一种胶乳增强免疫比浊检测试剂盒及其制备和检测方法与流程

本发明涉及体外诊断试剂领域，特别涉及一种胶乳增强免疫比浊检测试剂盒及其制备和检测方法。
背景技术：
：目前，临床上检测维生素d等有机小分子的方法主要有化学发光法、液相色谱-质谱法、放射免疫法、酶联免疫法及克隆酶供体免疫检测法。化学发光法灵敏度高，但需要特定的化学发光仪，检测成本高；酶联免疫法费时长，成本高；质谱法用时较长且操作复杂；放射免疫法有环保问题；克隆酶供体免疫检测法的试剂稳定性差。胶乳颗粒增强免疫比浊法是通过测量透过悬浊液的吸光度变化从而测定被检测标志物浓度的方法。与上述检测方法相比，该方法具有灵敏度高、稳定好等特点，因此，该方法被广泛用于特种蛋白、肿瘤标志物等体外诊断试剂的研发中。但由于多数有机小分子标志物只有一个抗体结合点，很难与共价偶联在微球上的抗体结合形成网状结构的聚合物，并改变反应体的吸光度。因此，胶乳颗粒增强免疫比浊法在检测维生素d等有机小分子标志物领域受到极大限制。技术实现要素：本发明的主要目的在于，针对临床上维生素d等有机小分子检测灵敏度低、费时长、操作复杂、成本高等问题，提供一种用于检测维生素d等有机小分子的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，该试剂盒具有检测灵敏度高、检测迅速、操作简单等特点，且扩展了胶乳增强免疫比浊法在有机小分子检测试剂中的应用，具有良好的实用价值。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，用于有机小分子的检测，包括试剂r1和试剂r2；所述试剂r1包括电解质、缓冲液、促进剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、与含有马来酰亚胺基团的有机小分子α共价偶联的生物大分子或与含有游离氨基的有机小分子α共价偶联的合成高分子，所述试剂r2包括电解质、缓冲液、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、与有机小分子α抗体偶联的胶乳微球；其中，所述生物大分子为牛血清白蛋白或明胶，所述合成高分子为含有游离氨基的聚合物或游离羧基的聚合物，且所述生物大分子和合成高分子的分子量为2～300kd，如10kd、60kd、110kd、180kd、230kd、290kd中任一数值；所述有机小分子α的分子量在2kd以下，如0.2kd、0.9kd、1.3kd、1.8kd中任一数值；所述胶乳微球直径为50～450nm，如100nm、160nm、250nm、380nm中任一数值。优选地，所述有机小分子α为25-羟基维生素d3、地高辛、雌二醇，三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素、维生素b12或叶酸。优选地，所述试剂r1包括下列重量百分比的成分：0.1～5.0％电解质(如0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％中任一数值)、0.01～3.0％促进剂(如0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％中任一数值)、0.01～0.5％防腐剂(如0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.45％中任一数值)、0.1～0.5％稳定剂(如0.15％、0.23％、0.3％、0.37％、0.46％中任一数值)、0.01～1.0％表面活性剂(如0.02％、0.05％、0.07％、0.09％中任一数值)、10～100mm缓冲液(如29mm、55mm、76mm、87mm、95mm中任一数值)和0.5～1.5μm(如0.7μm、0.9μm、1.1μm、1.3μm、1.4μm中任一数值)与含有马来酰亚胺基团的有机小分子α共价偶联的生物大分子或与含有游离氨基的有机小分子α共价偶联的合成高分子；所述试剂r2包括下列重量百分比的成分：0.5～5.0％电解质(如1.2％、2.3％、3.1％、3.9％、4.6％中任一数值)、0.01～0.5％防腐剂(如0.09％、1.4％、2.1％、3.7％、5.3％中任一数值)、0.05～6.0％稳定剂(如1.2％、2.5％、3.1％、4.3％、5.6％中任一数值)、0.01～1.0％表面活性剂(如0.02％、0.05％、0.06％、0.08％、0.09％中任一数值)、0.08～0.6％与有机小分子α抗体偶联的胶乳微球(如0.15％、0.24％、0.35％、0.47％、0.56％中任一数值)和10～100mm缓冲液(如26mm、42mm、67mm、83mm、94mm中任一数值)。优选地，所述检测试剂盒还包括校准品，所述校准品包括有机小分子α标志物、电解质、牛血清白蛋白或明胶、防腐剂和缓冲液。优选地，所述胶乳微球由苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯中的一种或多种聚合而成。优选地，所述促进剂选自分子量为2～300kd的聚乙二醇中的一种或几种，如分子量为80kd、120kd、180kd、230kd、280kd中任一数值。优选地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。优选地，所述电解质为镁离子、钙离子、钾离子及钠离子中的一种或几种。优选地，所述缓冲液选自tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、mes缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种或几种。优选地，所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、苯甲酸中的一种或几种。优选地，所述稳定剂选自牛血清白蛋白、明胶、乳糖、蔗糖中的一种或几种，上述各组分在试剂r2中的质量百分比依次为0.1～5.0％(如0.8％、1.5％、2.1％、3.6％、4.3％中任一数值)、0.1～1.0％(如0.2％、0.4％、0.5％、0.7％、0.9％中任一数值)、1.0～20.0％(如4.2％、8.8％、12.1％、15.7％、18.5％中任一数值)、1.0～20.0％(如4.2％、8.8％、12.1％、15.7％、18.5％中任一数值)。本发明还提出一种制备所述胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的方法，包括如下步骤：(1)与有机小分子α标志物共价偶联的生物大分子的制备：向ph＝7.2～7.6的缓冲液中加入0.05～1.05mmol的生物大分子，搅拌均匀，得溶液a；将溶液a滴加到1.5～2.5mmol的含有马来酰亚胺基团的有机小分子α标志物中；室温搅拌1～4h后，用脱盐柱除去过量的有机小分子α标志物，得到纯化的与有机小分子α标志物共价偶联的生物大分子；其中，所述生物大分子为牛血清白蛋白或明胶，所述生物大分子的分子量为2～300kd，如10kd、60kd、110kd、180kd、230kd、290kd中任一数值；所述有机小分子α的分子量在2kd以下，如0.2kd、0.9kd、1.3kd、1.8kd中任一数值；或与有机小分子α标志物共价偶联的合成高分子的制备：将合成高分子、n-羟基马来酰亚胺和二甲基甲酰胺加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中，室温搅拌0.5～1.5h后，加入含有游离氨基的有机小分子α标志物，室温反应1～4h后，用乙醚洗涤2～4次，得到纯化的与有机小分子α标志物共价偶联的合成高分子；其中，所述合成高分子为含有游离氨基的聚合物或游离羧基的聚合物，且所述合成高分子的分子量为2～300kd，如10kd、60kd、110kd、180kd、230kd、290kd中任一数值；所述有机小分子α的分子量在2kd以下，如0.2kd、0.9kd、1.3kd、1.8kd中任一数值；(2)试剂r1的制备：将电解质、防腐剂、缓冲液、稳定剂、表面活性剂、促进剂加入装有超纯水的容器中，常温搅拌至固体完全溶解后，将ph调至6.5～8.5，并加入与有机小分子α标志物共价偶联的生物大分子或合成高分子，混合均匀，即得试剂r1；(3)试剂r2的制备：将有机小分子α抗体的缓冲溶液ph调至7.0～7.5后，用zeba脱盐柱或透析的方法纯化，得缓冲液ⅰ；将表面带有羧基的胶乳微球悬浊液用ph＝5.7～6.2的缓冲液ⅰ稀释至浓度为8～12mg/ml，加入n-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下反应0.5～1h后，15000～20000rpm离心15～25min，去上清液，向沉淀中加入ph＝7.0～7.5的缓冲液ⅰ，超声分散，得到活化的胶乳微球悬浊液；向活化的胶乳微球悬浊液中加入有机小分子α抗体溶液，室温下反应2～4h后，加入甘氨酸溶液终止反应，离心去掉上清后清洗2～4次，用稳定剂、表面活性剂、电解质和防腐剂的混合储存液悬浮胶乳微球，超声分散，获得含有与有机小分子α抗体偶联的胶乳微球的试剂r2，其中，所述胶乳微球直径为50～450nm，如100nm、160nm、250nm、380nm中任一数值。优选地，所述有机小分子α为25-羟基维生素d3、地高辛、雌二醇，三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素、维生素b12或叶酸。优选地，所述检测试剂盒的制备方法，还包括校准品的制备，所述校准品制备包括如下步骤：按照校准品所需浓度，依次将不同量的含有有机小分子α标志物的血清加入到含有牛血清白蛋白或明胶、电解质及防腐剂的、ph＝6.5～8.5的缓冲液ⅰ中，过滤除菌，制得浓度梯度可在10～140ng/ml内有规律或无规律的变化，且浓度依次递增的有机小分子α标志物校准品，其中，最佳浓度梯度为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、140ng/ml。优选地，所述试剂r1包括下列重量百分比的成分：0.1～5.0％电解质(如0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％中任一数值)、0.01～3.0％促进剂(如0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％中任一数值)、0.01～0.5％防腐剂(如0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.45％中任一数值)、0.1～0.5％稳定剂(如0.15％、0.23％、0.3％、0.37％、0.46％中任一数值)、0.01～1.0％表面活性剂(如0.02％、0.05％、0.07％、0.09％中任一数值)、10～100mm缓冲液(如29mm、55mm、76mm、87mm、95mm中任一数值)和0.5～1.5μm(如0.7μm、0.9μm、1.1μm、1.3μm、1.4μm中任一数值)与含有马来酰亚胺基团的有机小分子α共价偶联的生物大分子或与含有游离氨基的有机小分子α共价偶联的合成高分子；所述试剂r2包括下列重量百分比的成分：0.5～5.0％电解质(如1.2％、2.3％、3.1％、3.9％、4.6％中任一数值)、0.01～0.5％防腐剂(如0.09％、1.4％、2.1％、3.7％、5.3％中任一数值)、0.05～6.0％稳定剂(如1.2％、2.5％、3.1％、4.3％、5.6％中任一数值)、0.01～1.0％表面活性剂(如0.02％、0.05％、0.06％、0.08％、0.09％中任一数值)、0.08～0.6％与有机小分子α抗体偶联的胶乳微球(如0.15％、0.24％、0.35％、0.47％、0.56％中任一数值)和10～100mm缓冲液(如26mm、42mm、67mm、83mm、94mm中任一数值)。优选地，所述胶乳微球由苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯中的一种或多种聚合而成。优选地，所述促进剂选自分子量为2～300kd的聚乙二醇中的一种或几种，如分子量为80kd、120kd、180kd、230kd、280kd中任一数值。优选地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。优选地，所述电解质为镁离子、钙离子、钾离子及钠离子中的一种或几种。优选地，所述缓冲液选自tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、mes缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸盐缓冲液中的一种或几种。优选地，所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素、苯甲酸中的一种或几种。优选地，所述稳定剂选自牛血清白蛋白、明胶、乳糖、蔗糖中的一种或几种，上述各组分在试剂r2中的质量百分比依次为0.1～5.0％(如0.8％、1.5％、2.1％、3.6％、4.3％中任一数值)、0.1～1.0％(如0.2％、0.4％、0.5％、0.7％、0.9％中任一数值)、1.0～20.0％(如4.2％、8.8％、12.1％、15.7％、18.5％中任一数值)、1.0～20.0％(如4.2％、8.8％、12.1％、15.7％、18.5％中任一数值)。本发明还提出一种采用所述胶乳增强免疫比浊检测试剂盒检测有机小分子的方法，包括如下步骤：步骤s1：设置检测波长为主波长600nm，副波长800nm；量取150～200ul试剂r1与5～10ul样本混匀，35～40℃孵育2～5min后，加入35～45ul试剂r2反应25～35s，读取第一个吸光度a1，继续反应3～7min，读取第二个吸光度a2；用公式△od600＝a2-a1计算△od600值，获取△od600对应的有机小分子α浓度；其中，所述试剂r1包括电解质、缓冲液、促进剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、与含有马来酰亚胺基团的有机小分子α共价偶联的生物大分子或与含有游离氨基的有机小分子α共价偶联的合成高分子，所述试剂r2包括电解质、缓冲液、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、与有机小分子α抗体偶联的胶乳微球；其中，所述生物大分子为牛血清白蛋白或明胶，所述合成高分子为含有游离氨基的聚合物或游离羧基的聚合物，且所述生物大分子和合成高分子的分子量为2～300kd，如10kd、60kd、110kd、180kd、230kd、290kd中任一数值；所述有机小分子α的分子量在2kd以下，如0.2kd、0.9kd、1.3kd、1.8kd中任一数值；所述胶乳微球直径为50～450nm，如100nm、160nm、250nm、380nm中任一数值。优选地，所述检测方法还包括标准曲线的建立步骤s0，且所述步骤s0可在步骤s1之前，也可在步骤s1之后，优选地，所述步骤s0在步骤s1之前，具体为：步骤s0：设置检测波长为主波长600nm，副波长800nm；量取150～200ul试剂r1与5～10ul校准品混匀，35～40℃孵育2～5min后，加入35～45ul试剂r2反应25～35s，读取第一个吸光度a1，继续反应3～7min，读取第二个吸光度a2；用公式△od600＝a2-a1计算△od600值，以校准品浓度为x轴，对应的△od600值为y轴，得到校准曲线；其中，所述校准品包括有机小分子α标志物、电解质、牛血清白蛋白或明胶、防腐剂和缓冲液。本发明具有以下有益效果：本发明技术方案通过将有机小分子与生物大分子或合成高分子结合，利用样本中的有机小分子抗原与结合在生物大分子或合成高分子上的抗原竞争结合试剂r2中的微球表面的抗体，形成网状结合物，使反应体系的浊度下降，从而可通过测量透过悬浊液的吸光度变化测定被检测标志物的浓度，使有机小分子的检测更为方便，容易在临床中应用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。图1为本发明检测试剂盒中有机小分子与生物大分子偶联的化学反应式，其中，r表示牛血清白蛋白，明胶等生物大分子；r1表示维生素d、地高辛、叶酸、维生素b12等有机小分子化合物基团；r2表示-ch2(ch2)n-，n＝1-20；图2为本发明检测试剂盒中有机小分子与合成大分子偶联的化学反应式其中，r1表示维生素d、地高辛、叶酸、维生素b12等有机小分子化合物基团；r2表示-ch2(ch2)n-，n＝1-20；图3为本发明检测试剂盒实施例的校准曲线，每个点代表不同含量的25-羟基维生素d3参考标准，其中x轴表示25-羟基维生素d3的浓度，y轴表示吸光度；图4为本发明检测试剂盒实施例的线性范围验证示意图；其中x轴表示稀释理论浓度，y轴表示本发明试剂盒实际测试结果的平均值，相关系数为r2＝0.9993，回归方程为y＝1.001x-0.5517；图5为本发明试剂盒与市场上已有的cedia法试剂的相关性示意图；其中x轴表示cedia法测定的病人血清结果，y轴表示本发明试剂盒测定的病人血清结果，相关系数r2＝0.998，回归方程为y＝0.993x-0.6814。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。实施例1本发明所述胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的制备方法，以维生素d为例，包括如下步骤：(1)与维生素d标志物共价偶联的生物大分子的制备：向100mm、ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中加入0.1mmol的牛血清白蛋白，搅拌均匀，得溶液a；将溶液a滴加到2mmol的含有马来酰亚胺基团的维生素d标志物中；室温搅拌2h后，用脱盐柱除去过量的维生素d标志物，得到纯化的与维生素d标志物共价偶联的生物大分子；(2)试剂r1的制备：将nacl、tris、质量百分数为0.05％叠氮化钠、0.2％牛血清白蛋白、0.05％triton100和0.8％聚乙二醇8000加入装有800ml超纯水的容器中，使溶液中nacl浓度为100mm，tris浓度为50mm，常温搅拌至固体完全溶解后，将ph调至7.0，并加入与25-羟基维生素d3共价偶联的牛血清白蛋白，最后定容至1l并混合均匀，即试剂r1；(3)试剂r2的制备：将25-羟基维生素d3抗体的缓冲溶液用zeba脱盐柱或透析的方法交换为50mm的磷酸盐缓冲液，并将ph调至7.3；将表面带有羧基、直径为300nm的胶乳微球悬浊液用50mm、ph＝6.0的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10mg/ml，加入n-羟基丁二酰亚胺，使n-羟基丁二酰亚胺在反应体系中的浓度达到1mg/ml，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，使1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在反应体系中的浓度达到0.3mg/ml，室温下反应1h后，17000rpm离心20min，去上清液，向沉淀中加入50mm、ph＝7.3的磷酸盐缓冲液，超声分散，得到活化的胶乳微球悬浊液；向活化的胶乳微球悬浊液中加入25-羟基维生素d3抗体溶液，室温下反应3h后，加入ph＝7.0-11.0的甘氨酸溶液终止反应，离心去掉上清后清洗3次，加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、nacl、0.5％牛血清白蛋白、0.1％tween20和0.1％叠氮化钠悬浮胶乳，使溶液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为50mm，nacl浓度为20mm，超声分散，获得含有与25-羟基维生素d3抗体偶联的胶乳微球的试剂r2；其中，所述胶乳微球直径为50～450nm；(4)校准品的制备：按照校准品所需浓度，向20mm、ph＝7.5的磷酸盐缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白、0.9％的nacl和0.1％叠氮化钠，混合均匀后，向其中加入不同量的含有25-羟基维生素d3的血清，过滤除菌，制得浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、140ng/ml的25-羟基维生素d3校准品。实施例2本发明所述胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的制备方法，以维生素d为例，包括如下步骤：(1)与维生素d标志物共价偶联的合成高分子的制备：将0.1mmol合成高分子、2mmoln-羟基马来酰亚胺和1ml二甲基甲酰胺加入2mmol1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中，室温搅拌1h后，加入带有游离氨基的维生素d标志物，室温反应3h后，用乙醚洗涤3次，得到纯化的与维生素d共价偶联的合成大分子；其中，所述合成高分子为含有游离氨基的聚合物或游离羧基的聚合物，且所述合成高分子的分子量为2～300kd，所述有机小分子α的分子量在2kd以下；(2)试剂r1的制备：将nacl、tris、质量百分数为0.05％叠氮化钠、0.2％牛血清白蛋白、0.05％tritonx-100、0.8％聚乙二醇8000、加入装有800ml超纯水的容器中，使溶液中nacl浓度为100mm，tris浓度为50mm，常温搅拌至固体完全溶解后，将ph调至7.0，并加入与25-羟基维生素d3共价偶联的合成大分子，最后定容至1l并混合均匀，即试剂r1；(3)试剂r2的制备：将25-羟基维生素d3抗体的缓冲溶液用zeba脱盐柱或透析的方法交换为50mm的磷酸盐缓冲液，并将ph调至7.3；将表面带有羧基、直径为300nm的胶乳微球悬浊液用50mm、ph＝6.0的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为10mg/ml，加入n-羟基丁二酰亚胺，使n-羟基丁二酰亚胺在反应体系中的浓度达到1mg/ml，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，使1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在反应体系中的浓度达到0.3mg/ml，室温下反应1h后，17000rpm离心20min,去上清液，向沉淀中加入50mm、ph＝7.3的磷酸盐缓冲液，超声分散，得到活化的胶乳微球悬浊液；向活化的胶乳微球悬浊液中加入25-羟基维生素d3抗体溶液，室温下反应3h后，加入ph＝8.0的甘氨酸溶液终止反应，离心去掉上清后清洗3次，加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、nacl、0.5％牛血清白蛋白、0.1％tween20和0.1％叠氮化钠的混合储存液悬浮胶乳，使溶液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为50mm，nacl浓度为20mm，超声分散，获得含有与25-羟基维生素d3抗体偶联的胶乳微球的试剂r2；其中，所述胶乳微球直径为50～450nm；(4)校准品的制备：按照校准品所需浓度，向20mm、ph＝7.5的磷酸盐缓冲液中加入0.5％的牛血清白蛋白、0.9％的nacl和0.1％叠氮化钠，混合均匀后，向其中加入不同量的含有25-羟基维生素d3的血清，过滤除菌，制得浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、140ng/ml的25-羟基维生素d3校准品。实施例325-羟基维生素d3的检测方法及校准曲线。本发明使用两点终点法检测25-羟基维生素d3，检测波长为主波长600nm，副波长800nm，试剂r1用量为180ul，试剂r2用量为40ul，校准品用量为8ul。将试剂r1与校准品混匀，37℃孵育3min后，加入试剂r2反应30s，读取第一个吸光度a1后，继续反应5min，读取第二个吸光度a2，计算△od600值，公式为△od600＝a2-a1，结果见表1。以校准品浓度为x轴，对应的△od600值为y轴，得到校准曲线，参阅附图3。表125-羟基维生素d3△od600值浓度(ng/ml)od6000.00.685410.00.658820.00.611640.00.490880.00.2568140.00.1686实施例425-羟基维生素d3检测试剂的线性实验。线性实验各浓度样本的制备方法：选取10ng/ml低浓度样本和140ng/ml高浓度样本，按下表2所列不同比例混合，以配制线性实验所需的不同浓度的样本，并用生理盐水作为对照，共10个不同浓度的样本用于线性实验。每浓度重复测定3次，求平均值。测试方法为：设置检测波长为主波长600nm，副波长800nm；量取180ul试剂r1与8ul样本混匀，37℃孵育3min后，加入40ul试剂r2反应30s，读取第一个吸光度a1，继续反应5min，读取第二个吸光度a2；用公式△od600＝a2-a1计算△od600值，既得样品中有机小分子浓度。实验结果如表3所示。将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为y＝1.001x－0.5517，相关系数为r2＝0.9993，表明本发明试剂盒在10ng/ml～140ng/ml线性范围内相关性较好，请查阅附图4。表2线性实验样本的制备表3线性实验结果(单位：ng/ml)实施例5本发明25-羟基维生素d3检测试剂与市场cedia法液态稳定的25-羟基维生素d3试剂的相关性本发明25-羟基维生素d3检测试剂与从市场上购买的cedia法液态稳定的25-羟基维生素d3试剂在日立3100全自动生化分析仪上按照各自设定的参数，对30份新鲜人血清进行检测，结果如表4所示。对测定值进行回归分析，结果请查阅附图5，两种试剂的相关系数为r2＝0.998，回归方程为y＝0.993x-0.6814。结果表明，本发明的试剂盒与市场上cedia法试剂测定病人血清相关性良好。此外，以上实验是采用日立公司制造的3100全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。表425-羟基维生素d3胶乳增强免疫比浊试剂与市场cedia试剂的相关性以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书所作的等效变化或替换，或直接/间接运用在其他相关的
技术领域：
均包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12