本发明涉及到血液肥大细胞糜蛋白酶活性表达的体外快速检测方法
背景技术：
肥大细胞专属酶糜蛋白酶(mc-chymase)是一种丝氨酸蛋白酶，高表达于肥大细胞。主要位于皮肤的真皮层以及结缔组织的肥大细胞亚群中(mctc)。mcchymase可以转化血管紧张素i成为血管紧张素ii；裂解细胞间质和刺激部分细胞因子的活化；介入器官炎症和组织纤维化，引起微血管的通透性和聚集炎症细胞，引起局部炎症反应，在炎症、细胞外基质重构和组织微环境的稳态维持起到重要作用。血液中chymase的表达和活性和一些特定的病理生理状态相关，所以chymase检测方法的建立，无论是实验室还是医院临床都有着重要意义。
现有的测定chymase方法为酶联免疫吸附法(elisa)法，耗时长且耗资高，而结果只能说明样品中有或无chymase蛋白质的存在但无法表明dppi酶活性功能的存在和变化。我们前期发明的酶仪高通量方法检测滑膜中chymase的活性已经能够表明样品中chymase酶活性的存在和变化，但问题是收集人滑膜液样品困难，临床上实现滑膜液中chymase活性检测较难。人的血清样品取样简单，但是血清颜色会有背景干扰，影响酶标仪读数。所以，建立简单易行耗时耗资少的chymase活性表达的检测方法对实验室研究、临床chymase检测及过敏性疾病包括早期类风湿关节炎的诊断都有着重要的意义。
本发明的反应原理是：chymase与其专属性底物(suc-ala-ala-pro-phe-pna,aapf-pna)相互作用后释放自由的对硝基苯胺产物(pna)，而自由的pna产生黄色，在紫外灯下可见。本发明是基于我们自己前期使用酶标仪设备的研究结果，进一步转化为薄层层析分析系统(thinlayerchromatography，tlc)的快速检测手段。本发明不但改善了临床上滑膜液取样的困难，并建立了一个体外快速检测的新方法。本发明用tlc方法检测血液中chymase的活性表达水平，特点是鲜血微量(1-2微升)，无需血清制备，分析耗时短，易操作，可用于现场测定。
本发明使用了chymase作为预测试对象建立测定系统，然后用chymase作为系统阳性对照，测定人血液或大鼠中的chymase活性表达水平，同时用全波长荧光仪测定作为tlc的结果确认。
技术实现要素：
1.发明内容简述：
基于chymase与aafp-pna反应后释放出的自由对硝基苯胺(pna)浓度和其颜色强度相关。同时我们的发明提供了利用薄层层析法(tlc)检测血液中chymase活性的方法，成为一项体外快速检测的手段。血液中的chymase和aafp-pna相互作用，经过孵育和薄层层析分离后，反应产物pna在紫外灯下可见，观察rf定值(0.33-0.55)区间的结果显色的强弱和面积大小。
2.发明技术方案
薄层层析法(tlc)
材料：薄层层析板，展开剂石油醚-丙酮，点样毛细吸管。
过程：现场取静脉新鲜血液(人鲜血或大鼠鲜血)微量与含aapf-pna的缓冲溶液混合孵育40-60分钟。
用毛细吸管吸取混合样液于层析板点样，样点的直径在0.5cm。
置于容器中，展开剂为石油醚-丙酮，样品分离，当展开剂至薄层层析板前沿(约5分钟)，取出薄层层析板，风干；置于紫外灯下观察，紫外灯波长为365nm，层析纸上出现黄色的斑点，计算其移动速度rf值以示chymase的活性表达。
rf值(比移值)的计算公式：斑点中心距原点的距离/溶剂展开前沿距原点距离的比值。
3.本发明的优点：
3.1.特异性强，方法和设备简单便携，检测时间短，检测成本低，便于操作；
3.2.现场采血，不用分离血红蛋白，不需血清制备，可用于个体基础值的确定和快速现场检测。
附图说明
图1.产品装置设计示意图
图1a为本发明tlc检测结果；图1b为本发明装置设计示意图，该装置主要分为三部分，点样区，结果显示区和样品名称区，其长度根据rf确定，其宽度视样品数量而设置。
图2.aafpna检测chymase活性(动力学曲线)
如图2a所示chymase与底物aapf-pna相互作用后，释放出游离pna导致od值迅速增加。chymase浓度越大，反应速率越大，活性越大。图2b为不同浓度chymase与底物反应后tlc的检测结果。图2c为tlc检测结果的灰度值分析(分析软件imagej2x)及chymase浓度vs灰度值的关系。
图3.不同浓度的pna其tlc结果及血液对pna的背景干扰
a.不同浓度pna的tlc检测结果，pna浓度越大，板上的斑点越大颜色越深；b.tlc检测结果的灰度值分析及pna浓度vs灰度值的关系；c，不同浓度的pna加入鲜血后的tlc检测结果，血液造成拖尾现象，但是pna浓度越大，板上的斑点依然越大颜色越深；d，tlc检测结果的灰度值分析及pna浓度vs灰度值的关系。
图4.血液背景干扰的分析和tlc检测方法有效性的确认
正常人血液以及在等量血液中外加chymase(不同浓度)之后的tlc检测chymase活性。从图4a可以看出，和未加的比较，外加chymase后的斑点颜色强度比未加的要强。表明本检测方法无背景干扰。
正常人血液中外加不同浓度chymase之后的tlc检测chymase活性。从图4a可以看出，随着外加chymase在血液中的浓度增大，斑点颜色亮度也依次变强并呈正比，表明本检测方法的有效性。图4b表示薄层层析法检测结果的灰度值分析及外加chymase浓度vs灰度值的关系。
图5.tlc检测检测人血chymase活性的基础值
图5a.采集16个志愿者鲜血中chymase活性的tlc检测结果。有过敏史的人鲜血中的chymase活性基础值高于无过敏史人鲜血中chymase活性基础值。图5b.tlc检测结果的灰度值分析。
图6.tlc检测类风湿ra大鼠(cia)免疫前后新鲜血液中chymase的活性
如图6a所示，与免疫之前相比，cia大鼠新鲜血液中chymasei的活性表达水平有显著性提高和持续性表达。免疫后连续观察cia大鼠，并采血进行tlc分析和全波长荧光仪(perkinelmer)平行确认。免疫后分别在第1，6，13，21天取血进行tlc检测。由图可以看出ra大鼠的急性炎症过程中的chymase活性的变化，在免疫后第1天的血液中，斑点颜色强度达到最大值。tlc结果与全波长荧光仪测定的结果一致(图6c)。图6b表示tlc检测结果的灰度值分析。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明工作程序进一步说明。
实施例1：人的血液tlc检测、血液背景干扰以及检测有效性确认
1)chymase对血样干扰测定及检测有效性确认：
实验对象为正常人，分别吸取一个人的手指鲜血一滴，置于4个孔中，分别加入1μl不同浓度的chymase(0、25、50、100mu/ml)，然后加入2μl的2mm的aafp-pna，37℃，孵育40-60分钟，在硅胶板的一端点加样品反应溶液，样品间距1.0cm。将点样后的硅胶板在展开剂中展开，接近硅胶板前沿时取出，风干，置于紫外灯下观察，波长同上，观察层析纸上黄色的斑点，即为chymase和aafp-pna反应释放出的样品点pna，其颜色强度不受血液背景干扰，颜色强度和chymase浓度成正相关性。原点至层析斑点距离2.1cm，原点至溶剂前沿距离4cm，计算rf值0.53(图4)。
2)人血液chymase活性基础值：
实验对象为健康志愿者。吸取手指鲜血一滴，加入aafp-pna底物缓冲液，37℃孵育40-60分钟，在硅胶板的一端点加样品反应溶液，样品间距1.0cm。将点样后的硅胶板在展开剂中展开，展开剂接近硅胶板前沿时取出，风干后置于紫外灯下观察，紫外灯波长同上。硅胶板上展开的亮斑，即为chymase和aafp-pna反应后释放出的显色样品点pna。原点至层析斑点距离2.2cm，原点至溶剂前沿距离4.0cm，计算rf值0.55(图5)。
实施例2：大鼠胶原诱导的类风湿关节炎(cia)模型，tlc检测大鼠新鲜血液中chymase的活性。
大鼠眼眶取2μl新鲜血液，分别加入2μl的aafp-pna，37℃孵育40-60分钟，在硅胶板的一端点加样品反应溶液，样品间距1.0cm。将点样后的滤纸在展开剂中展开，展开剂前段接近硅胶板前沿时取出，风干后置于紫外灯下观察，紫外灯波长为365nm。硅胶板展开的斑点，即为大鼠鲜血中的chymase和aafp-pna反应释放出的样品点pna。原点至层析斑点距离2.0cm，原点至溶剂前沿距离4cm，计算rf值0.50。同时用全波长荧光仪作平行检测以确认结果(图6)。
本发明中所采用的薄层色谱法是用硅胶板为固定相支持物，有机溶剂作为流动相，有机相流经硅胶板时，显色反应产物pna的分配系数区别于aafp-pna，因此扩散速度不同，近而达到分离的目的。本发明对人和cia大鼠的新鲜血液进行chymase的tlc分析检测，检测结果表明：a.血液中外加chymase的活性无血液背景干扰，并和加入的chymase浓度呈正相关，并且tlc检测结果和全波长荧光仪检测结果一致；b.有过敏史的人鲜血中chymase活性的基础值高于无过敏史人献血中的chymase活性基础值；c.cia大鼠血液中chymase水平和大鼠的炎症发展一致，而且tlc的检测结果与全波长荧光仪检测的结果也一致。本发明的有益效果是简单快速微量，省时省钱省材，重要的是填补了现行检测chymase方法的不足。