使用FTIR进行植物性状检测和性状基因渗入的方法和系统与流程

本申请要求2016年6月9日提交的美国临时申请62/347,728的优先权和权益。该/这些申请的全部内容在此以引用的方式并入本申请中。

背景技术：

种子中的某些脂肪酸，包括ω-3脂肪酸(例如二十二碳六烯酸或dha；二十二碳五烯酸或dpa；α-亚麻酸或ala；以及二十碳五烯酸或epa)，由于它们的健康价值而继续获得增加的市场吸引力。确定一群种子的脂肪酸谱是费力的和耗时的。常用的方法包括对种子进行取样并且从种子样品中提取所关注的组分进行分析。这些方法会对种子造成破坏。对种子的非破坏性分析是重要的，这是因为它允许选择具有所期望的性状的事件，同时保持种子存活。

美国专利号6,809,819公开了一种使用蒸发光散射检测技术来测定种子中的油含量的方法。所述方法包括使用溶剂从种子样品中提取油；在气流中蒸发溶剂以形成油颗粒；将光引导到气流和油颗粒中以引起来自所述油颗粒的反射光；以及基于所述反射光确定油含量。

美国专利公开号2012/0092663公开了一种使用透射拉曼光谱法(transmissionramanspectroscopy，trs)分析种子或谷粒来确定种子的组成，如蛋白质和油含量的方法。

种子中油或脂肪酸含量的定量分析常常使用常规方法进行，如近红外分析(nir)、核磁共振成像(nmr)、索氏萃取(soxhletextraction)、加速溶剂萃取(ase)、微波萃取、以及超临界流体萃取。在提取油之后，将脂肪酸组分水解和衍生化，之后通过气相色谱法或液相色谱法分离。这些方法是耗时的并且不适于对种子进行高通量筛选。

由于遗传和环境影响而不断变化的性状通常被称为“数量性状”。数量性状可以基于以下两个因素与“质量”性状或“离散”性状相区分：环境对基因表达的影响，这些影响产生表型的连续分布；以及由多基因遗传产生的复杂分离模式。鉴定与数量性状的表达相关的基因组的一个或多个区域会引起数量性状基因座(qtl)的发现。qtl已经用于性状基因渗入或在遗传水平上的其他育种应用。然而，性状基因渗入或其他育种应用的决策常常需要基于植物种子的组成，而非遗传分析来做出。

因此，需要可用于提供用于植物育种和/或性状基因渗入的高通量、非破坏性、和/或快速周转方法的发明。

技术实现要素：

提供了具有有成本效益、节省时间、和信息丰富的用户友好特征的优势以实现性状基因渗入的方法和/或系统。所提供的方法包括使用傅里叶变换红外(fouriertransformedinfrared，ftir)光谱确定ω-3脂肪酸(例如二十二碳六烯酸或dha；二十二碳五烯酸或dpa；α-亚麻酸或ala；以及二十碳五烯酸或epa)的存在。使用ftir使得能够使用基于多变量的mid-ftir模型来分析种子中所含的油。所提供的方法和/或系统可以维持种子完整性并且提供信息以促进性状基因渗入和其他育种应用。

本发明涉及用于确定植物部分中多不饱和脂肪酸(pufa)的存在、加速转基因植物的基因渗入、和/或消除转基因植物的基因沉默的方法和系统，其中使用傅里叶变换红外(ftir)光谱法而不评价实际植物的表型。在一个方面，提供了一种用于确定植物部分中多不饱和脂肪酸(pufa)的存在的方法。所述方法包括：

(a)获得所述植物部分的样品；

(b)进行傅里叶变换红外(ftir)光谱法，其包括约3800cm^-1波数至约2600cm^-1波数的第一吸收带；

(c)将所述步骤(b)的ftir光谱结果与现有的参考ftir光谱结果相比较；以及

(d)预测所述样品是否含有至少一种pufa。

在一个实施方案中，所提供的方法还包括约7400cm^-1波数至约5400cm^-1波数的第二吸收带。在另一个实施方案中，所述植物部分包括种子。在另一个实施方案中，所述植物部分包括芥花(canola)种子。在另一个实施方案中，所述pufa包括ω-3多不饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，所述ω-3多不饱和脂肪酸包括二十二碳六烯酸(dha)。在另一个实施方案中，所述ω-3多不饱和脂肪酸选自由以下各项组成的组：二十二碳六烯酸(dha)、二十二碳五烯酸(dpa)、α-亚麻酸(ala)、二十碳五烯酸(epa)、以及其组合。在另一个实施方案中，所述植物选自由以下各项组成的组：芥花、大豆、向日葵、棉花、芸苔、油菜籽、花生、玉米、小麦、水稻、苜蓿、以及燕麦。在另一个实施方案中，所述植物是转基因植物。在另一个实施方案中，所述植物部分包含转基因植物细胞。在另一个实施方案中，所述植物是第一代、第二代、第三代、第四代、第五代回交植物或其组合的回交植物。

在一个实施方案中，将方法针对基线变化校正。在另一个实施方案中，将方法针对水蒸气干扰校正。在另一个实施方案中，将所述方法针对基线变化和水蒸气干扰校正。在另一个实施方案中，通过遗传算法，通过使用在校准集与预验证集之间分割的数据的模型来确定相关性。

在另一个方面，提供了一种用于植物性状基因渗入的计算机化系统。所述系统包括：

(a)数据库，所述数据库包括含有至少一种多不饱和脂肪酸(pufa)的样品和不含pufa的样品的现有参考傅里叶变换红外(ftir)光谱结果；

(b)植物部分的至少一个样品；

(c)由非反射金属合金制成的定制的样品夹持器；以及

(d)能够测量ftir光谱的仪器。

在一个实施方案中，所述ftir光谱结果包括约3800cm^-1波数至约2600cm^-1波数的第一吸收带。在另一个实施方案中，所述ftir光谱结果还包括约7400cm^-1波数至约5400cm^-1波数的第二吸收带。在另一个实施方案中，所述植物部分包括种子。在另一个实施方案中，所述植物部分包括芥花种子。在另一个实施方案中，所述pufa包括ω-3多不饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，所述ω-3多不饱和脂肪酸包括二十二碳六烯酸(dha)。在另一个实施方案中，所述ω-3多不饱和脂肪酸选自由以下各项组成的组：二十二碳六烯酸(dha)、二十二碳五烯酸(dpa)、α-亚麻酸(ala)、二十碳五烯酸(epa)、以及其组合。在另一个实施方案中，所述植物选自由以下各项组成的组：芥花、大豆、向日葵、棉花、芸苔、油菜籽、花生、玉米、小麦、水稻、苜蓿、以及燕麦。在另一个实施方案中，所述植物是转基因植物。在另一个实施方案中，所述植物部分包含转基因植物细胞。在另一个实施方案中，所述植物是第一代、第二代、第三代、第四代、第五代回交植物或其组合的回交植物。

在另一个方面，提供了一种加速转基因植物的基因渗入和/或消除转基因植物的基因沉默的方法。所述方法包括：

(a)从植物部分获得关于所关注的性状的傅里叶变换红外(ftir)光谱信息；

(b)从所述提供所述植物部分的植物中选择种子并且基于所述来自步骤(a)的ftir结果表达所述性状；

(c)种植来自步骤(b)的种子；

(d)收集来自步骤(c)的后代种子；

以及将步骤(a)-步骤(d)重复至少三代。

在一个实施方案中，所述ftir光谱结果包括约3800cm^-1波数至约2600cm^-1波数的第一吸收带。在另一个实施方案中，所述ftir光谱结果还包括约7400cm^-1波数至约5400cm^-1波数的第二吸收带。在另一个实施方案中，所述植物部分包括种子。在另一个实施方案中，所述植物部分包括芥花种子。在另一个实施方案中，所述所关注的性状包括至少一种多不饱和脂肪酸(pufa)的存在。在另一个实施方案中，所述pufa包括ω-3多不饱和脂肪酸。在另一个实施方案中，所述ω-3多不饱和脂肪酸包括二十二碳六烯酸(dha)。在另一个实施方案中，所述ω-3多不饱和脂肪酸选自由以下各项组成的组：二十二碳六烯酸(dha)、二十二碳五烯酸(dpa)、α-亚麻酸(ala)、二十碳五烯酸(epa)、以及其组合。在另一个实施方案中，所述植物选自由以下各项组成的组：芥花、大豆、向日葵、棉花、芸苔、油菜籽、花生、玉米、小麦、水稻、苜蓿、以及燕麦。在另一个实施方案中，所述植物是转基因植物。在另一个实施方案中，所述植物部分包含转基因植物细胞。

附图说明

图1提供了用于所提供的实施例中的基因渗入育种方案。在作为父本的dha转基因事件035(纯合t2植物)与作为母本的ω-9材料(nx4-105rr或g2x0062)之间进行杂交。

图2示出了含有所期望的dha含量(在这种情况下，是种子内脂质的约5重量％)的芥花种子的代表性ftir光谱。

图3示出了不含可检测的dha(即种子内脂质的约0重量％)的芥花种子的代表性ftir光谱。

具体实施方式

芥花种子是全世界主要的健康油来源，特别是因为它含有相对高量的多不饱和脂肪和相对低量的饱和脂肪。制造更健康的油是食品行业的主要焦点。为此，将其他健康油(如低饱和脂肪芥花油)与其他健康油(如dha)共混正变得更加普遍。ω-3脂肪酸(例如二十二碳六烯酸或dha；二十二碳五烯酸或dpa；α-亚麻酸或ala；以及二十碳五烯酸或epa)是许多生物功能所需的长链多不饱和脂肪酸(pufa)，并且可能牵涉到健康的脑发育、健康的心脏、以及眼睛的发育和健康。目前，ω-3脂肪酸的最佳来源越来越多地可从鱼类或鱼油中获得。

一些人已经开始改良芥花以使得ω-3脂肪酸(例如dha)可以由植物本身产生，从而消除了对共混的需要，并且显著降低ω-3脂肪酸(例如dha)的成本。然而，在植物中产生ω-3脂肪酸(例如dha)的这些努力受到了长期育种过程、对性状进行基因渗入、以及选择在产生这些ω-3脂肪酸(例如dha)方面最有效的那些植物的阻碍。提供了利用傅里叶变换红外(ftir)光谱以非破坏性方式分析整个种子的系统和方法，其中在种植之前可以确定种子的ω-3脂肪酸(例如dha)含量，从而减少开发表达高水平的ω-3脂肪酸(例如dha)的生产性芥花品系的步骤(并且因此，所需种植季节)的数量。

提供傅里叶变换红外(ftir)光谱作为快速和可靠的非破坏性选择方法以通过定量植物种子(例如芥花种子)中ω-3脂肪酸(例如dha)的量来促进基因渗入群体中准确和一致的种子选择决策。测量这些特性的传统方法需要更大量的收获谷粒；种植数千个育种和基因渗入群体；在种植后3周对植物进行取样；在实验室中确认性状基因的接合性；数据分析和缩减；以及消除无效物和其他群体以仅保留具有高ω-3脂肪酸(例如dha)含量的植物。本文提供的系统和方法使得能够使用ftir扫描/筛选非破坏性地使用单个种子来在种植/育种之前消除无效物并且鉴定含有所期望含量的ω-3脂肪酸(例如dha)的种子。因此，本文提供的系统和方法可以加速植物基因渗入育种过程、事件分选和事件表征决策过程，提高效率并且显著降低成本和时间。

如本文所用的短语“约”指的是比所述值或值的范围大或小10％，但不意图仅将任何值或值的范围指定为该更宽泛的定义。前面有术语“约”的每个值或值的范围还意图涵盖所述绝对值或值的范围的实施方案。

如本文所用的短语“转化的”或“转化”指的是将dna引入细胞中。短语“转化体”或“转基因”指的是已经被转化或已经经历转化程序的植物细胞、植物等。引入的dna通常呈含有插入的dna片段的载体形式。

如本文所用的短语“转基因植物”指的是基因组已经由于重组dna的稳定整合而改变的植物。转基因植物包括从最初转化的植物细胞再生的植物和来自转化植物的后代或杂交的后代转基因植物。

如本文所用的短语“重组dna”指的是已经在细胞外被遗传工程化和构建的dna，包括含有天然存在的dna或cdna或合成dna的dna。

如本文所用的短语“基因型”意指表型的遗传组分并且它可以使用标记间接表征或通过核酸测序直接表征。合适的标记包括表型特征、代谢特征、遗传标记、或一些其他类型的标记。基因型可以构成至少一个遗传标记基因座的等位基因或至少一个单倍型窗口的单倍型。在一些实施方案中，基因型可以代表单个基因座，并且在其他实施方案中，它可以代表全基因组范围的一组基因座。在另一个实施方案中，基因型可以反映染色体的一部分、整个染色体、基因组的一部分和整个基因组的序列。

如本文所用的短语“表型”指的是作为基因表达的表现形式的细胞或生物体的可检测的特征。

如本文所用的短语“优良品系”指的是为了优越的农艺学表现而由育种和选择产生的任何品系。优良植物是来自优良品系的任何植物。

如本文所用的短语“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草、拟南芥、大豆、番茄、番木瓜、芥花、向日葵、棉花、苜蓿、马铃薯、葡萄藤、木豆、豌豆、芸苔、鹰嘴豆、甜菜、油菜籽、西瓜、甜瓜、胡椒、花生、南瓜、萝卜、菠菜、西葫芦、西兰花、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黄瓜、茄子以及莴苣。单子叶植物的实例包括玉米、水稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麦、洋葱、小米以及黑小麦。

如本文所用的术语“植物”还包括完整植物和植物的任何后代、细胞、组织或部分。术语“植物部分”包括植物的任何一个或多个部分，包括例如而不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插条；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如花粉、胚芽、花、果实、芽、叶、根、茎以及外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或组织成结构单元或功能单元的任何其他植物细胞群。植物细胞或组织培养物能够再生具有产生所述细胞或组织的植物的生理特征和形态特征的植物，并且能够再生具有与该植物基本上相同的基因型的植物。相反，一些植物细胞不能再生以产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚芽、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、穗丝、花、果仁、穗、穗轴、果壳或梗。

植物部分包括可收获部分和可用于后代植物繁殖的部分。可用于繁殖的植物部分包括例如而不限于：种子；果实；插条；幼苗；块茎；以及根茎。植物的可收获部分可以是植物的任何有用的部分，包括例如而不限于：花；花粉；幼苗；块茎；叶；茎；果实；种子；以及根。

如本文所用的短语“性状”指的是植物或特定植物材料或细胞的生理特征、形态特征、生物化学特征或物理特征。在一些情况下，该特征是人眼可见的，包括种子或植物大小，或者可以通过以下技术来测量：通过生物化学技术，包括检测种子或叶子的蛋白质、淀粉或油含量，或通过观测代谢过程或生理过程(例如通过测量二氧化碳的摄取)，或通过观测一个或多个基因的表达水平(例如通过使用rna印迹分析、rt-pcr、微阵列基因表达测定)或报告基因表达系统的表达水平，或通过农业观测，包括胁迫耐受性、产量或病原体耐受性。

虽然已经参考具体方法和实施方案描述了本发明，但是应当理解的是，可以在不背离本发明的情况下进行各种修改和改变。本文引用的所有出版物都明确地以引用的方式并入本文以实现描述和公开可能结合本发明使用的组合物和方法的目的。所有引用的专利、专利申请、以及所引用的网站和公共数据库中的序列信息也以引用的方式并入本文。

实施例

实施例1

ftir操作模式：将芥花(甘蓝型油菜)种子放置在定制设计的96孔微量滴定板中。板材料由非反射金属合金制成，其具有凹痕以容纳圆形的种子。然后将加载的板引入bruker傅里叶变换红外(ftir)仪器中，所述仪器包括配备有hts-xt板读数器的vertextensor27。使用液氮冷却mct(型号316)检测器并且使用总反射表面(金靶)的强度来校准系统。

在7500cm^-1至600cm^-1的波数范围内以8cm^-1的分辨率和20khz的镜速度来进行ftir扫描。获得了32次连续扫描并且使用每个样品的平均值进行化学计量预测。所述系统由opus7.0软件控制。在opus中使用quant2工作流程来构建校准模型。应用具有17个平滑点的一阶导数和多元散射校正(msc)来产生校准光谱。对该校准进行验证以提供90.56的r²值、0.438的rmsep、以及3.27的rpd。

模型：将来自不同品种的芥花(甘蓝型油菜)单个种子进行称重，然后使用ftir扫描，继而使用单独的方法(例如美国专利公开号us2014/0359900a1中所公开)测定它们的油含量和脂肪酸相对量。然后报告dha含量(占脂质的重量％)并且引入opusquant2(布鲁克光谱仪器有限公司(brukeropticsltd))中。

表1示出了相对于种子重量，基于定量的脂肪酸甲酯(fame)计的所选脂肪酸(c22:6、c18:1和c18:3、总饱和脂肪酸)和油含量的代表性相对组成。总饱和脂肪酸(tsfa)是c14:0、c16:0、c18:0、c20:0、c22:0以及c24:0的总和。引入模型中的大部分种子是由pufa合酶的表达产生的转基因种子(2696个种子)。将低tsfa种子种植在温室中，所述种子来自表达真菌脂肪酸去饱和酶的转基因事件。那些种子在tsfa含量方面增加了更多的变异性，而且还增加了c18:1含量。选择陶氏益农公司(dowagrosciences)的芥花专有品系以增加c18:1和c18:3相对含量的变异性。最后，还将田间和温室种植的种子添加到模型中以增加油含量的变异性(25％至42％)。油量和质量的所有这些变异使得所述模型能够更加稳健以用于在常规的或高油酸芥花品系中进行dha性状的进一步基因渗入。

图2示出了含有所期望的dha含量(在这种情况下，是种子内脂质的约5重量％)的芥花种子的代表性ftir光谱。图3示出了不含可检测的dha(即种子内脂质的约0重量％)的芥花种子的代表性ftir光谱。

实施例2

在作为父本的dha转基因事件035(纯合t2植物)与作为母本的ω-9材料(nx4-105rr或g2x0062)之间进行杂交，如图1中所示。在作为父本的dha转基因事件035(纯合t2植物)与作为母本的陶氏益农公司的ω-9材料(dasω-9商业品种nx4-105rr或dasω-9芥花近交系g2x0062)之间进行杂交。g2x0062近交系已经描述于美国专利号8,558,065和8,530,726中。dha转基因事件035已经描述于国际专利申请公开wo2015/081270中。

如实施例1中所述进行傅里叶变换红外(ftir)扫描，并且这些ftir结果显示f1中的dha性状与两个亲本相比表现为半显性并且所有f1对于dha性状都是半合子的，如所预期的那样。因此，在种植之前使用ftir结果来预测f1收获种子的性状遗传学和dha种子选择。在种植之前消除不含dha的dha异常值(这是因为杂交是手动授粉过程)。

此外，通过使半合子f1植物与ω-9亲本杂交而获得bc1f1种子，如图1中所示。如从单个基因座的孟德尔遗传(mendelianinheritance)所预期的那样，50％的bc1f1种子含有至少1个拷贝的dha转基因(dha存在)并且50％的bc1f1种子不含可检测的dha。从这些ftir扫描中，确定了dha预测，其中分别种植含有dha的bc1f1种子和不含dha的bc1f1种子以进行dha转基因分子确认。基于以下5个dha转基因测定来对dha基因进行分子确认：pfa1、pfa2、pfa3、heti以及pat，如国际专利公开号wo2015/081270a1中先前所公开的那样。表2示出了bc1f1种子的结果，其中来自如通过ftir所确定的含有dha的bc1f1种子的植物在dha基因的分子确认之后是100％阳性，这验证了ftir筛选结果。类似地，来自如通过ftir所确定的不含dha的bc1f1种子的植物在dha基因的分子确认之后是100％阴性，这再次验证了ftir筛选数据(数据未示)。因此，选择基于ftir结果具有最高的dha％的bc1f1种子以用于推进到随后的基因渗入世代以产生f2代。

随后，对f2群体进行ftir分析以用于预测dha。对于nx4-105rr背景，扫描和种植了总共1174个f2种子，并且对于g2x0062背景，扫描和种植了总共902个f2种子(从而使得总共2076个f2种子用于ftir扫描和dha基因的分子确认)。结果确认了，ftir扫描有助于选择含有最高dha的种子以在种植之前富集处于纯合状态的群体并且消除约50％的f2群体。基于ftir的f2选择使得能够将待种植的种子数量减少至少75％，这加速了整个基因渗入/育种过程并且同时减少了所需的温室空间。此外，进一步的数据显示，dha阳性转基因植物的选择可以通过基于ftir扫描选择高于0.75％的dha(消除无效物)来富集。