ELSD检测阿维拉霉素预混剂的方法与流程

本发明属于成分检测领域，涉及检测阿维拉霉素有关物质的方法，具体的涉及一种HPLC-ELSD检测阿维拉霉素预混剂有关物质的方法。
背景技术：
：阿维拉霉素是由绿色产色链霉菌Streptomycesviridochromogenes发酵产生的，属于寡糖类抗生素。其组分有A到N共14种组分，其中阿维拉霉素A为主要组分，其生理活性最高，对梭菌、链球菌和杆菌的抑制效果特别高。其次为阿维拉霉素B。中华人民共和国农业部公告第2253号发布的阿维拉霉素预混剂质量标准对各组分的要求如下：阿维拉霉素A峰应不低于60％，阿维拉霉素B峰应不高于18％，阿维拉霉素A+B应不低于70％，其他单一组分不得过6％。可见质量标准对“其他单一组分”的要求是最严格的。“其他单一组分”既包括阿维拉霉素次要组分，也包括相关杂质。公告发布的有关物质检测方法为高效液相色谱-紫外检测法，要求杂质在选定的波长下(286nm)有紫外吸收方能检出，这在一定程度上有漏检杂质的风险。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用型检测器，消除了常见于传统HPLC检测方法中的难点，它不同于紫外和荧光检测器，响应不依赖于样品的光学特性，不受其官能团的影响，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，包括没有紫外吸收的物质。ELSD的响应值与样品的质量成正比，对所有样品的检测几乎具有相同的响应因子，因而能用于测定样品的纯度或者检测未知物。示差检测器(RI)也是一种通用型检测器，但灵敏度低，并与梯度洗脱不相容。质谱是另一种通用型检测器，但昂贵的费用和操作复杂性限制了它的应用。技术实现要素：为解决上述问题，本发明的目的是提供一种通用型检测方法，能尽量多地检测出样品中所含杂质，有效监测各组分含量以严格控制产品质量。为此将ELSD的独特检测能力与HPLC的梯度洗脱分离能力相结合，并在原梯度条件基础上进一步优化提高分离度，用于阿维拉霉素预混剂的有关物质检测。本发明为实现其目的采用的技术方案是，一种HPLC-ELSD检测阿维拉霉素预混剂的方法，包括以下步骤：a、制备阿维拉霉素对照品溶液和样品溶液；b、标准曲线绘制：将3-5份不同浓度的对照品溶液分别注入HPLC-ELSD进行测定，洗脱方式为梯度洗脱，记录对照品色谱图和峰面积；以A组分峰面积的对数值与相应A组分浓度值的对数进行线性回归；c、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并以b步骤所得线性回归方程分别计算样品溶液色谱图中A、B组分及杂质的含量百分比。进一步地，HPLC-ELSD进行测定的色谱条件如下：色谱柱：C185.0μm4.6*250mm；柱温：30-40℃；进样量：10-50μL；流速：0.9-1.1mL/min；漂移管温度：115-130℃；增益系数：1；气体流速：2.0-2.8L/min；运行时间：40-50min；流动相A：甲醇/乙酸铵溶液＝50/50；流动相B：甲醇/乙酸铵溶液＝80/20；进一步地，所述梯度洗脱程序为：时间minA％B％0703037030373565407030457030进一步地，所述阿维拉霉素对照品溶液以乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)为溶剂，浓度为0.16-1.6mg/mL。进一步地，所述阿维拉霉素样品溶液的制备方法为：取阿维拉霉素加甲醇制成每1mL中含阿维拉霉素0.8-1.3mg的溶液，充分搅拌或超声40-90min，摇匀，滤纸过滤，吸取滤液5mL置培养皿中，通风橱中室温晾干，定量加入乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)，玻璃棒搅拌使溶解均匀，用微孔滤膜过滤，作为阿维拉霉素样品溶液。进一步地，所述流动相A和流动相B中所用乙酸铵溶液的浓度为0.04mol/L。进一步地，所述流动相A和流动相B的处理方法为：甲醇和乙酸铵溶液分别用有机系和水系微孔滤膜真空抽滤，然后分别按照50/50和80/20的比例混合均匀，分别作为流动相A和流动相B，然后超声脱气15-30min。进一步地，所述阿维拉霉素样品溶液为预混剂样品溶液。进一步地，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。本发明的有益效果为：本方法在公告方法的基础上进行了改进，浸提溶剂由丙酮改为甲醇，毒性和挥发性降低；样品处理步骤简化，效率更高；梯度洗脱条件优化后各峰之间的分离度提高，各成分计算更加准确，且流动相不需调pH值，节省时间，减少操作失误的可能性；检测器由紫外检测器改为通用型蒸发光散射检测器，检测范围更大，对杂质的监控更全面，更严格。本发明采用的方法准确度高，重复性好，杂质监测更全面，可作为生产企业的内控方法，使产品质量高于质量标准，在市场上更具优势。附图说明图1为实施例1对照品溶液一色谱图(质量浓度为1.6mg/mL)；图2为实施例1对照品溶液二色谱图(质量浓度为0.53mg/mL)；图3为实施例1对照品溶液三色谱图(质量浓度为0.16mg/mL)；图4为实施例1样品溶液色谱图(计算浓度为0.98mg/mL)；图5为实施例2对照品溶液一色谱图(质量浓度为1.4mg/mL)；图6为实施例2样品溶液色谱图(计算浓度为0.53mg/mL)；图7为实施例3对照品溶液一色谱图(质量浓度为1.0mg/mL)图8为实施例3样品溶液色谱图(计算浓度为0.55mg/mL)；图9为阿维拉霉素对照品的线性回归曲线图。具体实施方式下面以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：1、仪器液相色谱仪：Waterse2695检测器：AlltechELSD6000蒸发光散射检测器色谱柱：HubbleC185μm4.6*250mm2、梯度洗脱程序：时间minA％B％0703037030373565407030457030具体实施例1：色谱条件：色谱柱：C185.0μm4.6*250mm；柱温：32℃；进样量：20μL；流速：1.1mL/min；漂移管温度：120℃；增益系数：1；气体流速：2.4L/min；检测时间：45min；流动相A：甲醇/乙酸铵＝50/50；流动相B：甲醇/乙酸铵＝80/20；a、制备阿维拉霉素对照品溶液：精密称取阿维拉霉素对照品40mg，溶于25mL乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)混合溶剂中，摇匀，作为对照品溶液一；取对照品溶液一用乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)混合溶剂分别稀释3倍和10倍，分别得到对照品溶液二和三；b、制备阿维拉霉素样品溶液：取阿维拉霉素样品适量，加甲醇制成每1mL中含阿维拉霉素1.0mg的溶液，充分搅拌40min，摇匀，滤纸过滤，吸取滤液5mL置培养皿中，通风橱中室温晾干，加入乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)5mL，玻璃棒搅拌使溶解均匀，用微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；c、制备标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将对照品溶液三、二、一依次进样，每个溶液平行进样2次，目标峰与前后杂质峰分离度R>1.5；记录色谱图和峰面积。以A组分峰面积的对数值与相应A组分浓度值的对数进行线性回归；d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并以c步骤所得线性回归方程分别计算样品溶液色谱图中A、B组分及各个杂质的含量百分比。从附图1-4可以看出，实施例1对照品溶液一色谱图(质量浓度为1.6mg/mL)；A保留时间34.411min，B保留时间24.307min。实施例1对照品溶液二色谱图(质量浓度为0.53mg/mL)；A保留时间34.435min，B保留时间24.262min。实施例1对照品溶液三色谱图(质量浓度为0.16mg/mL)；A保留时间34.451min，B保留时间24.295min。实施例1样品溶液色谱图(计算浓度为0.98mg/mL)；A保留时间34.427min，B保留时间24.294min。具体实施例2：色谱条件：色谱柱：C185.0μm4.6*250mm；柱温：35℃；进样量：30μL；流速：1.0mL/min；漂移管温度：118℃；增益系数：1；气体流速：2.2L/min；检测时间：45min；流动相A：甲醇/乙酸铵＝50/50；流动相B：甲醇/乙酸铵＝80/20；a、制备阿维拉霉素对照品溶液：精密称取阿维拉霉素对照品70mg，溶于50mL乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)混合溶剂中，摇匀，作为对照品溶液一；取对照品溶液一用乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)混合溶剂分别稀释5倍和8倍，分别得到对照品溶液二和三；b、制备阿维拉霉素样品溶液：取阿维拉霉素样品适量，加甲醇制成每1mL中含阿维拉霉素1.1mg的溶液，超声50min，摇匀，滤纸过滤，吸取滤液5mL置培养皿中，通风橱中室温晾干，加入乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)10mL，玻璃棒搅拌使溶解均匀，用微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；c、制备标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线30min，将对照品溶液三、二、一依次进样，每个溶液平行进样3次，目标峰与前后杂质峰分离度R>1.5；记录色谱图和峰面积。以A组分峰面积的对数值与相应A组分浓度值的对数进行线性回归；d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并以c步骤所得线性回归方程分别计算样品溶液色谱图中A、B组分及各个杂质的含量百分比。如附图5-6所示，实施例2对照品溶液一色谱图(质量浓度为1.4mg/mL)；A保留时间34.540min，B保留时间24.415min。实施例2样品溶液色谱图(计算浓度为0.53mg/mL)；A保留时间34.416min，B保留时间24.249min。具体实施例3：色谱条件：色谱柱：C185.0μm4.6*250mm；柱温：38℃；进样量：25μL；流速：0.9mL/min；漂移管温度：125℃；增益系数：1；气体流速：2.6L/min；检测时间：50min；流动相A：甲醇/乙酸铵＝50/50；流动相B：甲醇/乙酸铵＝80/20；a、制备阿维拉霉素对照品溶液：精密称取阿维拉霉素对照品50mg，溶于50mL乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)混合溶剂中，摇匀，作为对照品溶液一；取对照品溶液一用乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)混合溶剂分别稀释2倍和4倍，分别得到对照品溶液二和三；b、制备阿维拉霉素样品溶液：取阿维拉霉素样品适量，加甲醇制成每1mL中含阿维拉霉素1.2mg的溶液，超声80min，摇匀，滤纸过滤，吸取滤液5mL置培养皿中，通风橱中室温晾干，加入乙腈/磷酸氢二铵缓冲液(1/1)10mL，玻璃棒搅拌使溶解均匀，用微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；c、制备标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线40min，将对照品溶液三、二、一依次进样，每个溶液平行进样3次，目标峰与前后杂质峰分离度R>2.0；记录色谱图和峰面积。以A组分峰面积的对数值与相应A组分浓度值的对数进行线性回归；d、样品测定与结果计算：将样品溶液注入HPLC-ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并以c步骤所得线性回归方程分别计算样品溶液色谱图中A、B组分及各个杂质的含量百分比。如图7-8所示，实施例3对照品溶液一色谱图(质量浓度为1.0mg/mL)；A保留时间35.190min，B保留时间24.860min。实施例3样品溶液色谱图(计算浓度为0.55mg/mL)；A保留时间36.222min，B保留时间25.843min。当前第1页1 2 3