本发明涉及一种医用胶原蛋白海绵中金属污染物的检测方法及应用，属于质量控制技术领域。
背景技术：
医用胶原蛋白海绵在医疗器械中一般作为止血材料使用，在体内直接接触组织和血液，大多数情况在体内降解而非术后取出。因此胶原蛋白按三类医疗器械进行监管，对人体有潜在危险，需对其安全性、有效性严格控制。
金属元素毒性大潜伏期长，且能沿食物链富集，对人体有明显的危害。进入大气、水体和土壤等各种环境的金属元素，均可通过呼吸道、消化道和皮肤等各种途径被动物吸收，当积累到一定量后，会损害神经系统、造血系统和消化系统，降低机体免疫力。而胶原蛋白产品中的金属元素，因为其能直接接触人体血液器官和组织，相对于胃肠道吸收可能对患者带来更严重的危害，因此，更应高度关注其金属元素的安全性问题。
医用胶原蛋白海绵在生产过程中，金属元素杂质的引入常通过原料、生产工艺、生产环境及运输贮存等途径，如伪劣原料、各种添加剂和环境污染物等。除此之外，其生产工艺中所用的不锈钢反应釜、金属材质工具及玻璃容器的腐蚀与溶出，都有可能成为杂质的来源。尤其是在生产所用到的醋酸溶液及NaCl盐析的过程，都是加速不锈钢腐蚀，析出金属杂质的重要诱因。金属元素杂质引入途径繁杂，避免污染难度大，而且由于动物源生物材料的特殊构造，其所含的诸如肽、羧基、巯基等官能团，对金属元素本身具有一定的吸附和富集作用，这无疑增加了生物材料在生产中被金属元素杂质污染的机会。鉴于金属元素对人体有巨大的健康隐患，应当保证这些金属杂质符合限度要求，可以采用基于风险的控制策略来确保产品满足限度标准。
现阶段对生物材料中金属元素的含量大多采用中国药典传统方法，取炽灼残渣项下做金属总量的比色检测，但是此方法存在一定的缺陷。有研究发现这些基于硫化物沉淀颜色强度的方法是非特异，不灵敏，费时费力的，通常回收率很低或没有回收率，建议用现代仪器法替代比色法。另外，采用目视比色对金属元素总量进行检查的方法无法对每种金属元素进行微量甚至痕量分析，这显然无法满足日益严格的医疗产品质量控制的需要。
中国专利文献CN102928500A(申请号201210458379.1)公开了一种海产品中硒形态分析的检测方法，尤其涉及一种使用微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法直接测定海产品中有机硒、蛋白硒或多糖硒的检测方法，可以高效、简便、快速的测定海产品中有机硒、蛋白硒和多糖硒；中国专利文献CN103364482A(申请号CN201310311021.0)公开了一种微波消解ICP-MS测定药用铝箔中铅含量的方法；中国专利文献CN107462626A(申请号CN201710729590.5)公开了一种微波消解－电感耦合等离子体质谱法测定电子烟烟液接触金属器具主要成分的方法；中国专利文献CN103940897A(申请号CN201410202219.X)公开了一种使用微波消解-电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定食品中痕量汞、镉、铅、砷的方法。
近年来，国内外越来越重视金属杂质的溶出检测及其限度问题，国际上陆续出台了针对金属元素限度的标准及指导原则，如美国药典<232药品元素杂质限度>、ICH Q3D<元素杂质指导原则>，EMEA/CHMP的金属催化剂或金属试剂残留量限度规定的指导文件；国内也陆续出台《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则(试行)》及《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则(试行)》，越来越重视金属杂质的溶出检测及其限度问题。而生物材料等风险较高的医疗器械在此方面并无相应的指导原则及安全性评价标准。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种医用胶原蛋白海绵中金属污染物检测方法及应用，主要是使用微波消解-电感耦合等离子体质谱法检测医用胶原蛋白海绵中的金属污染物，并应用该方法检测医用胶原蛋白海绵生产过程中金属污染物在各控制点的溶出，制定控制策略降低医用胶原蛋白海绵中金属污染物的含量，并制定合理的胶原蛋白类材料中金属杂质评价体系。
本发明的技术方案如下：
一种医用胶原蛋白海绵中金属污染物的检测方法，包括以下步骤：
(1)精密称取已经剪碎的胶原蛋白样品0.1～0.3g，精确至0.0001g，置于聚四氟乙烯消解罐内，加硝酸5～15mL混匀，置微波消解系统中，按消解程序消解；消解完毕后，取消解内罐置电加热器上，于120～140℃加热，至红棕色蒸汽挥尽并近干，用体积百分比为2％的硝酸转移至25mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，获得供试品溶液；
(2)用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对步骤(1)获得的供试品溶液进行全质量数扫描，选取有响应值的金属元素用ICP-MS和电感耦合等离子发射光谱法(ICP)进行定量分析，ICP-MS定量分别采用标准、碰撞、反应三种工作模式。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中，精密称取已经剪碎的胶原蛋白样品0.2g，精确至0.0001g。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中，硝酸的添加量为10mL。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中，电加热器的加热温度为130℃。
根据本发明优选的，上述步骤(1)中的消解程序如下：(a)、功率1600W，120℃，升温时间5min，保持3s；(b)、功率1600W，150℃，升温时间6min，保持2s；(c)、功率1600W，180℃，升温时间6min，保持20s。
根据本发明优选的，上述步骤(2)中ICP-MS全质量数扫描的工作参数为：扫描模式：跳峰；工作模式：标准；载气流量：1.00mL/min；射频功率：1600.00W；辅助气流量：1.20mL/min；等离子气流量：18mL/min；扫描次数：12次；保留时间：50ms/AMU。
根据本发明优选的，上述步骤(2)中ICP-MS定量分析的工作参数为：雾化器：同心雾化器；雾化室：玻璃旋流雾室；三锥材质：铂锥；等离子气流量：16.0L/min；辅助气流量：1.2L/min；雾化器流量：1.00–1.05L/min；样品进样速率：250μL/min；射频功率：1600W；积分时间：500–1500ms；样品重复次数：3；工作模式：标准模式、使用氦气的碰撞模式、使用氨气的反应模式；
不同工作模式的参数如下表所示：
根据本发明优选的，上述步骤(2)中ICP定量分析的工作参数为：泵速：50rpm；RF频率：27.12MHz；RF功率：1150W；辅助气：0.5L/min；雾化器：玻璃同心雾化器；雾化室：旋流雾室。
应用上述检测方法检测医用胶原蛋白海绵生产过程中金属污染物溶出控制风险点。
应用上述检测方法建立医用胶原蛋白海绵中金属污染物的安全评价标准。
本发明的有益效果：
1、本发明的检测方法，利用硝酸作为消解酸，并使用微波消解对样品进行前处理，克服了现阶段对金属总量的比色检测方法的非特异、不灵敏、回收率很低等问题。并且采用电感耦合等离子发射光谱(ICP)及电感耦合等离子质谱(ICP-MS)对多元素测定，节省了工作时间及强度，提高了准确性，并根据测试元素的特性，分别采用标准、碰撞、反应三种不同的工作模式，优化了参数，避免了复杂基体的干扰，降低了元素的检出限。
2、医用胶原蛋白海绵在生产过程中，金属污染物的引入常通过原料、生产工艺、生产环境及运输贮存等途径，如伪劣原料、各种添加剂和环境污染物等，除此之外，其生产工艺中所用的不锈钢反应釜、金属材质工具及玻璃容器的腐蚀与溶出，都有可能成为杂质的来源，本发明的检测方法针对医用胶原蛋白海绵的生产工艺，探究医用胶原蛋白海绵金属污染物的产生机理及控制风险点，在生产工艺上准确布点监控，为企业指导生产奠定基础。
3、本发明结合实验数值，参照国内外金属元素的相关标准及部分毒理学数据，制定合理的医用胶原蛋白海绵中金属杂质可接受限量，对企业生产工艺管理及产品质量控制提供技术支持，并对此类产品的安全性评价提供数据支持，填补了国内外没有此类产品金属杂质可接受限量的空白。
具体实施方式
本发明通过以下实施例作进一步说明，但并不仅限于此。
主要仪器及试剂：
美国PE公司电感耦合等离子体质谱仪(NexlON 350D)；美国Thermo公司电感耦合等离子发射光谱仪(ICAP6300)；奥地利安东帕公司超高压微波系统(Multiwave Pro)；德国Millipore公司超纯水机(Milli-Advantage A10)；硝酸(J.T.Baker，A.C.S.Reagent)；多元素标准溶液(100mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试GSB 04-2824-2011)，多元素标准溶液(100mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试GSB 04-1767-2004)。
实施例1
一种医用胶原蛋白海绵中金属污染物的检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密称取已经剪碎的胶原蛋白样品0.2g(精确至0.0001g)，置于聚四氟乙烯消解罐内，加硝酸10mL，混匀，浸泡过夜，盖上内盖，旋紧外套，置微波消解系统中，按如下消解程序消解：步骤1，功率1600W，120℃，升温时间5min，保持3s；步骤2，功率1600W，150℃，升温时间6min，保持2s；步骤3，功率1600W，180℃，升温时间6min，保持20s；
消解完毕后，取消解内罐置电加热器上，于120℃加热，至红棕色蒸汽挥尽并近干，用体积百分比为2％的硝酸转移至25mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，获得供试品溶液。
同法制备试剂空白溶液，作为空白校正。
(2)测定方法：用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对供试品溶液进行全质量数(6-15amu，19-39amu，42-210amu，230-240amu)扫描，选取有响应值的金属元素用ICP-MS和电感耦合等离子发射光谱法(ICP)进行定量分析。
其中，ICP-MS全质量数扫描的工作参数为：扫描模式：跳峰；工作模式：标准；载气流量：1.00mL/min；射频功率：1600.00W；辅助气流量：1.20mL/min；等离子气流量：18mL/min；扫描次数：12次；保留时间：50ms/AMU。
其中，ICP-MS定量分析的工作参数为：雾化器：同心雾化器；雾化室：玻璃旋流雾室；三锥材质：铂锥；等离子气流量：16.0L/min；辅助气流量：1.2L/min；雾化器流量：1.00–1.05L/min；样品进样速率：250μL/min；射频功率：1600W；积分时间：500–1500ms；样品重复次数：3；工作模式：标准、碰撞(使用氦气)、反应(使用氨气)；
不同工作模式的参数如表1所示：
表1.不同工作模式的参数
其中，ICP定量分析的工作参数为：泵速50rpm；RF频率：27.12MHz；RF功率1150W；辅助气0.5L/min；雾化器：玻璃同心雾化器，雾化室：旋流雾室。
ICP-MS全质量数扫描的金属元素包括Li、Be、B、Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Kr、Rb、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、Te、Xe、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、Tl、Pb、Bi、Th、U共69个元素，其中有响应值的金属元素19个，采用ICP-MS和ICP对其进行定量分析。
(a)ICP-MS定量分析条件及方法学参数确认：
配制相关金属元素的标准品溶液，采用ICP-MS定量分析条件绘制标准曲线，并计算相关方法学参数，结果如表2所示。
表2.ICP-MS定量分析条件及方法学参数
注：*1.混合内标45Sc、72Ge、103Rh、115In、159Tb：50μg/L。
*2.使用了ICP-MS(型号NexION 350D)提供的标准、碰撞(碰撞气体为氦气)和反应(反应气体为氨气)三种不同的工作模式。
*3.取1份已处理好的供试品溶液，连续进样11次，测定信号强度，计算11个结果的RSD值。
*4.精密称取同批次胶原蛋白0.2g 7份，按前述供试品溶液制备方法及ICP-MS实验条件进行含量测定，计算RSD值。
加标回收率测定：取胶原蛋白样品0.2g(精确至0.0001g)，准确加入1μg/mL的混合标准贮备液0.2mL和1.0mL，按前述供试品溶液制备方法及ICP-MS条件进行含量测定，结果如表3所示，样品的加标回收率为87.7％～107.4％。
表3.ICP-MS的加标回收率
标准物质的测定：本次试验用ICP-MS的方法测定了地球物理地球化学勘查研究所提供的生物成分标准物质GBW10051(GSB-29)猪肝标准品，此标准品在组织成分及金属元素种类与胶原蛋白类产品较为一致。取猪肝标准品于80℃烘干4h后，供试品溶液制备方法(Co、Cr、Ni称样量为1.0g，最终定溶于10mL，其余元素称样量0.2g，定溶于25mL，)以及ICP-MS定量分析条件与实际样品相同。定量结果如表4所示，实验测得的标准物质测定值均在标准范围内。
表4.生物成分标准物质GBW10051(GSB-29)猪肝标准品的测定结果
注：“±”后数据为不确定度，带括号的数值为参考值。
通过以上结果分析，证明所建定量分析方法可靠，对未知样品的测量准确。
(b)ICP定量分析条件及方法学参数确认
有响应值的部分金属元素采用ICP的定量分析方法，其原因是这些元素含量较高且质量数较低，在ICP-MS中存在较严重的干扰，对这些元素的检出限及线性来讲，ICP优于ICP-MS的测定结果。配制相关金属元素的标准品溶液，采用ICP定量分析条件绘制标准曲线，并计算相关方法学参数，结果如表5所示。
表5.ICP定量分析条件及方法学参数
*1.取1份已处理好的供试品溶液，连续进样11次，测定信号强度，计算11个结果的RSD值。
*2.精密称取同批次胶原蛋白0.2g 7份，按前述供试品溶液制备方法及ICP实验条件进行含量测定，计算RSD值。
标准物质的测定：本次试验用ICP的方法测定了地球物理地球化学勘查研究所提供的生物成分标准物质GBW10051(GSB-29)猪肝标准品，此标准品在组织成分及金属元素种类与胶原蛋白类产品较为一致。取猪肝标准品于80℃烘干4h后，供试品溶液制备方法及ICP定量分析条件与实际样品相同。定量结果如表6所示，实验测得的标准物质测定值均在标准范围内。
表6.生物成分标准物质GBW10051(GSB-29)猪肝标准品的测定结果
注：“±”后数据为不确定度，带括号的数值为参考值。
通过以上结果分析，证明所建定量分析方法可靠，对未知样品的测量准确。
实施例2
应用实施例1所述的检测方法，对9个不同生产厂家的医用胶原蛋白海绵中金属污染物进行检测，其中产品信息如表7所示。
表7.产品信息
测定了上述9个不同厂家的胶原蛋白样品，结果如表8-9所示：
表8.ICP-MS的样品测定结果
从上表中发现，样品中Fe元素含量在所有的检出元素中含量较高，为9.12mg/kg～203.7mg/kg，另外Cr及Ni含量也较高，这三种元素正好为不锈钢的主要成分。
表9.ICP的样品测定结果
从上表中发现，以上五个元素含量较高，基本上来源于生物体本身。但是因为在此类产品的生产工艺中用到了NaCl，但其后期的清洗及透析工艺执行不完全，则Na残留在样品中。
实施例3
应用实施例1所述的检测方法检测医用胶原蛋白海绵生产过程中金属污染物溶出控制风险点。
1)牛跟腱原料检测
收集了两家企业生产所用的3个批次的牛跟腱原料，去除包膜后用洗必泰杀菌清洗后，于105℃干燥去除水分。采用实施例1所述的检测方法测定Cr、Fe、Zn、Ba、Ni5个元素的含量，检测数据如表10所示。
表10.牛跟腱原料中金属元素含量(单位μg/g)
从上表中可以看出，除Zn的含量在5mg/kg左右外，其他四个元素几乎均未检出。由于5g牛跟腱最终能制成约1g胶原蛋白，故算上重量的折扣，牛跟腱中金属杂质不是造成成品胶原蛋白金属杂质含量较高的主要原因，并且，Zn元素是原料本身带入的。
2)牛跟腱冷冻切片后的原料检测
在医用胶原蛋白海绵的生产工艺中，牛跟腱清洗后，为方便后期加工，一般采用冷冻切片的处理方式，此环节会接触不锈钢切片机。取三个不同厂家牛跟腱原料冻干切片后的原料，于105℃干燥去除水分后，采用实施例1所述的检测方法测定其金属元素含量，检测数据如表11所示。
表11.三家牛跟腱原料冻干切片后的数据(单位μg/g)
从上表可以看出，三家牛跟腱切片后原料除Fe、Ni、Cr、Zn外，其他金属离子含量均较低。
3)胶原透析液和胶原溶解液检测
取上海其胜生物制剂有限公司在工艺生产线上关键生产点的半成品，胶原透析液和胶原溶解液，均呈凝胶状态，并用全玻璃容器小试加工医用胶原蛋白海绵，其外观与工业化生产产品一致。采用实施例1所述的检测方法测定样品中Cr、Fe、Zn、Ba、Ni5个元素的含量，检测数据如表12所示。
表12.关键工艺中各重金属含量(单位μg/g)
从上表可以看出，用玻璃小试生产的成品医用胶原蛋白海绵没有金属元素含量较高的现象，也从侧面证明了此类产品的金属污染物来自于不锈钢器皿的应用。胶原透析液和胶原溶解液的样品也没有检出高含量Cr、Fe及Ni等金属元素，由于胶原透析液和胶原溶解液水分含量很高，造成了大多数元素的检出限较高。
4)过滤离心-酸溶沉淀环节检测
在医用胶原蛋白海绵的生产中，过滤离心的工艺阶段用到不锈钢网兜作为胶原的过滤工具，并且此时的样品在下一工艺(提取阶段)用到了一定浓度的醋酸。将此工艺段的样品分为三种不同方式进行生产，分别为1.酸溶胶原不刮网兜，2.酸溶胶原狠刮网兜，3.玻璃瓶反应盐析酸溶。其中，玻璃瓶反应盐析酸溶是指用玻璃容器替代不锈钢容器，且过滤的环节也换成玻璃制品。后面工艺正常生产，加工为成品形式作为供试品测试，结果如表13所示。
表13.过滤离心-酸溶沉淀环节的金属元素数据(单位μg/g)
从上表中可以看出，玻璃瓶反应盐析酸溶的工艺下，金属元素的溶出远远小于其他两种工艺，可见在此阶段下，不锈钢仍为的Cr、Fe、Mn、Ni溶出的主要因素。酸溶胶原不刮网兜和酸溶胶原狠刮网兜两者均在不锈钢容器中进行，只存在过滤后刮不锈钢网兜的力度不同。比较两种方式，狠刮网兜的数值大大高于不刮网兜的数值，因此不锈钢网兜也是Cr、Fe、Mn、Ni溶出的重要因素。
5)不锈钢罐清洗环节检测
上海其胜生物制剂有限公司将其整个生产工艺中所用的不锈钢容器及工具等用专用清洗剂进行“红锈”的去除与不锈钢材料的钝化后，重新生产样品。采用实施例1所述的检测方法测定清洗前和清洗后生产的样品，结果如表14所示。
表14.清洗环节前后对比表(单位：μg/g)
从上表可以看出，增加清洗工艺后，产品中Fe等金属离子大大减少，可见在生产过程中产生的腐蚀是产品中金属离子含量较高的主要原因。
通过以上数据可以看出，在整个生产过程中，不锈钢反应釜及金属材质工具的腐蚀与溶出是此类产品金属元素较高的重要原因。根据污染来源的途径，从设计源头开始进行有效控制，采取措施预防并控制金属污染的发生，如定期清洗及更换部分不锈钢器具等办法。
实施例4
应用实施例1所述的检测方法结合实施例2检测的不同厂家胶原蛋白金属污染物含量，建立医用胶原蛋白海绵中金属污染物的安全评价标准。
1)As、Hg、Cd、Pb的数值统计及分析
在美国药典<232药品元素杂质限度>(USP232)及人用药品注册技术要求国际协调会质量文件<ICH-Q3D>中，元素砷、镉、汞和铅被列为必须检测的元素，且由于其独特的属性，这四种元素需要针对元素杂质的所有潜在来源以及所有的摄入途径在风险评估中进行评价。USP232及ICH-Q3D的杂质允许日暴露量(PDE)如表15所示(选取注射途径数值)，利用实施例1所述的检测方法对表6中不同厂家产品的实际检测数据见表16。
表15.As、Hg、Cd、Pb的PDE值(单位：μg/day)
注：以50kg体重计算的允许日暴露量
表16.As、Hg、Cd、Pb的含量及单包装量
所有样品中，规格型号各异，最小规格为40×60×4(mm)，最大规格为80×120×5(mm)，重量最小为0.13g/片，最大为1.0g/片。医用胶原蛋白海绵的使用量根据临床使用部位及产品规格大小而存在差异。一般根据出血情况将海绵剪切成创面大小或直接使用50×50规格的，2～3块压迫止血既可。因此，假定每日最大使用量为5g(为最小规格的38个单包装使用量)，则As、Hg、Cd、Pb的限度值如表17所示：
表17.胶原蛋白中As、Hg、Cd、Pb的PDE值(单位：μg/g)
在限度值的选择上，参照USP232和ICH-Q3D的数值，选取数值最小的作为限度值。对于砷和汞应特别关注，因为它们的无机态和络合有机态具有不同的毒性。
2)与摄入途径相关的有毒金属元素统计及分析
与摄入途径相关的人类有毒金属元素包括了USP232中的剩余11个元素及ICHQ3D中的II类元素(包括IIA3个元素及IIB10个元素)。这一类的元素包含了在产品中出现可能性相对较高元素，或自然含量较低、与其它物料共存可能性较低，但是在原料、辅料或生产中被有意加入可能性较高的元素，因而需要对这些元素杂质的潜在来源及所摄入途径进行风险评估。与摄入途径相关的有毒金属元素在USP232及ICH-Q3D的杂质允许日暴露量(PDE)如表18所示(选取注射途径数值)。
表18.与摄入途径相关的有毒金属元素的PDE值(单位：μg/day)
注：a为此途径下未进行安全关注
b为USP元素未有安全数值
利用实施例1所述的检测方法对表6中不同厂家产品的进行检测，在以上的16个元素中，Ir、Os、Pd、Pt、Rh、Ru、Mo、V、Tl、Au、Se、Ag所有样品的检测值均在检出限之下，其余4个元素的检测值及单包装含量统计值见表19。
表19.Cr、Co、Ni、Cu含量统计表(单位：μg/g)
同上所述，假定每日最大使用量为5g(为最小规格的38个单包装使用量)，则Cr、Co、Ni、Cu的限度值见表20：
表20.胶原蛋白中Cr、Co、Ni、Cu的PDE值(单位：μg/g)
从检测数值来看，所测试的9批样品均能满足胶原蛋白中Cr、Co、Cu的限度要求。但是有4批样品中的Ni不满足Ni元素的限度要求，占样品总量的44.44％，表明存在不良反应风险。
3)ICH-Q3D中的III类元素的统计及分析
在ICH-Q3D中，此类元素包含Li、Sb、Ba、Mo、Cu、Sn、Cr7个元素，这些元素在口服摄入时具有相对较低的毒性(高PDE，通常>500μg/day)，但可能在吸入和注射给药的风险评估中需要进行考虑。ICH-Q3D中的III类元素的杂质允许日暴露量(PDE)如表21所示。
表21.ICH-Q3D中的III类元素的PDE值(单位：μg/day)
利用实施例1所述的检测方法对表6中不同厂家产品的进行检测，在此7个元素中，Mo、Cu、Cr已经分析过了，其余4个元素的检测值及单包装含量统计值见表22。
表22.Li、Sb、Ba、Sn含量统计表(单位：μg/g)
同上所述，假定每日最大使用量为5g(为最小规格的38个单包装使用量)，则Li、Sb、Ba、Sn的限度值见表23：
表23.胶原蛋白中Li、Sb、Ba、Sn的PDE值(单位：μg/g)
从检测数值来看，所测试的9批样品均能满足胶原蛋白中Li、Sb、Ba、Sn的限度要求。
4)其他元素的数据统计及分析
除了上述的金属元素外，定量的还有Mn、Zn、Al、Ti、Fe5个元素。这几个元素在USP232及ICHQ3D均未有规定，可能是由于这些元素杂质较低的毒性和/或在地方法规中的要求不同，故PDE还没有建立。但ICH-Q3D认为此类元素毒性较低，通常PDE>500μg/day。利用实施例1所述的检测方法对表6中不同厂家产品的进行检测，具体结果见表24。
表24.Mn、Zn、Al、Ti、Fe含量统计表(单位：μg/g)
同上所述，假定每日最大使用量为5g(为最小规格的38个单包装使用量)，则Mn、Zn、Al、Ti、Fe的限度值也应大于100μg/g。
从表中可以看出Mn、Zn、Al、Ti的数值均较小，可满足安全限度要求。Fe的数值来看，三批进口产品数值在9.12～51.99μg/g之间，国内企业产品数值在102.38～203.70μg/g之间。已经废止的国家标准GB15200-1994食品中铁限量卫生标准对Fe的限量规定如表25所示：
表25.食品中Fe限量卫生指标
但是2010年，我国卫生部根据《食品安全法》和国务院办公厅《食品安全整顿工作方案》要求，开展了食品中污染物安全标准修订工作。经研究并参考国际食品法典标准，不再将锌、铜、铁作为污染物指标，并废止《食品中锌限量卫生标准》(GB13106-91)、《食品中铜限量卫生标准》(GB15199-94)、《食品中铁限量卫生标准》(GB15200-94)三项标准。
虽然此数值无法确定其是否对人体有害，但因其数值较大，应引起重视，探讨其引入来源。
从实施例3的论述中，Fe来自于生产过程中产生的腐蚀，反应容器材质的选择、生产过程中的清洗及过程的监控都能较好的减少产品中Fe元素的含量，在整个反应系统清洗后，Fe的数值可下降至34.88μg/g。
Fe元素的限量数值并非只在讨论对人体的安全性，还在于对正在生产过程中腐蚀的控制，因此建议将Fe元素的限量数值定为50μg/g。
5)医用胶原蛋白海绵中金属元素的可接受限量的确定
目前，国内外可查询到的相关服装、食品及胶原类的允许日暴露量(PDE)如表26所示：
表26.国内外金属元素限量汇总表
对于As、Cd、Pb、Hg四个元素来讲，根据USP232及ICH Q3D所得的限度值比较符合实际的情况。但是胶原类所能查到的两个行业标准将As的限度定为1μg/g，为了标准的统一性且此数值严于本研究中数值，故将的As的限度也定为1μg/g。
Co、Ni、Cu的限度值与其他标准相比，较为一致，保留其限度值不变。
Li、Sb、Ba的限度值在其他所有标准中未有体现，这三个元素属于毒性较低的元素且研究中发现所有样品中含量较低，远远低于控制标准，因此在最终的控制标准中可将其去掉。
Sn元素结合研究中所得数值及食品中的限量情况，将其数值调整为50μg/g。
Fe与Cr两个元素在毒理学方面来讲，毒性并不大，但是这两个元素是生产过程中，不锈钢器皿腐蚀带来样品污染的主要体现元素。因此为了督促生产企业更好的控制生产过程，在限度中一定要予以体现，结合研究中所得到的样品结果，Fe定为50μg/g，Cr定为10μg/g。
综上，医用胶原蛋白海绵中主要金属污染物的安全评价标准如表27所示。
表27.胶原蛋白中金属元素限量表(单位μg/g)