偶联丙酮酸氧化酶测定同型半胱氨酸（Hcy）的方法及测定试剂盒与流程

本发明属于检验医学领域，是一种测定同型半胱氨酸的方法及测定试剂盒。

背景技术：

同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，为蛋氨酸代谢过程中重要中间产物。同型半胱氨酸的检测，在临床上的应用主要作为心血管疾病，尤其是冠状动脉粥样硬化和心肌梗塞的重要指标，它的浓度升高程度与疾病的危险性成正比。同型半胱氨酸血症与心血管疾病性密切相关，浓度升高损伤冠状动脉及其它血管最终引起动脉粥样硬化及其他心血管疾病。维生素b6、b12及叶酸，通过参与同型半胱氨酸代谢，起调节与减少同型半胱氨酸的作用，由此降低心血管疾病的危险性。同型半胱氨酸是脑血管病的独立危险因素，多由吸烟喝酒引起。

目前测定同型半胱氨酸的方法很多，有高效液相色谱法、荧光标记法、酶联免疫法、酶比色法等等，在常规实验室使用最多的是酶比色法。由于同型半胱氨酸在人体内含量很低，以前在常规实验室使用的方法灵敏度不高，近年来又发明了循环酶法。而循环酶法又分紫外法和trinder法。

紫外法，如专利201410190202.7中，应用胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶，利用反应过程中产生的丙酮酸，偶联乳酸脱氢酶，使还原型辅酶ⅰ生成氧化型辅酶ⅰ，在340nm波长下，通过测定吸光度的下降速率求得同型半胱氨酸的含量。专利200610041372.4中，应用胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶，利用反应过程中产生的丙酮酸和氨，偶联乳酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶，使还原型辅酶ⅰ生成氧化型辅酶ⅰ，在340nm波长下，通过测定吸光度的下降速率求得同型半胱氨酸的含量。另外，还有用同型半胱氨酸甲基转移酶、s-腺苷同型半胱氨酸水解酶，偶联谷氨酸脱氢酶测定反应过程中产生的氨，使还原型辅酶ⅰ生成氧化型辅酶ⅰ。

trinder法，如专利201410195083.4中，应用同型半胱氨酸甲基转移酶、s-腺苷同型半胱氨酸水解酶，偶联腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶和过氧化物酶，进行trinder反应。

技术实现要素：

本发明提供一种偶联丙酮酸氧化酶，利用trinder反应显色的同型半胱氨酸循环酶法，以及用该方法配制的同型半胱氨酸测定试剂盒。具体技术方案如下：

试剂一中，用丙酮酸氧化酶和过氧化物酶氧化分解掉样本中原有的丙酮酸，同时氧化型同型半胱氨酸被还原成游离型，加入试剂二后，试剂二中的胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶开始反应，反应式如下：

反应的第二步产生的同型半胱氨酸又回到第一步参与反应，形成一个循环，起到放大作用，可提高灵敏度，降低变异系数，重复性好，试剂稳定。trinder法本身比紫外法灵敏，紫外法的显色剂是用还原性辅酶ⅰ，因为还原性辅酶ⅰ容易氧化，所以试剂的稳定性就比较差。

试剂结构：

试剂一：

试剂二：

所述试剂一与试剂二的比可为1/1到8/1。

按试剂的组成，可配成试剂一∶试剂二＝1～8︰1不同的浓度比，优选试剂一∶试剂二＝2～4︰1。样品∶试剂＝1∶50～150，优选为1︰100。

缓冲液为甘氨酸盐、磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、4-羟乙基哌嗪丙磺酸等中的一种或两种。优选用三羟甲基氨基甲烷，用量为20～120mmol/l。试剂一、试剂二的缓冲液ph均为6.0～8.0。

防腐剂为叠氮化钠、proclin-300、对羟基苯甲酸及酯类等中的一种或多种，但是，以叠氮化钠为优选，对反应体系没有什么影响，价格也低。

稳定剂为小牛血清蛋白，氨基酸类，糖类，多元醇类等，可以单用，也可以两种或多种以上联用，首选小牛血清蛋白。黄素腺嘌呤二核苷酸，糖类可选用甘露醇，海藻糖，多元醇可选用乙二醇，peg6000等。

反应体系中可适当加入表面活性剂，能加速反应，增加酶的稳定性，包括吐温类，聚氧乙烯醚类等非离子表面活性剂，特别优选的是聚氧乙烯醚类，使用范围在0.5～10ml/l，最佳选用0.5～1.5ml/l。

酶激活剂为ca2+或mg2+。用量在0.05～10mmol/l，

显色剂为4-氨基安替比林，苯酚类、苯胺类。苯酚类包括：苯酚、2，4-二氯酚、4-氯酚、对羟基苯甲酸、三溴羟基苯甲酸、3、5-二氯-2-羟基苯磺酸钠等，检测波长在500～520nm；苯胺类包括：n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、n-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐、n-乙基-n-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺、n-乙基-n-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐等等，很多，就不多叙述了。检测波长在540～600nm之间，灵敏度比苯酚类的高，因此，优选使用苯胺类显色剂。是目前生化检测试剂中常用的。使用不同的显色剂就有相对应的波长。

还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、二硫赤鲜糖醇、β-巯基乙醇等中的一种或多种，用量在0.10～1.00mmol/l，优选用0.40～0.6mmol/l。

附图说明

图1为本发明检测试剂盒检测结果线性图；

图2为本发明检测试剂盒与外购同型半胱氨酸测定试剂盒检测临床对比图。

具体实施方式

实施例一

试剂一：

试剂二：

toos：n-乙基-n-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺

试剂一︰试剂二为2︰1,速率法，正反应，波长：546nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为3.0︰180︰90，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，延迟1分钟，检测2分钟的吸光度变化率。

实施例二

试剂一

试剂二：

试剂一︰试剂二为3︰1,速率法，正反应，波长：510nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为2.8︰210︰70，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，延迟1分钟，检测2分钟的吸光度变化率。

实施例三

试剂一：

试剂二：

adps:n-乙基-n-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠

试剂一︰试剂二为4︰1,速率法，正反应，波长：546nm，被测样品︰试剂一︰试剂二为2.6︰240︰60，温度37℃，血清与试剂一反应5分钟，加入试剂二，延迟1分钟，检测2分钟的吸光度变化率。

以实施例三为例，检测数据如下：

检测试剂盒线性结果为

线性方程：y＝0.975x+0.613，r²＝0.999。见说明书附图1。

检测外购质控品(8.7～12.2～15.7mmol/l)，重复检测20次，结果如下：

sd＝0.1598，cv＝1.323％。

用该检测试剂盒(trinder法)与外购同型半胱氨酸测定试剂盒(紫外法)检测50份临床血清做对比试验，对比试验结果如下：

50例临床样本的对比试验

两种方法所得的结果相关性良好，r²＝0.999。见说明书附图2。

稳定性检测：检测外购质控品(7.8～12.2～15.7μmol/l)，每月标准品、质控品重新复溶，试剂重新开瓶进行检测一次，每次重复检测10次，求均值，共13个月。结果如下：

质控品定值为：1.68～2.10～2.52mmol/l，根据国家规定，企业制定的试剂有效期为12个月，应在超过有效期一个月内仍稳定，才符合要求。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。